水苏糖及其代谢产物的高效液相色谱-蒸发光散射法检测方法

水苏糖是一种功能性低聚糖,可作为碳源促进乳酸菌增殖,是颇具应用前景的低聚糖类益生元[1-2]。但水苏糖在乳酸菌中的代谢途径尚未被完全解析,因此,本研究尝试建立一种水苏糖及其代谢产物含量测定的HPLC方法,通过水苏糖及其代谢产物含量的动态变化为阐释水苏糖在乳酸菌中的代谢途径提供技术支撑。目前糖类测定的方法主要是HPLC[3-7],且其检测主要与液相色谱仪中配备的检测器相关。糖类物质测定的检测器主要有紫外检测器、示差检测器和蒸发光检测器(evaporative light scattering detector, ELSD)[8-9]。由于糖类物质结构中无发色基团[10],使用紫外检测器、示差检测器检测时,常需对糖类物质进行衍生化等前处理,操作过程复杂,且重现性差[11]。而ELSD检测时,无需对糖类进行衍生前处理,且检测结果灵敏度高[12],故被广泛关注。BEPARY等[13]使用HPLC-ELSD方法有效分离测定了米豆中的水苏糖等多种糖类物质;陈泽麟等[14]利用HPLC-ELSD同时测定了丹参、川芎嗪注射液中间体中的水苏糖和棉子糖等物质;ZHANG等[15]利用HPLC-ELSD测定了桔梗中水苏糖及棉子糖等多种糖类物质。为了实验的简便性,同时为减少相对误差,应探索能在同一设备同时完成水苏糖及其代谢产物检测的方法,而HPLC-ELSD法能否同时分析测定水苏糖及其代谢产物,目前尚未见相关报道。综上,本研究拟建立一种操作简便、重现性和稳定性较好的检测水苏糖及其代谢产物含量的HPLC-ELSD方法,以期为阐释水苏糖在乳酸菌中的代谢途径提供技术支持,对揭示益生元及益生菌的互作具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水苏糖、棉籽糖及蜜二糖标准品,上海源叶生物科技公司;蔗糖、半乳糖、果糖标及葡萄糖标准品(纯度均≥98.0%),美国Sigma-Aldrich公司;乙腈(色谱纯),天津赛孚瑞科技有限公司;氨水、Tween-80,广州化学试剂厂;浓硫酸,佛山惠欣化学品公司;苯酚,天津市永大化学公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity蒸发光散射检测器、HPLC 1260-Ⅱ Infinity,美国安捷伦公司;循环水式真空泵、微孔过滤膜(有机系)0.45 μm,天津市津腾实验设备有限公司;Waters BEH XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),沃特世(Waters)公司;ME104型电子分析天平,梅特勒-托利多精密仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件的优化

1.3.1.1 ELSD载气流速的优化

载气流速为1.0～2.0 mL/min,以0.2 mL/min为单位间隔取6个载气流速,比较不同载气流速对信号值和信噪音比的影响。

1.3.1.2 ELSD漂移管温度的优化

漂移管温度范围为50～75 ℃,以5 ℃为点位间隔取6个温度,对比不同漂移管温度对信号值和信噪比的影响。

1.3.1.3 流动相比例对分离度的影响

固定流动相流速为1.0 mL/min,ELSD载气流速为1.2 mL/min,漂移管温度50 ℃,改变流动相(乙腈∶水)的体积比,比较不同比例流动相对样品分离度的影响。

1.3.1.4 流动相流速的优化

流动相流速为0.6～1.0 mL/min,以0.1 mL/min单位间隔取5个流速,对比不同流速对组分保留时间的影响。

1.3.2 方法学评价

1.3.2.1 加标回收率试验

制备含量依次为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg的各个糖加标样品溶液。在最佳色谱条件下检测,实验重复测定3次,计算各种糖的回收量、回收率、平均回收及相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)。

1.3.2.2 定量限和检出限计算方法

参照TEIXEIRA等[16]的方法,定量限和检出限分别按照信噪比S/N=10∶1、S/N=3∶1进行计算,建立检测回归方程。

1.3.2.3 精密度评价

参照王梦等[17]的方法将配置的标准溶液平均分成6份,以最优色谱条件测定并计算各个糖类组分峰面积的RSD。

1.4 数据分析处理

实验数据采用SPSS 26软件进行统计分析,结果以平均值±标准偏差表示,数据图表采用Origin 2022软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 ELSD参数优化

2.1.1.1 载气流速的优化

ELSD中载气流速的变化影响待测组分在雾化过程中形成雾状颗粒的大小,从而影响待测组分在ELSD中的响应[18]。为优化载气流速对待测组分的信号值和信噪比的影响,保证其余条件不变,对比不同载气流速对组分在检测器中信号值和信噪比的影响,设置漂移管温度为60 ℃,探究ELSD载气流速对7种糖类组分在ELSD检测器上信号值及信噪比的影响。如图1-A所示,随载气流速升高,糖类组分信号值变化均呈现先上升后下降的趋势,在载气流速为1.6 mL/min时达到最大值。另一方面,载气流速同时影响检测信噪比,载气流速过小时流动相可能蒸发不完全,导致基线噪音增大。如图1-B所示,糖类组分的信噪比变化随载气流速升高呈现相同的变化趋势,随着载气流速升高,信噪比同样呈现先升后降的趋势,并在1.6 mL/min时达到最大值。因此,选择1.6 mL/min为最佳载气流速。

