微氧技术是一项创新的葡萄酒酿造工艺,在人为可控的操作下,向葡萄酒中持续性或间歇性地引入微量的氧气,核心在于通过精确控制葡萄酒与微量氧气的接触,从而满足葡萄酒在陈酿期间的各种化学和物理反应,这一技术已被证实能够促进葡萄酒成熟并改善其品质[1]。微氧技术在20世纪的西方就已出现,起初是为了模拟橡木桶陈酿的透氧环境,同时加快葡萄酒的成熟,以代替大量橡木桶的使用,经过一个多世纪的发展,如今的微氧技术涵盖了酿造及陈酿阶段,已成为现代葡萄酒酿造中不可或缺的一部分[2]。
多酚是葡萄酒中的重要化学成分,其中色素类物质主要由花青素、黄酮等组成,单宁类是从葡萄皮籽中提取的复杂多酚化合物,通常被分为缩合单宁和水解单宁[3]。它们不仅是色泽和口感的重要贡献者,更是香气成分演化的关键所在,是与活性氧反应的首要反应物,在陈酿过程中能够作为电子受体消耗葡萄酒中大量的溶解氧,维持基质的电位平衡[4]。研究发现在通入空气的半氧化状态和H2O2过氧化状态中,酯类物质(如乙酸异戊酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯)均显著低于对照[5]。适量氧气能够促进多酚类物质发生聚合反应,有效提升葡萄酒颜色稳定性,同时改变香气成分的氧化还原反应速率,进而改善葡萄酒的香气品质[6]。葡萄酒中的多酚,如花色苷和单宁等,容易与氧气发生反应,包括色素聚合、单宁缩合以及水解等,从而生成新的芳香化合物并去除葡萄酒中原有的不良味道[7]。在微氧的作用下,多酚物质能够在金属离子催化下,通过芬顿反应和斯特雷克反应将酚类化合物氧化为邻醌,降解蛋氨酸和苯丙氨酸,形成各自的醛,如苯乙醛,进而改变香气成分的平衡[8]。
目前国内外研究多关注于微氧或外源多酚本身对葡萄酒颜色等品质的影响[9-11],微氧处理对不同外源多酚添加葡萄酒香气品质的影响机理目前暂无研究阐述。因此,微氧处理结合外源多酚的添加为赤霞珠葡萄酒的品质提升提供了新的思路,本研究基于此,旨在探讨微氧处理结合不同外源多酚的添加对赤霞珠葡萄酒香气品质的影响,为赤霞珠葡萄酒香气品质的优化提供理论依据和实践指导。
酒样:宁夏贺兰山东麓产区君祥酒庄2023年酿造的赤霞珠干红葡萄酒,pH值3.81,酒精度13.68%vol,还原糖1.20 g/L,总酚2.26 g/L,总花色苷658.50 mg/L,总酸4.90 g/L(以酒石酸计)。酒样符合国标GB 15037—2006《葡萄酒》[12]对干红葡萄酒的要求。
外源多酚:葡萄皮色素,法国Lalenand公司;VINITAN® ADVANCE葡萄籽单宁、EXCELTAN原花青素和鞣花单宁,法国Lamothe-Abiet公司。
主要试剂:无水乙醇(色谱纯),上海阿拉丁试剂有限公司;NaCl(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;C8~C20正构烷烃(纯度≥99.7%,色谱纯)、香气标准品(色谱纯),美国Sigma-Aldrich公司;总酚检测试剂盒、花色苷检测试剂盒,西班牙Biosystems公司。
Enology Y15葡萄酒全自动分析仪,西班牙Biosystems公司;BJPX-I 400生化培养箱,山东Biobase公司;PAL3自动进样器,瑞士CTC Analytics公司;DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm,1 cm),美国Supelco公司;DB-WAX(60 m×250 μm×0.25 μm)色谱柱、7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司。
1.3.1 试验处理
外源多酚的添加:添加量结合产品说明书及文献[11,13]得出,处理组酒样分别添加0.25、0.5、1 g/L葡萄皮色素(P1、P2、P3),0.1、0.2、0.4 g/L葡萄籽单宁(Z1、Z2、Z3)和复合单宁(F1、F2、F3)。以不添加外源多酚的酒样为对照(CK),并设置3个生物学重复。
