滇牡丹(Paeonia delavayi)是芍药科芍药属牡丹组肉质花盘亚组的落叶亚灌木,为中国西南地区特有种,具有较高的药用、食用和观赏价值[1-2]。雄蕊是花的雄性生殖器官,由花丝和花药2部分组成。位于花被的内方或上方,其主要作用是产生花粉,对植物的生长发育遗传具有重要意义。由于遗传、营养状态、光照强度和温度等因素,雄蕊中花青素、类胡萝卜素、类黄酮等色素和次生代谢产物发生了不同程度的合成和积累,导致其颜色多样、生物活性不一[3]。目前关于滇牡丹的研究主要集中于其种质资源[4]、生长发育[5]、花色形成[6]等方面,少数研究了滇牡丹籽、果荚及花瓣等部位的活性成分组成与抗氧化等活性,而对其雄蕊的研究较少,对其生物活性成分及其功能作用的研究更是鲜有报道,导致其在实际生产中一般被作为废弃物,造成资源的浪费。

研究表明,牡丹雄蕊中富含多酚、黄酮、多糖、蛋白质、维生素、人体必需微量元素、挥发性成分等多种活性成分,具有抗氧化、降血脂、抗炎、抑菌等功能活性[7-10]。徐慧等[11]发现,牡丹雄蕊中烷烃类化合物的相对含量均远高于整花与花瓣,可能是牡丹挥发性成分中烷烃类化合物的重要合成部位。BAI等[12]采用非靶向代谢组学手段从牡丹雄蕊提取物中鉴定出了77种次生代谢产物,其中有39种黄酮类化合物,并发现牡丹雄蕊提取物具有良好的抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抗神经炎症特性。罗磊等[13]发现牡丹花蕊黄酮呈剂量依赖型对H2O2诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤有保护作用。此外,植物中的活性成分包括多酚、黄酮[14]和花青素[15]等被证实具有较好的酪氨酸酶和弹性蛋白酶的抑制能力,如儿茶素类化合物中的没食子酸基是抑制酪氨酸酶的关键基团[16],而酪氨酸酶和弹性蛋白酶是皮肤美白和抗皱护肤的重要靶点。因此,牡丹雄蕊具有较好的开发价值,可作为天然抗氧化剂和香精香料应用于食品、药品、化妆品等领域中。而滇牡丹作为西南地区特有的牡丹品种,对其雄蕊进行研究具有重要意义。

为了更好地研究和利用滇牡丹雄蕊中的生物活性物质,需要对滇牡丹雄蕊中活性成分进行提取。目前用于提取植物样品中活性成分的主要方法有浸提法、超声波辅助提取、微波辅助提取、超临界流体提取等[17],其中超声波辅助提取法在工业化生产中被广泛使用。另外,在提取过程中常使用的乙醇溶剂具有提取范围广、效果好、稳定、安全无毒等优点,是提取的理想溶剂。但在实际应用中,不同浓度的乙醇对不同极性的活性成分具有不同的选择性,对活性成分的溶解性能和杂质保留也有影响。因此,本文以2种不同颜色、3个发育期的滇牡丹雄蕊为研究对象,采用超声波辅助不同体积分数(0%、50%、80%、100%)的乙醇水溶液对其进行提取,探讨雄蕊颜色、发育时期、提取溶剂对滇牡丹雄蕊提取物的化学成分、体外抗氧化和护肤活性的影响,以期为将滇牡丹雄蕊开发为抗氧化、抗皱美白功能食品或药品提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

滇牡丹雄蕊采集于昆明梁王山滇香国色植物园中滇牡丹种质资源收集圃,从滇牡丹植株中选择新鲜的红色(red, R)花药和黄色(yellow, Y)花药的雄蕊进行采样,如图1所示,根据其发育阶段,分为透色期(transmission color period, TP)、初开期(initial opening period, IP)和盛开期(blooming period, BP),采摘后立即放置于带冰袋泡沫箱中迅速运输至实验室,然后真空冷冻干燥处理,并于-80 ℃冰箱保存备用。

奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox),合肥博美生物科技有限责任公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT)、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, PNPG)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-璜酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS),国药集团化学试剂有限公司;曲酸、维生素C、葡萄糖(纯度≥98%)、芦丁(纯度≥98%)、没食子酸(纯度≥98%)、木犀草素-7-O-葡糖糖苷(纯度≥98%)、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(纯度≥98%)、山奈酚(纯度≥98%)、芍药苷(纯度≥98%),上海源叶生物科技有限公司;弹性蛋白酶ELISA检测试剂盒,上海优选生物科技有限公司;酪氨酸酶,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

M205FA体式荧光显微镜,徕卡显微系统;FD-304箱式真空冷冻干燥机,济南骏德仪器有限公司;AX224ZH电子天平,奥豪斯仪器有限公司;200T高速多功能粉碎机,永康市铂欧五金制品有限公司;FVYANG超声波清洗机,深圳福洋科技集团有限公司;S1010E离心机,Hitachi Koki公司;N-1200B旋转蒸发仪,上海泉杰仪器有限公司;Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;TECAN infinite 200 PRO多功能酶标仪,上海迪奥生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 雄蕊提取物的制备

