花旗松素(taxifolin,TAX)又名二氢槲皮素、紫叶杉素,是一种营养与保健价值较高的新食品原料。是从高寒地带松科落叶松根部提取得到的一种天然黄酮类化合物,近年来发现,洋葱、葡萄、柑橘中也含有TAX[1-2]。TAX具有抗氧化[3-4]、抗炎[5-6]、抗肿瘤[7]、抗病毒[8]等多种生物活性,但由于TAX的溶解度与渗透性均较低,经食用后,在体内释放与渗透过程受阻,口服吸收不完全[9],从而导致生物利用度低[10],限制其应用。李玉等[11]、赵艳萍[12]通过制剂技术将TAX包封于纳米脂质体或固体脂质纳米粒内从而改善其生物利用度低的问题,但制备工艺复杂,且制备过程中所需辅料较多,包括多种表面活性剂和非天然脂质材料等,在食用安全等方面存在问题。
磷脂(phospholipid,PC)在体内分布广泛,是构成细胞生物膜的重要组成成分,以PC为基础构建的复合物,安全性高,生物相容性好,有助于提高化合物的跨膜运输和膜渗透性[13-14]。磷脂复合物是指将化合物与PC在一定条件、一定比例下通过电荷迁移作用使化合物由晶型转变形成无定形态的复合物[15]。磷脂复合物的形成可使化合物的理化性质(水溶性、油水分配系数等)发生改变,释放与吸收得到改善,从而提高化合物的生物利用度[16]。本研究制备花旗松素磷脂复合物(taxifolin phospholipid complex,TAX-PC),通过响应面试验优化制备工艺,并研究其理化性质、体外模拟消化释放,为后续提高TAX生物利用度提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
花旗松素,吉林健维天然生物科技有限公司;花旗松素标准品,中国食品药品检定研究院;大豆卵磷脂、KH2PO4、K2HPO4、胃蛋白酶、胰蛋白酶,上海源叶生物科技有限公司;甲醇、无水乙醇、二氯甲烷,北京化工厂;正辛醇,上海麦克林生化科技股份有限公司;KBr,阿拉丁生化科技股份有限公司。
KQ200B型超声波清洗器,昆山市仪器有限公司;DKZ-2型电热恒温振荡水槽,上海精宏实验设备有限公司;85-2型数显恒温磁力搅拌器,常州江南实验仪器厂;RE-52AA型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;TGL-18C型高速台式离心机,上海安亭科学仪器厂;1200型高效液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司;FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪、XRD-7000 X射线衍射仪,日本岛津公司;DSC 3+型差示扫描量热仪,梅特勒托利多科技(中国)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 HPLC测定磷脂复合物中TAX的含量
1.2.1.1 色谱条件的选择
以Agilent ZORBAX SB-C18柱为色谱柱;V(乙腈)∶V(水)=22∶78为流动相;检测波长290 nm;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL。
1.2.1.2 标准曲线的建立
取TAX对照品,分别加甲醇配制质量浓度为100、50、25、12.5、6.3、3.1 μg/mL的样品溶液,按1.2.1.1节的色谱条件测定含量,以TAX对照品浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.2 TAX-PC的制备
采用溶剂蒸发法并参照曾川等[17]的方法制备,将TAX与PC以一定比例溶于无水乙醇中,恒温磁力搅拌下反应一定时间后,减压旋蒸除去有机溶剂,加入二氯甲烷复溶,抽滤,减压干燥,即得。
1.2.3 复合率的测定
TAX与PC的结合程度以复合率作为评价指标。取TAX-PC加甲醇溶解定容,测定含量,按公式(1)计算复合率(composite rate,CR):
(1)
式中:m1,测得的TAX含量,mg;m0,投药量,mg。
1.2.4 Box-Behnken响应面试验
根据前期单因素试验结果,选择TAX与PC质量比、反应溶剂体积、反应时间单因素,进行Box-Behnken响应面试验,以m(TAX)∶m(PC)(A)、反应溶剂体积(B)、反应时间(C)3个主要影响因素为自变量,以复合率为响应值,进行各因素间的交互作用分析,从而预测最佳工艺条件,因素水平设计见表1。
表1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Level design of test factors on response surface