装瓶处理的方法:在全程氮气保护下,将添加完不同外源多酚的葡萄酒分别装入提前充满氮气的1 L螺口孟氏洗气瓶,拧紧瓶口螺旋盖,同时拧紧并密封进气口与出气口螺旋盖(瓶盖均为聚四氟乙烯与食品级硅胶隔垫组合)。
微氧处理的方法:待所有酒样装瓶稳定24 h后开始进行微氧处理,通氧方式参考文献[10,14]的方法,使用注射器吸取0.2 mL食品级纯氧,拧开洗气瓶的进气口与出气口,缓慢通入后拧紧瓶盖并密封,注氧周期为3 d[2 mL/(L·月)]。期间所有处理组与对照组酒样均置于恒温培养箱进行储存[温度(14±0.1) ℃,湿度(55±5)%]。
1.3.2 香气成分的测定
对原酒及微氧处理2个月后的酒样使用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术(head space solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对葡萄酒香气成分进行检测,检测方法参照文献研究为基础[1],并略有优化。
进样前处理:将1.5 g NaCl置于20 mL顶空进样瓶内,分别吸取5 mL待测酒样与10 μL的4-甲基-2-戊醇(1.008 3 g/L,用色谱乙醇稀释)放入顶空进样瓶,并密封瓶口。萃取头在250 ℃下老化10 min,以250 r/min振荡样品,在40 ℃预热5 min后再萃取30 min。
色谱条件:使用DB-WAX(60 m×250 μm×0.25 μm)极性色谱柱;进样口温度230 ℃;升温程序:起始柱温50 ℃,保持1 min,3 ℃/min 升到220 ℃,保持5 min;载气高纯氦气(纯度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流进样。
质谱条件:电子轰击离子源;电子能量70 eV,传输线温度235 ℃,离子源温度230 ℃;Scan模式下质量扫描范围m/z 29~350。
定性方法:利用MassHunter Qualitative navigator10.0提取挥发性香气质谱图,根据C8~C20烷烃混合标准品的保留时间,用保留指数(retention index, RI)法计算各挥发性香气成分的RI[14],并通过检索NIST 17谱库对香气成分进行定性分析。
定量方法:对有标准品的挥发性香气成分用其标准曲线进行定量分析,无标准品的挥发性香气成分质量浓度以使用化学结构相似物质和碳原子数相近的原则进行计算。
1.3.3 感官分析
从宁夏大学葡萄酒与园艺学院的博士研究生和硕士研究生中招募12名专业的感官品评人员(年龄22~40岁,男性6名,女性6名)组成品鉴小组,小组成员均长期参与赤霞珠干红葡萄酒的品鉴,具备良好的品鉴能力。参考文献[15-16]的方法对赤霞珠葡萄酒香气品质、纯正度、浓郁度、协调性和优雅度5个方面及赤霞珠葡萄酒的8类主要香气特征(果香味、花香味、奶油味、果脯味、氧化味、酒精味、生青味、青椒味)进行品评打分。每项采用10分制,具体标准为:0分无此类香气;1~3分微弱且较难分辨;4~6分能分辨但比较微弱;7~9分能分辨且强烈;10分非常强烈。在标准品酒室使用标准品酒杯进行独立评审。数据统计去掉每组最大值和最小值后求最终平均得分。
利用Excel 2021和SPSS Statistics 27.0软件对数据进行ANOVA方差分析(P<0.05)等统计处理;通过绘图软件Origin Pro 2024进行雷达图和柱状图的绘制。
由图1感官雷达图可知,从总体来看,添加复合单宁的酒样在微氧处理后其香气品质显著提升,优雅度和浓郁度显著高于CK,添加0.2 g/L复合单宁的酒样F2表现最好;添加葡萄籽单宁的酒样在微氧处理后其香气品质有所提升,其浓郁度显著高于CK,添加0.2 g/L葡萄籽单宁的酒样Z2表现最好;添加葡萄皮色素的酒样在微氧处理后其香气品质较CK有所下降,其优雅度与协调性显著低于CK,且浓度越高的葡萄皮色素添加,其感官得分越低。
