牦牛生长在四川、青海、新疆、西藏等地[1]。牦牛肉是含有大量蛋白质、矿物质、氨基酸且脂肪含量较低的天然绿色食品[2-3]。但是,牦牛主要分布在海拔3 000 m以上的青藏高原地区,较长时间的运输易导致牦牛肉及其制品在运输过程中受到微生物污染及酶的活性、催化氧化和自溶性等因素的影响而腐败变质。因此,如何处理牦牛肉及其制品以延长货架期,已经成为特色牦牛肉制品的研究重点[4]。防止牦牛肉及其制品腐败变质的方法多种多样,常见的方法是向肉中加入抗氧化剂,其不仅可以和牦牛肉共存,还不影响其肌肉色泽和风味,更主要的是能够有效延长牦牛肉及其制品的保质期,达到贮藏保鲜效果。抗氧化剂根据其来源可以分为天然抗氧化剂和化学合成抗氧化剂,天然抗氧化剂较化学合成的抗氧化剂更具安全性,天然抗氧化剂通常是从天然资源中提取的,通常含有丰富的营养物质和生物活性成分,包括维生素、矿物质、多酚类化合物等,生物利用率更高,其中包含的物质之间可以发生协同作用,相互促进抗氧化的效果,并且天然抗氧化剂通常具有更长的持久性和稳定性,所以天然抗氧化剂是目前食品保鲜领域研究的重要方向。
天然多酚是一类天然抗氧化剂,具有抗氧化、抗炎和抗菌等特性。许多研究表明,天然植物多酚的这些特性可以有效提高动物肉类的品质,延缓脂肪的氧化,延长肉类产品的保质期[5]。植物多酚是延长牦牛肉贮藏期的重要抗氧化剂之一,其不仅容易获取,而且对人体的副作用更是微乎其微。因此,天然抗氧化剂植物多酚是延长牦牛肉保质期的极佳选择。王晓晶[6]的研究发现茶多酚因为含有酚羟基,可以直接作用于自由基,具有很好的抗氧化能力,一定量的茶多酚可以抑制细菌的生长繁殖,维持果蔬色泽,从而达到保鲜的目的。有研究发现,姜黄素能够调节免疫系统中的各种免疫细胞反应以及生长,包括树突细胞、中性粒细胞、淋巴细胞,自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞来增强免疫性能[7]。刘会平等[8]研究发现,在一定添加量下,白藜芦醇-葡萄多酚复方美白液能抑制B16细胞增殖、蛋白表达量和酪氨酸酶活性,从而减少黑色素的生成。
因此本研究将不同种类的植物多酚(茶多酚、儿茶素、姜黄素、葡萄多酚)添加到牦牛肉糜中混匀,并在4 ℃条件下按时间段将其分为5个组,冷藏1、3、5、7、9 d,并分别在这5个时间点提取牦牛肉糜肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP),测定羰基、巯基、二聚酪氨酸和表面疏水性指标,还测定其MP溶解度、乳化活性、乳化稳定性、二级结构和三级结构相关指标,探究不同植物多酚对牦牛肉冷藏过程中氧化特性、功能特性和蛋白结构的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牦牛肉背最长肌、大豆油,成都当地肉品市场;儿茶素,山东齐鲁生物科技公司;姜黄素,西安新生源生物科技;茶多酚、葡萄多酚(纯度均为98%,食品级),郑州金诺生物科技公司;磷酸钠、溴酚蓝、盐酸、乙醇、质量分数为20%的三氯乙酸,成都市科隆化学品有限公司;2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH),成都西亚化工股份有限公司;乙酸乙酯,福晨(天津)化学试剂有限公司;盐酸胍,上海源叶生物有限公司;2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid, DTNB)试剂,阿拉丁试剂(上海)有限公司;质量分数为0.1%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液、上海贝万塔生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA114A分析电子天平,上海奔普仪器科技公司;FSH-2A可调高速组织匀浆机,金坛市华城海龙试验仪器厂;MATTHAUS pH-STAR便携式pH值测定仪,德国Ingenieurhuro R.Matthaus公司;V-1000可见光分光光度计,翱艺仪器(上海)有限公司;F-4700荧光分光光度计、FD-1A-50型冻干机,北京博益康实验仪器有限公司;5804R冷冻离心机,德国Eppendorf公司;傅里叶红外光谱仪,美国PerkinElmer公司。
1.3 试验方法
1.3.1 牦牛肉糜制备
将新鲜牦牛肉背最长肌的结缔组织和多余的脂肪剔除,并把牦牛肉切成较为均匀、大小合适的肉块,使用绞肉机将牦牛肉搅碎,搅至肉糜即可,按牛肉与水料液比为1∶10(g∶mL)混合。将制作好的牦牛肉糜分成五等分,空白组无添加,其余4份分别加入0.2 g/kg的茶多酚、儿茶素、姜黄素、葡萄多酚,搅拌均匀后,将5种样品分别五等分,放入自封袋中,标记为1、3、5、7、9 d,排气密封,放置于4 ℃冰箱中保存。
1.3.2 MP的提取
参考PARK等[9]的方法略作修改,牛肉与标准盐溶液按料液比为1∶4(g∶mL)混匀,8 000 r/min高速均质1 min,离心(4 ℃,15 min,2 000×g),弃去上清液,重复上述操作,共3次。所得沉淀用4倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液溶解,再次匀浆后,使用4层纱布过滤,去除结缔组织,再次离心并弃去上清液,收集到的沉淀物质就是MP。