水平因素A[m(TAX)∶m(PC)]B(反应溶剂体积)/mLC(反应时间)/h-11∶45201∶3102.511∶2153
1.2.5 验证试验
根据试验预测出的最优处方及工艺平行制备三批次TAX-PC,验证理论值与实际值的误差,确定模型的可靠性。
1.2.6 表征
1.2.6.1 差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)分析
取TAX、PC、TAX-PC、物理混合物5.0 mg分别置于铝坩埚中,以空白坩埚为参比,载气N2,流速50.0 mL/min,升温速度10 ℃/min,温程30～250 ℃,进行DSC分析。
1.2.6.2 傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)分析
采用KBr压片法,以100∶1(质量比)的比例分别将KBr与TAX、PC、TAX-PC、物理混合物混合、研匀,压片,进行FTIR分析。
1.2.6.3 X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析
取TAX、PC、TAX-PC、物理混合物进行XRD分析。检测条件:管流/管压(20 mA/40 kV),衍射范围3°<2θ<45°,扫描速度8°/min。
1.2.7 理化性质测定
1.2.7.1 平衡溶解度
参照杨元丰等[18]的方法,取过量TAX分别加入到纯化水、pH=1.2的盐酸溶液和pH=6.8的磷酸缓冲溶液中,涡旋混合10 min,置37 ℃恒温振荡器中,100 r/min振荡72 h,3 600 r/min离心10 min,取上清液加甲醇稀释,测定含量,计算TAX平衡溶解度。
1.2.7.2 油水分配系数
油水分配系数(lg P)与TAX经胃肠道上皮细胞的转运息息相关,可作为评价TAX透膜能力最简单直接的指标[19],通常来说,lg P>0为脂溶性,以lg P=1为界,lg P<1则不利于吸收,lg P>1则利于吸收[20-21]。分别制备纯化水、pH=1.2的盐酸溶液和pH=6.8的磷酸缓冲溶液与正辛醇的两相饱和溶液体系。取适量TAX分别加入不同水相饱和的正辛醇溶液中,超声溶解,得TAX正辛醇溶液。精密移取该溶液5 mL,与同体积正辛醇饱和的不同水相溶液混合, 37 ℃恒温水浴振荡24 h,静置,分别取上层正辛醇溶液和下层水溶液并适当稀释后测定含量,计算如公式(2)所示:
(2)
式中:ρ0,正辛醇中TAX的质量浓度,mg/mL;ρ1,水中TAX的质量浓度,mg/mL。
1.2.8 体外模拟消化释放
模拟胃肠消化液体外消化TAX、TAX-PC是评价TAX消化吸收及体外释放规律较为科学的方法。成年人胃排空时间约为2 h,故实验以2 h为模拟胃部消化时段,2 h后为肠部模拟消化时段。参考SUN等[22]、牛芸等[23]的方法并稍作修改:取3 mL TAX和TAX-PC溶液(均含5 mg TAX)分别与3 mL人工模拟胃液(2 g/L NaCl、3.2 g/L胃蛋白酶、7 ml/L盐酸)充分混合,用1 mol/L的盐酸调pH值至1.2,装入透析袋(截留分子质量 3 500 Da),并置于存有150 mL释放介质(乙醇与不含胃蛋白酶的人工模拟胃液按1∶1等体积混合)的锥形瓶内,恒温振荡模拟消化2 h,90 ℃加热5 min终止消化。另取6 mL人工模拟肠液(6.8 g/L KH2PO4、1 g/L胰蛋白酶、5 g/L胆酸盐)继续添加至含有上述混合物的透析袋中,1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0,置于存有150 mL释放介质(乙醇与不含胰蛋白酶的人工模拟肠液按1∶1等体积混合)的锥形瓶中,恒温振荡模拟消化4 h;全过程分别在10、30 min和1、2、3、4、5、6 h 取适量释放介质,并补充同温度同量的新鲜介质,取样在4 ℃下保存。
1.3 数据处理
所有数据均重复3次测定,结果以平均值±标准差表示。用SPSS软件进行数据显著性分析,Design-expert软件进行响应面试验设计与分析。用Origin软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的确定
求得回归方程为Y=47.899X-0.035 1,R2=0.999 9,表明TAX质量浓度在3.1～100.0 μg/mL范围内线性关系良好。
2.2 响应面法优化TAX-PC的制备工艺
2.2.1 响应面优化试验结果分析