a-葡萄皮色素;b-葡萄籽单宁;c-复合单宁
图1 香气感官雷达图
Fig.1 Aroma sensory radar map
注:“*”代表处理组与CK得分间有显著差异(P<0.05)。
从香气特征来看,微氧处理后,所有酒样的氧化味特征得分均未超过1,说明微氧处理后所有酒样并没有出现过氧化导致感官品质下降的现象。添加葡萄皮色素酒样的果香味和花香味特征与CK并无明显差异,添加葡萄籽单宁和复合单宁酒样的果香味和花香味特征显著高于CK,说明单宁类多酚的添加有利于微氧处理后果香味和花香味特征的增加;添加葡萄皮色素酒样的果脯味和酒精味特征显著高于CK,这可能是因为醇类物质含量的大幅上升所致,而添加复合单宁酒样的酒精味显著低于CK;添加葡萄籽单宁和复合单宁酒样的果脯味特征与CK无显著差异,仅添加葡萄皮色素酒样中果脯味与CK出现显著差异,可能与微氧处理后香气总量的升高有关;所有酒样的奶油味、青椒味和生青味特征较CK均未出现显著差异。
对微氧处理后添加不同外源多酚的葡萄酒香气成分进行检测分析,共测得45种香气成分,其中酯类物质22种、醇类物质10种、酸类物质5种、醛酮类物质6种、萜烯类物质2种。微氧处理可以改善葡萄酒香气品质,在一定程度上增加香气成分总量,提升香气浓郁度,改变香气成分中醇类物质与酯类物质的占比,从而促进葡萄酒的成熟[1]。
图2给出了微氧处理后添加葡萄皮色素酒样香气成分总量及种类的变化。微氧处理前原酒香气成分总量为380.99 mg/L,微氧处理后CK香气成分总量上升至500.72 mg/L,香气成分总量较原酒上升了31.43%。花色苷和黄烷醇类物质是干红葡萄酒中最主要的多酚类物质,也是微氧处理过程中参与大多数反应的物质[17]。添加不同浓度葡萄皮色素的葡萄酒在微氧处理后香气成分总量较原酒和CK显著提升,其中P1香气成分总量升至629.74 mg/L,P2香气成分总量升至559.20 mg/L,P3香气成分总量升至702.80 mg/L;添加不同浓度葡萄籽单宁的葡萄酒香气成分总量较原酒均显著上升,但添加低浓度葡萄籽单宁的葡萄酒(Z1)香气成分总量低于CK,只有Z2和Z3葡萄酒香气成分总量高于CK,分别为550.91和514.84 mg/L;添加不同浓度复合单宁的葡萄酒香气成分总量较原酒均显著上升,但添加中浓度复合单宁的葡萄酒(F2)香气成分总量低于CK,只有F1和F3葡萄酒香气成分总量高于CK,分别为554.00和532.40 mg/L。
图2 微氧处理后不同酒样香气成分总量
Fig.2 Total amount of aroma components in different wine samples after micro-oxygen treatment
注:不同小写字母代表不同处理组间数据有显著性差异(P<0.05)。
2.3.1 醇类物质
葡萄酒中的醇类物质主要来源于酒精发酵过程,是大部分葡萄酒中其含量最高的香气成分类型[15]。由电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039713)可知,微氧处理后所有酒样醇类物质含量较原酒的302.45 mg/L均出现上升,CK醇类物质含量为405.60 mg/L,相比原酒上升了34.10%;添加葡萄皮色素的酒样在微氧处理后,醇类物质含量显著上升,其中P1醇类物质含量为517.65 mg/L,P2醇类物质含量为461.08 mg/L,P3中醇类物质含量为583.56 mg/L,异戊醇、正丁醇、正戊醇和正己醇在添加葡萄皮色素的酒样中上升明显,而醇类物质含量超过400 mg/L时,可能会为葡萄酒带来负面的感官特征[18];添加葡萄籽单宁和添加复合单宁的酒样醇类物质含量在微氧处理后,仅Z2和F1略高于CK且差异不显著,其余处理酒样醇类物质含量均低于CK。值得注意的是,添加葡萄籽单宁和添加复合单宁的酒样在微氧处理后,其醇类物质占比明显下降,Z1、Z2和Z3分别降至75.09%、75.78%和74.64%;F1、F2和F3分别降至74.79%、76.17%和75.40%,虽然醇类物质在葡萄酒体系中没有强烈的反应活性,但可作为氧化反应的底物,被氧化成相应的醛类,从而使葡萄酒中原有的醇类物质含量降低,同时能为葡萄酒贡献氧化味[10]。