将滇牡丹雄蕊粉碎后过60目筛,准确称取5 g样品,按料液比为1∶20(g∶mL)的比例分别加入体积分数为0%、50%、80%和100%的乙醇溶液,混匀后避光放置12 h,然后在35 ℃条件下超声波辅助提取30 min,4 000 r/min离心15 min并收集滤液;滤渣按同样条件重复提取1次,合并滤液,将滤液抽滤3次后于50 ℃下真空浓缩至浸膏,冻干后即得到雄蕊提取物,以提取物质量除以样品质量计算提取物得率,并置于4 ℃冰箱保存用于后续测定及分析。

2.2 总酚含量(total phenolics content,TPC)测定

参考THAVAMONEY等[18]的方法测定,取100 μL 50 mg/mL的样品溶液于酶标板中,并依次加入50 μL 0.1 mol/L福林酚溶液和100 μL 75 g/L Na2CO3溶液,避光反应30 min后于765 nm测吸光值,同时用各提取溶剂代替Na2CO3溶液做空白。在同等条件下测定质量浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL没食子酸标准品的吸光度,以没食子酸质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=0.009 7X+0.007(R2=0.999 1),根据没食子酸的标准曲线方程计算样品中TPC。

2.3 总黄酮含量(total flavonoids content,TFC)测定

参考HUANG等[19]的方法测定。在室温条件下,取40 μL 50 mg/mL样品溶液,加入20 μL 50 g/L NaNO2溶液,反应6 min,加入20 μL 100 g/L Al(NO3)3溶液,反应6 min,加入140 μL 40 g/L NaOH溶液,反应15 min后立即于510 nm处测定吸光值,以各提取溶剂代替同样体积的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液作为样品对照组。在相同条件下测定质量浓度分别为20、40、80、120、160、200 μg/mL的芦丁标准品溶液的吸光度,以芦丁质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=0.000 9X-0.047 8(R2=0.999 1),根据芦丁标准曲线方程计算样品中TFC。

2.4 抗氧化活性测定

2.4.1 DPPH自由基清除能力

参考GHANE等[20]的方法并作适当修改,在室温条件下取100 μL 50 mg/mL样品溶液和200 μL DPPH溶液充分混合,在96孔酶标板中避光反应30 min,后在517 nm处测定其吸光值。在相同条件下,分别以质量浓度为0、5、10、15、20、25、30 μg/mL的Trolox标准溶液代替样品进行反应,以Trolox的质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=-0.021 6X+0.935 1(R2=0.999),根据Trolox标准曲线方程计算样品DPPH自由基清除能力。同时以维生素C和BHT为阳性对照,提取溶液代替样品反应为空白。

2.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

参考文献[21]的方法并稍作调整。分别配制7 mmol/L ABTS和140 mmol/L过硫酸钾溶液,按体积比625∶11混合后室温避光反应12 h,制得ABTS母液,用溶液稀释母液直至溶液在734 nm下的吸光值为0.70±0.02,得到ABTS工作液。在室温条件下,于96孔酶标板中加入50 μL 50 mg/mL的样品溶液和200 μL ABTS工作液充分混合,避光反应6 min后,在734 nm处测定吸光值。在相同条件下测定质量浓度为0、5、10、15、20、25、30 μg/mL的Trolox的吸光度,以Trolox的质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=-0.012 2X+0.563 6(R2=0.998 3),根据Trolox标准曲线方程计算样品清除ABTS阳离子自由基能力。同时以提取溶液代替样品反应为空白,维生素C和BHT为阳性对照。

2.4.3 铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)

参考PULIDO等[22]的方法测定。分别配制30 mmol/L pH 3.6的乙酸缓冲溶液、10 mmol/L TPTZ工作液及20 mmol/L的FeCl3溶液,将3种溶液以体积比10∶1∶1混匀即得到FRAP工作液。在室温条件下,准确移取50 μL 50 mg/mL样品溶液于酶标板中,加入250 μL FRAP工作液,迅速摇匀后,37 ℃下反应10 min,于593 nm处测定吸光值,同等条件下测定10、20、40、60、80、100 μg/mL FeSO4溶液的吸光度,以FeSO4质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=0.008 5X+0.160 7(R2=0.999 1),根据FeSO4标准曲线方程计算样品的FRAP。同时以提取溶液代替样品反应为空白,维生素C和BHT为阳性对照。

2.5 酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)抑制活性

参照YU等[23]的方法并作修改。在酶标板中依次加入50 μL 50 mg/mL样品溶液、20 μL 100 U/mL Tyr、140 μL 0.5 mmol/L L-DOPA底物混匀,37 ℃恒温水浴15 min后,475 nm处测定吸光度值,以提取溶液代替样品反应为空白,分别以质量浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL的曲酸标准溶液代替样品进行反应,以曲酸质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=-0.003 1X+0.771 8(R2=0.996 4),根据曲酸标准曲线方程计算样品的Tyr抑制能力。