如表2所示,以复合率对各个因素进行模型拟合,得二元多项回归方程:Y=91.90-3.18A-3.69B+2.52C+0.87AB-3.92AC+1.31BC-7.83A2+0.081B2-2.59C2,由表3方差分析可知,模型P<0.05,失拟项P>0.05,表明模型拟合度高;拟合方程决定系数 R2=0.972 0,实测值与预测值相关性良好;该模型可有效预测实际情况。显著性方差分析显示,A、B、C均对复合率有显著影响,结合图1也可以看出,响应面图向上凸起,存在最高点,且等高线为椭圆形,表明交互项显著。
a-因素A及因素B交互;b-因素A及因素C交互;c-因素B及因素C交互
图1 各因素间影响复合率的响应曲面及等高线图
Fig.1 Response surface and contour plot affecting the composite rate between various factors
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface experimental design and results
序号A[m(TAX)∶m(PC)]B(反应溶剂体积)/mLC(反应时间)/h复合率/%1-1 0-177.79210-178.223-1-1091.89411078.15510177.3561-1084.857-11081.72800093.29900092.76100-1-192.311100091.911200091.301301189.0914-10192.581501-183.36160-1192.821700090.24
表3 响应面模型的方差分析
Table 3 ANOVA for response surface model
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型608.86967.6526.980.000 1∗A80.71180.7132.190.000 8∗B109.151109.1543.540.000 3∗C50.8150.820.260.002 8∗AB3.0113.011.20.309 4AC61.31161.3124.450.001 7∗BC6.8116.812.720.143 3A2258.061258.06102.93<0.000 1∗∗B20.02810.0280.0110.919 1C228.16128.1611.230.012 2∗残差17.5572.51失拟项11.7633.922.710.179 9#纯误差5.7941.45总和626.4116
注：*表示具有显著性差异P<0.05,**表示具有极显著差异P<0.000 1。
2.2.2 验证实验
通过软件预测最佳制备工艺:m(TAX)∶m(PC)为1∶3.71、反应溶剂体积12.82 mL、反应时间2.94 h,预测复合率为96.79%。在此条件下制备TAX-PC,测得复合率分别为95.85%、95.76%、95.04%,平均复合率为95.55%,与理论值相差较小,证明响应面法建立的模型对TAX-PC制备的优化稳定可行。
2.3 表征结果
2.3.1 DSC分析
如图2所示,在TAX的DSC谱图中,234.00 ℃处出现了强吸热特征峰;在PC的DSC谱图中,129.17 ℃和180.17 ℃处出现了低强度、宽吸热峰,这是PC极性区域融化所产生的特征峰;在物理混合物的谱图中,130.83、180.99、233.67 ℃处出现了吸热峰,这与TAX和PC的吸热峰基本一致,证明了物理混合物中TAX与PC只是简单的混合,二者间并未产生相互作用。在TAX-PC的DSC谱图中,PC与TAX原本的特征吸热峰消失[24],分别在174.50、253.83 ℃处出现了新的低强度、宽吸热峰,猜想可能由于磷脂复合物中,TAX与PC不是简单的物理混合,而是通过氢键或范德华力等弱分子间相互作用相结合,随着温度的升高,这些作用力吸收能量而破环,出现新的吸热峰。
图2 不同物质的DSC谱图
Fig.2 DSC spectra of different substances
2.3.2 FTIR分析
由图3可知,在TAX的FTIR谱图中,3 549.02、3 398.57 cm-1出现吸收峰,为TAX的—OH吸收特征峰;在PC的FTIR谱图中,2 924.09、2 852.72 cm-1出现的吸收峰,为脂肪酸酯—CH2—的不对称振动吸收峰,1 232.51、1 064.71 cm-1出现的吸收峰,为PC的P