2.3.2 酯类物质
葡萄酒中的酯类物质大多产生于微生物发酵及陈酿阶段,阈值较低,且大多数酯类物质能为葡萄酒带来丰富的果香甜香等气味特征,其含量的变化能显著改变葡萄酒的平衡性[19]。由电子增强出版附表1可知,微氧处理后,所有酒样的酯类物质含量均有所上升,原酒中酯类物质含量为69.82 mg/L,CK酒样在微氧处理后酯类物质含量至79.12 mg/L,相比原酒上升了13.31%;添加葡萄皮色素的酒样在微氧处理后,酯类物质含量较CK有所上升,但含量低于添加葡萄籽单宁和复合单宁的酒样;添加葡萄籽单宁的酒样酯类物质含量在微氧处理后上升,其中Z1酯类物质含量为95.75 mg/L,Z2为118.16 mg/L,Z3为107.44 mg/L;添加复合单宁的酒样酯类物质含量在微氧处理后同样上升,其中F1酯类物质含量为113.13 mg/L,F2酯类物质含量为83.46 mg/L,F3酯类物质含量为105.33 mg/L。从物质占比来看,添加葡萄皮色素的酒样在微氧处理后,酯类物质占比均低于CK的15.80%,而添加葡萄籽单宁和复合单宁的酒样在微氧处理后,酯类物质占比明显高于CK,均大于19%,其中丁酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯、庚酸乙酯和正己酸乙酯含量相较于原酒明显上升。说明微氧处理对不同外源多酚基质的葡萄酒中酯类物质含量有提升作用,其中添加单宁类多酚的葡萄酒中酯类物质含量上升幅度更大,WILDENRADT等[20]发现只有将含邻苯二酚的酚类物质加入到模拟葡萄酒体系中,才能观察到醛类物质的形成及葡萄酒的氧化褐变,由于单宁类多酚中含有较多的儿茶素和咖啡酸等物质,它们与氧反应生成醌和H2O2,进而促进了葡萄酒中氧化反应,使酯类物质含量出现变化,为葡萄酒感官上带来更多的果香花香特征。
2.3.3 酸类物质
葡萄酒中的酸类物质包括直链脂肪酸如己酸、辛酸和癸酸等,它们为葡萄酒增添了奶酪般的香气,还有支链脂肪酸,如异丁酸能赋予葡萄酒一些特定的腐臭和脂肪气味,虽然这些气味在某些情况下可能不被人们喜欢,但它们同样是构成葡萄酒独特风味不可或缺的部分[21]。原酒酸类物质含量为8.11 mg/L,微氧处理后的CK为10.57 mg/L,略有上升,同时由电子增强出版附表1可知添加低浓度与高浓度的葡萄籽单宁和复合单宁的酒样中酸类物质含量在微氧处理后上升幅度较大,异丁酸和辛酸在所有处理组中含量均高于CK,其余酒样中酸类物质含量在微氧处理后差异较不明显。葡萄酒中酸类物质的来源有两个方面:一是醇和醛的氧化作用,醇先氧化为醛,进而再氧化为相应的羧酸;二是酯的水解作用,由于酸类物质在葡萄酒体系中与醇类和酯类物质互相影响,互相转化,导致其含量波动[22]。
2.3.4 醛酮类物质
葡萄酒中醛酮类物质的生成主要通过3种机制:脂肪酸和高级醇的氧化过程、羟醛缩合或美拉德反应、斯特雷克降解反应[23]。由电子增强出版附表1可知微氧处理明显增加了所有葡萄酒中醛酮类物质的含量,CK醛酮类物质含量由原酒0.61 mg/L上升至5.43 mg/L;P1、P2、P3中醛酮类物质含量分别为3.59、5.52、6.60 mg/L;Z1、Z2、Z3中醛酮类物质含量分别为7.91、4.45、4.01 mg/L;F1、F2、F3中醛酮类物质含量分别为8.72、5.78、7.20 mg/L。在微氧处理后,添加低浓度葡萄籽单宁和复合单宁的葡萄酒中醛酮类物质含量上升幅度较大,且高于添加高浓度葡萄籽单宁和复合单宁的葡萄酒,说明单宁物质的增加,为葡萄酒提供了更高的抗氧化能力,使微氧处理后醛酮类物质含量降低。
2.3.5 萜烯类物质