2.6 弹性蛋白酶(elastase,Ela)抑制活性

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定。并参照SHANURA等[24]的方法调整后测定,测定顺序:取出所需板条;样本孔中先加10 μL 50 mg/mL待测样本,再加40 μL样本稀释液;包被;洗板5次;加底物显色;加终止液终止反应,在450 nm处测定各孔的吸光度。以提取溶液代替样品反应为空白,并分别以质量浓度为0、3.75、7.5、15、30、60 μg/mL的曲酸标准溶液代替样品进行反应,以曲酸质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线:Y=0.007 2X+0.611 9(R2=0.995),根据曲酸标准曲线方程计算样品的Ela抑制活性。

2.7 高效液相色谱分析

将样品溶液过0.22 μm有机系滤膜后,使用HPLC进行分析,液相条件如下:色谱柱Silgreen C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B);检测波长280、520 nm;柱温30 ℃,进样量10 μL;流速0.8 mL/min;梯度洗脱条件如表1所示。

样品、标准品溶液制备和测定。称取5 mg滇牡丹雄蕊提取物,使用色谱级甲醇溶液将其配制成质量浓度为5 mg/mL的样品溶液。精准称取异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(isorhamnetin-3-O-glucoside,Is3G)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside,Lu7G)、槲皮素(quercetin,QC)、山奈酚(kaempferol,KP)、儿茶素(catechin,CT)、芦丁(rutin,RT)、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷(cyanidin 3,5-diglucoside chloride,Cy3G5G)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,Cy3G)、芍药素-3,5-二葡萄糖苷(peonidin-3,5-diglucoside chloride,Pn3G5G)、芍药素-3-O-葡萄糖苷(peonidin 3-O-glucoside,Pn3G)、芍药苷(paeoniflorin,PF)标准品各1 mg,使用色谱级甲醇配制成质量浓度分别50、100、200、300、400、500 μg/mL的混合标准品母液。分别将其通过HPLC进行测定,以峰面积(Y)对其进样量(X)进行线性回归。并根据标准曲线方程对滇牡丹雄蕊提取物中所含该物质进行定量定性分析。其各标准品的回归方程分别为:异鼠李素-3-O-葡萄糖苷:Y=82.763X+16.192(R2=0.999 5);木犀草素-7-O-葡糖糖苷:Y=196.33X-72.581(R2=0.999 8);槲皮素:Y=101.34X-59.872(R2=0.999 1);山奈酚:Y=116.54X-26.344(R2=0.999 5);儿茶素:Y=1.290 1X+26.684(R2=0.999 5);芦丁:Y=109.25X-21.184(R2=0.999 2);矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷:Y=20.084X+280.7(R2=0.999 5);矢车菊素-3-O-葡萄糖苷:Y=249.82X-125.43(R2=0.999 6);芍药素-3,5-二葡萄糖苷:Y=48.58X+103.42(R2=0.999 4);芍药素-3-O-葡萄糖苷:Y=128.53X-82.91(R2=0.999 2);芍药苷:Y=9.191 8X-4.060 2(R2=0.999 3)。

2.8 数据处理

所有实验重复3次,结果表示为平均值±标准偏差。数据使用SPSS 24.0统计软件中的单因素方差(ANOVA)进行差异显著性统计分析,P<0.05表示样品间差异显著。利用Origin 2018和欧易生物云平台(https://cloud.oebiotech.com.)作图。

3 结果与分析

3.1 提取条件对滇牡丹雄蕊提取物得率的影响

由表2可知,随着乙醇体积分数的增加,滇牡丹不同颜色雄蕊提取物得率呈先增大后减小的趋势,在乙醇体积分数为50%时其提取率整体而言最高,约为35.70%～41.67%,原因可能是50%的乙醇溶剂极性中等,适合提取植物样本中的活性化合物[25]。对于2种颜色的滇牡丹雄蕊而言,其提取物得率没有显著差异。从滇牡丹花蕾的发育时期来看,其雄蕊提取物得率呈现盛开期>初开期>透色期的趋势,表明滇牡丹雄蕊中可溶出成分随着花蕾的发育成熟而逐步积累,该结果可为实际生产中雄蕊的采摘时期确定提供依据。

3.2 提取条件对滇牡丹雄蕊提取物TPC的影响

由图2可知,提取条件对滇牡丹雄蕊提取物TPC存在显著影响。随着乙醇体积分数的增加,滇牡丹雄蕊提取物总酚含量均呈现先升高后降低的趋势,在体积分数为50%的乙醇提取物中TPC最高,约为(120.70～130.94)mg GAE/g DE,可能是滇牡丹雄蕊中的酚类物质更易在中浓度的乙醇溶液中溶出[26]。2种颜色雄蕊的TPC之间无显著差异,且均随花瓣发育的进行而逐渐增加。红色雄蕊中TPC在盛开期最高,为130.94 mg GAE/g DE,是透色期的25.62 mg GAE/g DE的5.11倍。孔凡等[27]对凤丹牡丹和张蕾等[28]对金花茶的研究中也发现了类似的结果,即随着花瓣的发育,其TPC逐渐增加,在盛开期最高。