O基团的伸缩振动峰;在物理混合物的FTIR谱图中,TAX与PC的特征吸收峰均有保留,峰值基本一致,物理混合物的FTIR谱图为TAX与PC图谱的简单叠加;在磷脂复合物的FTIR谱图中,原本代表TAX的—OH特征峰消失,并在3 404.36 cm-1处出现了大宽峰,原本代表PC的极性端基团PO伸缩振动峰,峰形发生改变且波数移动至1 166.93、1 083.99 cm-1处,猜想可能由于TAX的—OH基团与PC中的PO基团发生了氢键结合,使得原本的PO基团的伸缩振动峰发生了偏移,隐藏了—OH 特征峰,并与PC的3 397.36 cm-1附近的宽峰相重叠,形成了新的吸收峰。这与陈旺等[25]的研究结果一致。综上所述,TAX与PC间通过氢键作用形成了TAX-PC。
图3 不同物质的FTIR谱图
Fig.3 FTIR spectra of different substances
2.3.3 XRD分析
由图4可知,在TAX和物理混合物的XRD图谱中,存在明显的晶体衍射峰,说明TAX是以结晶形态存在的物质,单纯的物理混合并不能改变TAX晶体状态;在TAX-PC和PC的XRD图谱中,则无明显的结晶峰。表明PC为无定形态,而TAX与PC结合形成了磷脂复合物,二者之间发生了相互作用,TAX的晶体衍射峰被覆盖,使得其由结晶态转变为无定形态,表明已形成了磷脂复合物。
图4 不同物质的FTIR谱图
Fig.4 FTIR spectra of different substances
2.4 平衡溶解度与油水分配系数结果分析
结果见表4,TAX-PC在水、pH=1.2的盐酸溶液、pH=6.8的磷酸缓冲溶液中的溶解度较TAX分别提高了2.18、2.22、1.97倍,表明磷脂复合物能够在一定程度上提高药物的溶解性,这是由于磷脂复合物改变了TAX的晶型结构形成了无定形态,起到增溶作用。TAX经磷脂复合后,其脂溶性得到明显改善。lg P>1适宜TAX的胃肠道吸收,初步表明磷脂复合技术能够提高TAX脂溶性,改变TAX吸收能力参数,实现改善TAX吸收能力的目的。这可能和TAX的极性基团是与磷脂复合的结合位点有关,极性基团受到掩盖,使得磷脂复合物脂溶性增强。
表4 TAX、TAX-PC 在不同介质中的溶解度与油水分配系数(n=3)
Table 4 Solubility and oil-water partition coefficient of TAX and TAX-PC in different media (n=3)
组别介质溶解度lg PTAX水0.888±0.0090.79pH=1.2 盐酸溶液0.785±0.0520.56pH=6.8 磷酸缓冲溶液1.433±0.0050.75TAX-PC水1.936±0.0181.41pH=1.2 盐酸溶液1.743±0.0021.12pH=6.8 磷酸缓冲溶液2.823±0.0351.30
2.5 体外模拟消化释放结果分析
如图5所示,胃部消化阶段(0～2 h),TAX累积释放率分别为20.56%、18.89%,胃部消化率均在25%以下,药物在胃部的吸收强度较低。TAX-PC的释放略低于TAX的原因是由于经PC载体的包封,其中的TAX得到了良好保护,在一定程度上维持了复合物结构的稳定性,经胃蛋白酶的消化作用后,部分PC需逐步分解,TAX才能缓慢释放出来。因此在胃部消化阶段,TAX-PC能够减缓TAX的释放,有利于肠道对药物的吸收和利用。转移至肠道消化环境模拟消化时(2～6 h),TAX、TAX-PC的肠道消化释放明显增强,推测TAX主要在肠道进行吸收[26-27]。TAX、TAX-PC 最终累积释放率可达48.26%、71.86%。TAX-PC吸收状况明显优于TAX,TAX-PC在肠道消化环境需经胰蛋白酶水解,胆盐辅助氧化分解,使复合物的结构破坏,药物快速释放出来;而PC的存在,也能够加速肠道消化。综上,TAX主要消化部位为肠道,TAX-PC在一定程度上减少了TAX在胃部吸收并增强了TAX肠道定位释放,有效提高TAX的吸收状况。
图5 TAX、TAX-PC模拟消化释放结果
Fig.5 TAX, TAX-PC simulated digestion release results
3 结论
本研究采用溶剂蒸发法制备TAX-PC,并通过响应面试验优化制备工艺,最终得到复合率高达95.55%的磷脂复合物。DSC和FTIR确定PC与TAX可能通过氢键作用相结合形成磷脂复合物。XRD显示磷脂复合物可使TAX由原本的结晶态转化为无定形态。平衡溶解度与油水分配系数的测定证明磷脂复合物对TAX的水溶性与脂溶性均有所改善。体外模拟消化释放实验表明TAX与TAX-PC在胃液环境下释放均低于25%,在肠液中二者的释放显著提高,TAX-PC的释放率为71.86%,约为TAX释放率的1.5倍。形成磷脂复合物有助于改善TAX的生物利用率,为提高TAX在营养与保健等方面的应用提供了研究基础。
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