不同处理间萜烯类物质总量并没有显著差异,葡萄酒中的萜烯类物质源自葡萄果实,故被称为品种香气,其含量相对较少,阈值也比较低[24]。所有酒样中只检测出了芳樟醇和香茅醇这2种萜烯类物质,芳樟醇和香茅醇可为葡萄酒带来玫瑰花香和柑橘等感官特征,但它们含量不足0.01 mg/L。其中香茅醇含量在微氧处理后变化不明显;芳樟醇含量在微氧处理后出现升高,但原酒与CK中芳樟醇含量无明显变化,而在添加葡萄皮色素的葡萄酒中,芳樟醇含量与添加葡萄皮色素的浓度呈现出正比关系。说明微氧可能对品种香气影响较小,更多的影响因素可能是外源多酚物质基质效应。
葡萄酒的成熟几乎都与氧相关,微氧处理可以提升葡萄酒的品质,尤其是新酒的香气成分含量及感官品质[1]。微氧技术作为一种新兴的葡萄酒品质调控工艺,能够实现陈酿期间的精准供氧,对葡萄酒的成熟控制具有十分重要的意义。在此基础上,本研究以宁夏产区2023年赤霞珠葡萄酒为对象,分别添加3种不同浓度的外源多酚(葡萄皮色素、葡萄籽单宁、复合单宁),以不添加外源多酚的葡萄酒为对照,进行相同参数的微氧处理。通过分析微氧处理后葡萄酒香气成分和感官特征的变化,研究微氧对添加不同外源多酚赤霞珠干红葡萄酒香气品质的影响。
结果表明,微氧处理后的葡萄酒香气成分总量均出现了不同程度上升,这是由于不同的酚类物质会与一些香气成分结合,或消耗氧化反应的中间产物,来改变香气成分演化速率,从而使香气成分总量有所变化[25]。其中添加葡萄皮色素的酒样在微氧处理后,醇类物质含量上升,这类香气成分含量的提升可能是导致葡萄酒在感官上表现出较高的酒精味,这与前人研究结果一致[5,10]。添加葡萄籽单宁与复合单宁的酒样中酯类物质含量在微氧处理后上升,这类香气成分含量的上升使葡萄酒在感官上表现出较高花香和果香味特征。所有酒样中醛酮类物质含量持续上升,苯乙醛含量的上升可以为葡萄酒带来更浓郁的玫瑰花味。大部分酒样酸类物质含量呈波动变化,但高浓度的葡萄籽单宁和复合单宁添加的葡萄酒中酸类物质含量呈持续上升趋势,进一步分析原因发现,葡萄酒在微氧处理过程中会发生氧化还原反应以及酯化水解反应,这些反应会影响香气成分含量及感官[26]。
本研究发现添加单宁类多酚更有利于微氧处理后酯类物质含量的积累,这也和红葡萄酒中的酯类物质含量通常高于白葡萄酒的现象一致[22],而添加色素类多酚会使微氧处理后醇类物质含量有所增加。这是因为单宁主要是黄烷醇等,在葡萄酒中起到抗氧化作用,能发生氧化、聚合等反应;色素主要是花色苷类物质,呈色效果好,但在结构上与黄烷醇等物质有所不同。在微氧处理下,葡萄酒通过一系列反应,改变不同种类物质含量的占比,提升葡萄酒中香气成分含量[27-28],由于氧气并不会直接与香气成分或酚类物质发生反应,而是与葡萄酒中少量的H2O2和Fe2+发生芬顿反应产生的羟基自由基(·OH)反应,在此过程中生成过氧化氢自由基(HOO·)、·OH和Fe3+,HOO·再与酚类物质,尤其是邻羟基酚反应生成H2O2和邻醌,促进了醇与酸类物质发生酯化反应产生酯类物质,H2O2与Fe2+通过芬顿反应生成·OH,·OH与乙醇反应生成α-羟乙基自由基,在此期间香气成分再与一些多酚物质发生反应[8]。
不同浓度的多酚组分能够在不同程度上影响香气化合物的释放。小分子多酚物质会聚合成大分子,并与其他大分子物质如多糖、蛋白质、酒石酸等发生聚合分解作用,形成的复合物会逐渐增多增大,变成酒中的沉淀物[29]。多酚物质通过调控香气成分的释放、参与陈酿过程中的化学反应以及影响葡萄酒的氧化进程等多种方式,对葡萄酒的香气成分产生深远影响。微氧处理结合外源酚类物质的添加使葡萄酒体系更为复杂,防止一些香气成分的过度氧化,并形成一种保护作用,这又取决于酚类物质的种类和添加量等因素[17]。关于葡萄酒陈酿过程中多酚物质分子的产生机制已有较多报道,但关于其变化机制的研究仍较少。因此在葡萄酒陈化过程中多酚物质与氧气是否会发生更加复杂的反应,进而影响葡萄酒的香气成分变化,尤其是微氧处理下的多酚基质效应还有待进一步深入研究。
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