3.3 提取条件对滇牡丹雄蕊提取物TFC的影响

由图3可知,与TPC的变化趋势一致,2种颜色滇牡丹雄蕊提取物的TFC均在体积分数为50%乙醇时最高,与陈庆敏等[7]对牡丹花蕊的研究结果一致。从发育时期看,其含量高低趋势依次为盛开期>初开期>透色期,其中红色雄蕊和黄色雄蕊在盛开期TFC最高,分别为97.76、89.55 mg RT/g DE,约为透色期的2倍。但付磊[29]发现“凤丹”牡丹花瓣的TFC高低为露色期>初绽期>始衰期>盛开期>半开期,这可能是种和花器官之间的差异导致。

3.4 滇牡丹雄蕊提取物抗氧化活性评价

3.4.1 DPPH自由基清除能力

如图4-a所示,体积分数50%的乙醇滇牡丹雄蕊提取物的DPPH自由基清除能力最强,均显著高于其他体积分数的乙醇。整体来看,红色雄蕊提取物的DPPH自由基清除能力要稍高于黄色雄蕊,且均随着花瓣发育的进行而逐渐升高,在盛开期最强,分别为460.83和413.61 μg Trolox/g DE,而体积分数为0%的乙醇提取的DPPH自由基清除能力分别为29.97和26.31 μg Trolox/g DE,差异极其显著。原因可能是50%乙醇提取物中的酚类、黄酮类化合物含量最高,而抗氧化能力与总酚、黄酮含量密切相关[30]。本研究结果也与傅茂润等[31]的报道一致。

3.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力

ABTS是一种人工合成自由基[32],被广泛应用于评估植物的抗氧化能力。由图4-b可知,滇牡丹雄蕊提取物的ABTS阳离子自由基清除能力同样随其发育的进行而增强,在盛开期最高。但与DPPH自由基清除能力不同的是,红色雄蕊提取物的ABTS阳离子自由基清除能力普遍要低于黄色雄蕊。其中红色雄蕊在初开期时体积分数为50%乙醇时最高,为426.06 μg Trolox/g DE;在盛开期时体积分数80%乙醇提取物更高,但与50%乙醇没有显著差异。对于黄色雄蕊,其在初开期和盛开期则是体积分数80%乙醇提取物的ABTS阳离子自由基清除能力最高,其次是50%的乙醇提取物,这与关宁宁[33]的研究结果类似。

3.4.3 FRAP

如图4-c所示,乙醇体积分数为50%时,滇牡丹雄蕊提取物的FRAP最高为1 000.06 μg Trolox/g DE,纯水提物的铁还原活性最低。此外,红色雄蕊提取物的FRAP整体高于黄色雄蕊提取物。滇牡丹雄蕊提取物的FRAP随其发育时期进行而增强,其中盛开期的FRAP是透色期的近5倍,可能是盛开期的滇牡丹雄蕊中的黄酮类化合物含量最高[34-35]。

3.5 滇牡丹雄蕊提取物的酶抑制力分析

3.5.1 Tyr抑制活性

Tyr是一种调控黑色素生成的限速酶,在食品、医药和美容等领域具有广泛的应用前景[36]。如图5所示,当乙醇的体积分数为50%时,滇牡丹雄蕊提取物的Tyr抑制活性最强,而0%乙醇提物的抑制活性最差。这说明滇牡丹雄蕊中可以抑制Tyr的活性物质,更容易溶于极性小的乙醇溶剂[37-38]。同样,发育时期对滇牡丹雄蕊的Tyr抑制能力影响较大。其中红色滇牡丹雄蕊提取物的Tyr抑制能力在3个时期最高分别为248.82、306.24、365.25 μg KA/g DE,而黄色雄蕊则分别为240.50、284.43、304.85 μg KA/g DE。上述结果说明滇牡丹雄蕊可以作为Tyr抑制剂资源进行开发,但其具体成分和作用机制需要进一步研究。

3.5.2 Ela抑制活性

人体皮肤的Ela过度表达会促使皮肤的弹性蛋白过度水解,导致皮肤产生皱纹而逐渐失去弹性,发生老化[39]。由图6可知,不同体积分数乙醇的滇牡丹雄蕊提取物对Ela的抑制活性依次为:50%乙醇>80%乙醇>0%乙醇>100%乙醇,且红色和黄色滇牡丹雄蕊的抑制能力最强分别为49.73、40.97 μg KA/g DE。同样,盛开期的滇牡丹雄蕊提取物对Ela的抑制活性最强。综上表明,滇牡丹雄蕊具有潜在的抗衰老活性,原因可能与其富含芦丁等活性成分有关,芦丁可通过多种作用力与Ela之间形成稳定的复合物,从而抑制Ela的活性[40]。