2.1.1.2 漂移管温度优化

考虑到漂移管温度在40 ℃时,流动相未能完全蒸发,导致基线饱和,因此以50 ℃为起始温度进行漂移管温度优化。如图2-A所示,糖类组分信号值呈现先升高后下降的趋势,最终趋于稳定,在60 ℃时所有糖类组分在ELSD上均达到最大响应。此外,糖类组分的信噪比变化呈先增加后降低的趋势,当温度为50 ℃时具有较好的信噪比,随着漂移管温度升高,在60 ℃时信噪比达到峰值(图2-B)。温度变化会影响物质在检测器上的响应,温度过低时流动相无法完全蒸发,而温度过高,虽能提高信噪比,但过高的温度会使样品汽化,导致信号值过小[19]。因此,应在使流动相基本蒸发完全的基础上,选择具有可接受噪音的最低温度。本实验中,55、60、65 ℃条件时,60 ℃下信噪比最高,且同样具有较好的糖类组分信号值。因此,选择60 ℃作为最佳漂移管温度。

2.1.2 流动相比例对分离度的影响

采用乙腈和水作为分离糖类组分的流动相,通过改变流动相比例对糖类组分进行洗脱。如图3所示,随着有机相比例的不断增加,所有试验的糖类组分在色谱柱上的保留时间都延长,同时检出的含量存在差异。因不同糖类组分在水相中的溶解度不同,当有机相比例增加时,糖类组分溶解度下降,在色谱柱的保留时间延长。而当水相比例增加时,在色谱柱的保留时间相当,易出现信号重叠,降低分离度,其中的单糖在水相比例较大时发生重叠现象更为明显。V(乙腈)∶V(水)=80∶20条件下的分离效果最好,能较好分离各种糖,峰形尖锐对称性好,但葡萄糖和半乳糖无法达成基线分离。葡萄糖和半乳糖互为差向异构体,高温以及高pH条件可使葡萄糖和半乳糖相互转换[20],但温度和pH的变化会使其他糖类组分的分离受到影响。因此,将柱温稳定在室温,虽然不能使得葡萄糖和半乳糖达到基线分离,但可采取垂线分峰法的方式,计算出2个组分的完整峰面积[21]。综上,采取流动相比例为V(乙腈)∶V(水)=80∶20作为后续实验的最佳流动相比例。

2.1.3 流动相流速对保留时间的影响

流动相流速会对组分在色谱柱中的保留时间产生一定影响,流动相流速过大或过小都会影响待测物质在检测器中的响应,过慢会使分析时间延长且准确度降低,过高会时使组分重叠,且柱压升高,导致柱子内的填料塌陷[22]。在使用Waters BEH Amide色谱柱时,为了维持色谱柱的柱效,流动相的流速应控制在合适范围内。本研究将流动相流速控制在0.6～1.0 mL/min,分析流动相流速对糖类组分测定时间的影响,以确定最佳流速条件。如图4-A所示,随着流动相流速增加,各种组分之间保留时间逐渐缩短,其中分子量大的组分更易受流速影响。但不同流动相流速条件下,各糖类组分均可以有效分离,表明流动相流速对7种糖组分的分离度影响不明显。然而,当流速过低时,色谱峰的纵向扩散增大,导致峰宽变宽,色谱峰的对称性下降,从而影响定量结果。综上,当流速为1.0 mL/min时,所有样品的分析时间缩短,分离度较好,峰的对称性较好。

根据上述4个色谱条件因素的优化结果,筛选出分离7种糖类组分的最佳色谱条件为:使用Waters BEH Xbridge Amide色谱柱联合ELSD检测器,流动相为V(乙腈)∶V(水)=80∶20,流动相流速为1.0 mL/min,ELSD检测器条件为漂移管温度60 ℃、载气流速为1.6 mL/min。在该条件下,得到了水苏糖及其代谢产物混合标准品的分离色谱图(图4-B)。

2.2 方法学评价

2.2.1 加标回收试验

通过加标回收率评估分析方法的准确性和可靠性。如表1所示,水苏糖、棉籽糖、蜜二糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、果糖的平均回收率为95.91%～99.13%,RSD为0.98%～3.61%(RSD<5%),说明该色谱条件对检测水苏糖及其代谢产物准确可靠。

2.2.2 检出限及定量限分析

基于前述优化的HPLC-ELSD检测条件,得到水苏糖及其代谢产物的标准曲线回归方程及相关系数,并进一步测定本方法对水苏糖、棉籽糖、蜜二糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、果糖7种糖类组分的检出限及定量限。结果如表2所示,上述7种糖类组分的检出限为5.32～20.00 μg/mL,定量限为16.27～68.25 μg/mL,该方法对于水苏糖及其代谢产物的检测具有很高的灵敏度。

2.2.3 精密度分析

如表3所示,水苏糖、棉籽糖、蜜二糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、果糖的RSD分别为1.69%、1.56%、1.73%、1.00%、1.65%、1.30%、1.06%,表明本试验所建立的水苏糖及其代谢产物糖类组分HPLC-ELSD检测方法的精密度良好。

3 结论

水苏糖是一种能通过有效促进益生菌生长调节肠道微生物菌群的益生元[23]。本研究建立了检测乳酸菌中水苏糖及其代谢产物的HPLC-ELSD分析方法,优化得到了最佳色谱条件如下:使用Waters BEH Amide色谱柱结合ELSD检测器,洗脱条件为V(乙腈)∶V(水)=80∶20、流动相流速为1.0 mL/min,ELSD检测器条件为温度60 ℃,载气流速1.0 mL/min。用本方法检测水苏糖及其代谢产物,精密度为1.00～1.73,检出限在20.00 μg/mL以下,定量限在68.25 μg/mL以下,加标回收率达95.91%～99.13%。本方法适用于水苏糖及其代谢产物的检测,精密度良好,分离效果和检测重现性好,稳定性高,可以为乳酸菌中水苏糖及其代谢产物的检测及其代谢途径研究提供基础。

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