3.6 HPLC分析结果

据文献报道,木犀草素、异鼠李素、槲皮素、儿茶素和芍药苷等是滇牡丹雄蕊中的主要活性成分[41],具有抗氧化、抗炎、降血脂、酶抑制、保护心血管等生物活性[6],故选择以上化合物对滇牡丹雄蕊提取物的活性成分分布进行检测。如表3所示,11种化合物均被检测出,且在不同发育阶段、不同处理条件下差异显著,其含量高低顺序为:儿茶素>山奈酚>槲皮素>芍药苷>矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷>芍药素-3,5-二葡萄糖苷>异鼠李素-3-O-葡萄糖苷>木犀草素-7-O-葡萄糖苷>芦丁>芍药素-3-O-葡萄糖苷>矢车菊素-3-O-糖糖苷。其中,体积分数为50%的乙醇提取物时,红色雄蕊盛开期儿茶素黄酮类化合物含量最高为10.93 mg/g,其次是山奈酚和槲皮素,分别为2.44和2.38 mg/g。黄色雄蕊盛开期黄酮类化合物含量则是儿茶素>槲皮素>山奈酚,分别为9.45、2.50和1.76 mg/g,且2种颜色雄蕊提取物的化合物含量均比透色期高了近2倍。但透色期的花青素含量显著高于盛开期,特别是雄蕊提取物中的矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷和芍药素-3,5-二葡萄糖苷化合物,其透色期含量为1.07和1.09 mg/g,而盛开期含量分别0.81和0.77 mg/g。这些花青素是通过类黄酮途径合成的色素,具有很强的抗氧化活性[42]。另外,在滇牡丹雄蕊提取物检测出的这些化合物中(图7-a),2种颜色雄蕊的黄酮类化合物随其发育阶段动态累积,而化合物含量最高的集中于体积分数为50%和80%的乙醇溶液中,但体积分数为50%乙醇提取物的化合物含量显著最高,水提物的整体最低。表明乙醇溶液作为溶剂提取滇牡丹中的类黄酮效率最高[12]。

3.7 相关性分析结果

进一步将滇牡丹雄蕊提取物的功能活性与各化合物进行关联分析,如图8-b所示,将滇牡丹雄蕊提取物的功能活性与11种化合物之间进行了Spearman关联性分析,其化合物矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与抗氧化活性指标显著正相关。其中,DPPH自由基清除能力与芦丁、儿茶素、山奈酚、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷极显著正相关(P<0.01);Ela抑制活性与化合物山奈酚显著负相关,Tyr抑制活性与儿茶素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-5-二葡萄糖苷,这说明其功能活性受化合物共同作用。另外,滇牡丹雄蕊提取物的抗氧化活性与TPC、TFC显著正相关,ABTS阳离子自由基清除能力与TFC极显著正相关(图8-b)。表明滇牡丹雄蕊提取物中的这些化合物在发挥抗氧化和酶抑制活性中起关键作用。

4 结论

本研究以不同体积分数(0%、50%、80%、100%)的乙醇水溶液超声波辅助提取滇牡丹雄蕊,并测定其提取物的主要活性成分与体外抗氧化活性以及酶抑制能力的关系。结果显示,在体积分数为50%乙醇溶液作为提取溶剂时,滇牡丹雄蕊的提取率最高,其抗氧化活性和Tyr抑制活性、Ela抑制活性最强,且各化合物成分含量高低顺序为:儿茶素>山奈酚>异鼠李素-3-O-葡萄糖苷>槲皮素>芍药苷>芦丁>芍药素-3,5-二葡萄糖苷>矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷>木犀草素-7-O-葡萄糖苷>芍药素-3-O-葡萄糖苷>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。且3个发育阶段的滇牡丹雄蕊提取物均具有较高的抗氧化活性和Tyr、Ela抑制能力,在盛开期时最佳。另外,滇牡丹雄蕊提取物的抗氧化能力与TPC、TFC、儿茶素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚、木犀草素-7-O-葡萄糖苷显著正相关,Tyr抑制活性与儿茶素和芍药素-3,5-二葡萄糖苷显著相关,其Ela活性与儿茶素、山奈酚和芦丁显著相关。另外,滇牡丹中红色雄蕊提取物在活性化合物含量和生物活性上都高于黄色雄蕊提取物。结果表明滇牡丹雄蕊尤其是红色雄蕊具有被开发为天然的抗氧化剂、Tyr和Ela抑制剂的潜力。本论文可以为滇牡丹不同颜色雄蕊在抗氧化、抗皱美白功能食品、药品等的方面开发利用提供基础数据和理论依据。

参考文献

[1] 潘温文. 中国西南地区特有野生花卉:滇牡丹[J].园林, 2015(12):56-58.PAN W W.Paeonia yunnanensis, a unique wild flower in southwest China[J].Garden, 2015(12):56-58.

[2] 李树发, 蔡艳飞, 张秀新, 等.滇牡丹天然群体的表型多样性[J].西南农业学报, 2016, 29(10):2470-2478.LI S F, CAI Y F, ZHANG X X, et al.Phenotypic diversity of natural populations of Paeonia delavayi[J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2016, 29(10):2470-2478.

[3] 侯泽豪, 王书平, 魏淑东, 等.植物花青素生物合成与调控的研究进展[J].广西植物, 2017, 37(12):1603-1613.HOU Z H, WANG S P, WEI S D, et al.Anthocyanin biosynthesis and regulation in plants[J].Guihaia, 2017, 37(12):1603-1613.

[4] 蒋至立, 耿兴敏, 祝遵凌, 等.牡丹杂交育种研究进展[J].分子植物育种, 2023, 21(2):602-619.JIANG Z L, GENG X M, ZHU Z L, et al.Research progress on cross breeding of tree peony[J].Molecular Plant Breeding, 2023, 21(2):602-619.

[5] 普甜, 宋静, 张志华, 等.大田培育滇牡丹实生苗分级标准及不同种源苗期生长评价研究[J].安徽农业科学, 2022, 50(24):98-102.PU T, SONG J, ZHANG Z H, et al.Study on the grading standards of seedlings of Paeonia delavayi and seedling growth evaluation of different provenances[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2022, 50(24):98-102.

[6] 史倩倩. 基于转录组测序滇牡丹花色形成分子调控机理研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2015.SHI Q Q. Studies on the molecular mechanism of Paeonia delavayi flower color formation[D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2015.

[7] 陈庆敏, 闫琰, 程媛媛, 等.牡丹雄蕊的抗氧化活性及酚类成分分析[J].食品科技, 2017, 42(4):198-200.CHEN Q M, YAN Y, CHENG Y Y, et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of peony stamens[J].Food Science and Technology, 2017, 42(4):198-200.

[8] 程丹丹, 高德民, 陈金金, 等.牡丹花蕊全营养速溶茶粉的研制[J].中国食品添加剂, 2022, 33(9):120-128.CHENG D D, GAO D M, CHEN J J, et al.Preparation of Paeonia suffruticosa Andr.stamens total nutrient instant tea powder[J].China Food Additives, 2022, 33(9):120-128.

[9] 赵海军, 傅茂润.牡丹雄蕊的营养成分研究[J].山东林业科技, 2010, 40(5):24-27.ZHAO H J, FU M R.Analysis of nutritional components in stamen of peony[J].Journal of Shandong Forestry Science and Technology, 2010, 40(5):24-27.

[10] 成梦琳. 牡丹、芍药雄蕊茶制作及其抗氧化、抗衰老功能研究[D].扬州:扬州大学, 2019.CHENG M L.Study on production process and functions of anti-oxidation and anti-aging of tree penoy and herbaceous peony stamen teas[D].Yangzhou:Yangzhou University, 2019.

[11] 徐慧, 姚霞珍, 佟珂珂, 等.3种牡丹花器官不同部位挥发性成分分析[J].南京林业大学学报(自然科学版), 2023, 47(3):63-69.XU H, YAO X Z, TONG K K, et al.Analysis of volatile components in different parts of flower organs of three species of tree peony[J].Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition), 2023, 47(3):63-69.

[12] BAI Z Z, YU R, TANG J M, et al.Comparative investigation on metabolites and biological activities of Paeonia ostii stamens from different geographical regions of China[J].Industrial Crops and Products, 2021, 172:114038.

[13] 罗磊, 关宁宁, 杨永庆, 等.牡丹花蕊黄酮对H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用[J].食品科学, 2018, 39(21):142-148.LUO L, GUAN N N, YANG Y Q, et al.Protective effect of flavonoids from peony stamens on hydrogen peroxide-induced toxicity in RAW264.7 cells[J].Food Science, 2018, 39(21):142-148.

[14] 谢勇, 周宁, 李家华.红茶、白茶水提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[J].普洱学院学报, 2023, 39(3):12-15.XIE Y, ZHOU N, LI J H.On the inhibition of tyrosinase activity by water extracts of black tea and white tea[J].Journal of Pu’er University.2023, 39(3):12-15.

[15] 沈晓佳, 赵黎明, 周家春, 等.紫娟茶提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].食品工业科技, 2012, 33(24):75-80.SHEN X J, ZHAO L M, ZHOU J C, et al.Inhibitory effect of extract from Zijuan tea on tyrosinase activity[J].Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(24):75-80.

[16] 官兴丽. 儿茶素对黑色素形成抑制效果初探[D].重庆:西南大学, 2011.GUAN X L.Inhibitory effect of catechins on the formation of melanin[D].Chongqing:Southwest University, 2011.

[17] PATRA A, ABDULLAH S, PRADHAN R C.Review on the extraction of bioactive compounds and characterization of fruit industry by-products[J].Bioresources and Bioprocessing, 2022, 9(1):14.

[18] THAVAMONEY N, SIVANADIAN L, TEE L, et al.Extraction and recovery of phytochemical components and antioxidative properties in fruit parts of Dacryodes rostrata influenced by different solvents[J].Journal of Food Science and Technology, 2018, 55(7):2523-2532.

[19] HUANG R, WU W Y, SHEN S Y, et al.Evaluation of colorimetric methods for quantification of citrus flavonoids to avoid misuse[J].Analytical Methods, 2018, 10(22):2575-2587.

[20] GHANE S, ATTAR U, YADAV P B, et al.Antioxidant, anti-diabetic, acetylcholinesterase inhibitory potential and estimation of alkaloids (lycorine and galanthamine) from Crinum species:An important source of anticancer and anti-Alzheimer drug[J].Industrial Crops and Products, 2018, 125:168-177.

[21] WANG J, CAO B, ZHAO H P, et al.Emerging roles of Ganoderma lucidum in anti-aging[J].Aging and Disease, 2017, 8(6):691-707.

[22] PULIDO R, BRAVO L, SAURA-CALIXTO F.Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(8):396-3402.

[23] YU Q, FAN L P.Antityrosinase and antioxidant activity of asparagus and its inhibition on B16F10 melanoma cells before and after hydrothermal treatment[J].Food Bioscience, 2021, 41:101026.

[24] SHANURA FERNANDO I P, ASANKA SANJEEWA K K, SAMARAKOON K W, et al.The potential of fucoidans from Chnoospora minima and Sargassum polycystum in cosmetics:Antioxidant, anti-inflammatory, skin-whitening, and antiwrinkle activities[J].Journal of Applied Phycology, 2018, 30(6):3223-3232.

[25] BHEBHE M, FÜLLER T N, CHIPURURA B, et al.Effect of solvent type on total phenolic content and free radical scavenging activity of black tea and herbal infusions[J].Food Analytical Methods, 2016, 9(4):1060-1067.

[26] SUNAGAR R R, SREERAMA Y N.Implication of solvent polarities on browntop millet (Urochloa ramosa) phenolic antioxidants and their ability to protect oxidative DNA damage and inhibit α-amylase and α-glucosidase enzymes[J].Food Chemistry, 2023, 411:135474.

[27] 孔凡, 郝青, 刘政安, 等.凤丹牡丹花朵不同发育时期挥发性成分积累规律与蒸馏工艺研究[J].亚热带植物科学, 2021, 50(6):447-453.KONG F, HAO Q, LIU Z A, et al.Accumulation mechanism of volatile components and distillation techniques of flowers at different developmental stages of Paeonia ostii[J].Subtropical Plant Science, 2021, 50(6):447-453.

[28] 张蕾, 倪穗, 李纪元, 等.金花茶不同时期花瓣营养与生物活性成分分析[J].林业科学研究, 2019, 32(2):32-38.ZHANG L, NI S, LI J Y, et al.Analysis on the nutrients and bioactive components of petals in different floral stages of Camellia nitidissima[J].Forest Research, 2019, 32(2):32-38.

[29] 付磊.‘凤丹’牡丹花色素组成成分及抗氧化能力分析[D].杨凌:西北农林科技大学, 2015.FU L.Study on plgment composition of flowers in Paeoniel ostiii dan and its antioxidation analysis[D].Yangling:Northwest A&F University, 2015.

[30] TSANTILI E, KONSTANTINIDIS K, CHRISTOPOULOS M V, et al.Total phenolics and flavonoids and total antioxidant capacity in pistachio (Pistachia vera L.) nuts in relation to cultivars and storage conditions[J].Scientia Horticulturae, 2011, 129(4):694-701.

[31] 傅茂润, 刘峰, 赵海军, 等.牡丹雄蕊的营养成分和抗氧化能力研究[J].中国食物与营养, 2011, 17(5):71-74.FU M R, LIU F, ZHAO H J, et al.Analysis of nutritional components and antioxidant activity of peony stamen[J].Food and Nutrition in China, 2011, 17(5):71-74.

[32] WANG Z X, JIN X M, ZHANG X C, et al.From function to metabolome:Metabolomic analysis reveals the effect of probiotic fermentation on the chemical compositions and biological activities of Perilla frutescens leaves[J].Frontiers in Nutrition, 2022, 9:933193.

[33] 关宁宁. 牡丹花蕊醇提物的生物活性研究[D].洛阳:河南科技大学, 2019.GUAN N N.Study on biological activity of alcohol extract of peony stamen[D].Luoyang:Henan University of Science and Technology, 2019.

[34] 陈涛, 何磊, 林燕.头花蓼不同提取物的抗氧化、抗炎及抗菌活性[J].贵州医科大学学报, 2023, 48(1):43-47;62.CHEN T, HE L, LIN Y.Antioxidant, anti-inflammatory,and antibacterial activity of different extracts of Polygonum capitatum[J].Journal of Guizhou Medical University, 2023, 48(1):43-47;62.

[35] 王晓宇, 杜国荣, 李华.抗氧化能力的体外测定方法研究进展[J].食品与生物技术学报, 2012, 31(3):247-252.WANG X Y, DU G R, LI H.Progress of analytical methods for antioxidant capacity in vitro[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2012, 31(3):247-252.

[36] 杨圆慧, 徐柠檬, 资璐熙, 等.云南小粒咖啡果皮不同溶剂提取物主成分分析及其抗氧化活性研究[J].食品科技, 2023, 48(2):230-238;245.YANG Y H, XU N M, ZI L X, et al.Principal component analysis and antioxidant activities of different solvent extracts from Coffea arabica pericarp[J].Food Science and Technology, 2023, 48(2):230-238;245.

[37] 曾亮, 吴靓靓, 官兴丽, 等.儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用[J].食品科学, 2010, 31(23):310-313.ZENG L, WU L L, GUAN X L, et al.Inhibitory effect of catechins on potato tyrosinase[J].Food Science, 2010, 31(23):310-313.

[38] 胡宇航, 陈梁, 罗翌元, 等.三叶青茎部不同溶剂提取物的功能成分、抗氧化及酪氨酸酶抑制活性研究[J].食品安全质量检测学报, 2023, 14(10):173-181.HU Y H, CHEN L, LUO Y Y, et al.Functional components, antioxidant activity and tyrosinase inhibitory activity of extracts from different solvent extracts from stems of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg[J].Journal of Food Safety &Quality, 2023, 14(10):173-181.

[39] 张宇涵, 周靖萱, 张南海, 等.胶原蛋白肽与弹性蛋白肽对改善皮肤光老化的研究进展[J].食品研究与开发, 2023, 44(11):208-216.ZHANG Y H, ZHOU J X, ZHANG N H, et al.Advances in ameliorating effects of collagen peptides and elastin peptides on photoaged skin[J].Food Research and Development, 2023, 44(11):208-216.

[40] 姚红柳, 付金凤, 尹广婷, 等.芦丁与弹性蛋白酶相互作用的研究[J].化学试剂, 2022, 44(1):46-51.YAO H L, FU J F, YIN G T, et al.Study on the interaction between rutin and elastase[J].Chemical Reagents, 2022, 44(1):46-51.

[41] 吴震生, 侯昌, 毛文岳.牡丹花蕊中总黄酮的提取与测定[J].食品与药品, 2013, 15(5):344-345.WU Z S, HOU C, MAO W Y.Extraction and determination of total flavonoids from peony stamens and pistils[J].Food and Drug, 2013, 15(5):344-345.

[42] LUO D, XIONG C, LIN A H, et al.SlBBX20 interacts with the COP9 signalosome subunit SlCSN5-2 to regulate anthocyanin biosynthesis by activating SlDFR expression in tomato[J].Horticulture Research, 2021, 8(1):163.

Chemical composition, in vitro antioxidant, and skin-protective activities of Paeonia delavayi Franch stamen extract

LI Jin1, DAI Manting1, MOU Yaping1, DU Chun2, WANG Juan3*, WANG Zhenxing4*

1(College of landscape architecture and Horticulture, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)2(College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)3(Eco-Development Academy, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)4(College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

ABSTRACT This study aimed to comprehensively analyze the chemical composition and biological activities of Paeonia delavayi Franch stamens by selecting red and yellow stamens at different developmental stages, including the transparent, initial blooming, and full blooming stages.Extraction was carried out using ethanol-water solutions with varying volume fractions (0%, 50%, 80%, and 100%).The total flavonoid and total phenolic contents of different Paeonia delavayi Franch stamen extracts were measured.The antioxidant activities were assessed in vitro by measuring the scavenging abilities of DPPH free radicals and ABTS cationic radicals, as well as ferric reducing power.The skin-protective activities were evaluated by measuring tyrosinase inhibition and elastase inhibition.Moreover, the chemical composition was analyzed via high-performance liquid chromatography (HPLC).Results demonstrated that the extraction rate, total phenolic and flavonoid contents, as well as the activities of antioxidant, tyrosinase inhibition, and elastase inhibition were highest in Paeonia delavayi Franch stamens when the ethanol volume fraction was 50%.In general, the chemical composition, in vitro antioxidant activities, and skin-protective activities of Paeonia delavayi Franch stamens exhibited dynamic accumulation and enhancement throughout the developmental stages, with the full blooming stage having the highest levels.Furthermore, the red stamens displayed superior chemical composition and biological activities compared to their yellow counterparts.Through HPLC, eleven compounds were identified.Of which, paeoniflorin, gallic acid, rutin, quercetin, and catechin were the primary phenolic compounds in Paeonia delavayi Franch stamens.This study offers a theoretical foundation for the development and application of Paeonia delavayi Franch stamens in various domains, including antioxidants, anti-wrinkle agents, and skin whitening treatments.

Key words Paeonia delavayi Franch;stamen;chemical composition;antioxidant activity;tyrosinase inhibitory activity;elastase inhibitory activity

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037326

引用格式：李进,代嫚婷,牟亚萍,等.滇牡丹雄蕊提取物的化学成分、体外抗氧化和护肤活性研究[J].食品与发酵工业,2024,50(17):186-197.LI Jin, DAI Manting, MOU Yaping, et al.Chemical composition, in vitro antioxidant, and skin-protective activities of Paeonia delavayi Franch stamen extract[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(17):186-197.

第一作者：硕士研究生(王娟教授与王振兴副教授为共同通信作者,E-mail:schima@163.com;wangzhenxingfood@163.com)

基金项目：云南省重大基础专项生物资源数字化开发应用项目(202002AA100007);云南省千人计划“高层次人才”专项(2019);云南省万人计划“云岭产业技术领军人才”专项(2018-212);云南省中央引导地方科技发展资金项目(202207AB110015)

收稿日期：2023-09-10,改回日期:2023-10-16