1.3.3 MP氧化特性
参考扈莹莹等[10]的方法略作修改,总羰基含量按公式(1)计算:
总羰基含量
(1)
式中:A370,370 nm波长处吸光度;N,稀释倍数;ε,摩尔吸光系数,取22 000 mol/(L·cm);ρ,蛋白质质量浓度,mg/mL。
参照SRINIVASAN等[11]的方法,总巯基含量按公式(2)计算:
总巯基含量
(2)
式中:A412,412 nm波长处吸光度;ε,摩尔吸光系数取11 400 mol/(L·cm);n,稀释倍数。
参考邓思杨等[12] 的方法,以吸光值与蛋白浓度的比值作为最终二聚酪氨酸含量,为相对荧光值,并按公式(3)计算,测定3次取平均值。
相对荧光值
(3)
式中:ρ,蛋白质溶液质量浓度,mg/mL。
参考WANG等[13]的方法,在595 nm波长处测定吸光度,以溴酚蓝结合量表示表面疏水性指数,并按公式(4)计算:
表面疏水性
(4)
式中:A0,磷酸盐缓冲液吸光度;A1,样品溶液吸光度。
1.3.4 MP功能特性
1.3.4.1 MP溶解性
用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(0.6 mol/L NaCl,pH 6.0)将MP制备成5.0 mg/mL的悬浊液。4 ℃静置1 h,随后离心(2 000×g,20 min),取上清液测定蛋白质量浓度,按公式(5)计算溶解度,重复测定3次,结果取平均值。
蛋白质溶解性
(5)
1.3.4.2 乳化活性和乳化稳定性
参考LI等[14]的方法。MP匀浆液的乳化活性指数和乳化稳定性指数分别按公式(6)、公式(7)计算:
乳化活性指数
(6)
乳化稳定性指数
(7)
式中:φ,油相体积分数,20%;ρ,蛋白质质量浓度,mg/mL;A0,500 nm波长处测定的吸光度;A10,将稀释乳液放置3 h再取0.050 mL进行同样的处理后测定的吸光度。
1.3.5 MP二级结构
参考YANG等[15]的方法略作修改,制备好的高浓度蛋白溶液,需提前于-80 ℃预冻。冻干后的样品需碾碎成粉末状,可以用研磨杵碾压后揉搓。傅里叶红外光谱仪测试:测定范围波数4 000～400 cm-1,分辨率5 cm-1,扫描次数32次,测试温度为室温25 ℃。用傅里叶红外光谱仪检测肉糜中蛋白结构特性。
1.3.6 MP三级结构
参考WANG等[16]的试验方法并稍作修改。用磷酸盐缓冲液(20 mmol/L, pH 6.0)调节MP质量浓度至0.5 mg/mL,用荧光分光光度计记录300～400 nm波长处的光谱,激发波长295 nm,扫描速率1 200 nm/min。
1.4 数据处理
数据使用Excel、SPSS 22.0、Peak Fit EXE软件汇总处理,采用Origin 2022作图,采用沃勒-邓肯齐性检验方法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 添加不同种类植物多酚对牦牛肉糜MP氧化特性的影响
2.1.1 MP总羰基含量
蛋白质被氧化的过程中会产生一些氧化产物,最主要的产物之一是羰基,因此蛋白质发生氧化的程度可用羰基含量来评判[17]。如图1所示,与空白组相比,添加茶多酚、儿茶素和姜黄素的牦牛肉在不同天数呈现出相似的变化趋势,在7 d和9 d时,各组羰基含量均显著高于1 d时的羰基含量(P<0.05),说明MP氧化程度加重,这与潘君慧[18]的研究结果类似。在1 d和3 d时,葡萄多酚组的羰基含量显著低于空白组(P<0.05),分别为32.46和26.05 nmol/mg;在5 d时,添加葡萄多酚的牦牛肉MP总羰基含量与空白组相比较无明显差异;在7 d时,添加植物多酚牦牛肉MP总羰基含量显著降低(P<0.05),其中添加姜黄素和添加葡萄多酚的效果更为明显,说明4种多酚均具有一定的抗氧化功能,能有效阻止蛋白质的羰基链式反应,去除羟自由基,阻碍羰基的形成;在9 d时,添加儿茶素、姜黄素和葡萄多酚的牦牛肉MP总羰基含量显著低于空白组(P<0.05)。
图1 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP总羰基含量的影响
Fig.1 Effects of different plant polyphenols on total carbonyl content of MP in yak meat
注:不同小写字母表示不同植物多酚处理组在同一时间段指标差异显著;不同大写字母表示同一植物多酚处理组在不同时间段指标差异显著(P<0.05)(下同)。
综上所述,添加不同植物多酚可以有效降低冷藏过程中牦牛肉MP总羰基含量且姜黄素和葡萄多酚对降低总羰基含量的效果更好,这可能是因为植物多酚可能提高了其与蛋白的交联程度,保护蛋白质不被自由基攻击,因而羰基含量降低[19]。
2.1.2 MP总巯基含量
巯基有着较强的抗氧化活性,一旦被氧化,极易形成—SOH、—SOOH、—SS—等氧化产物,造成巯基含量的下降,与蛋白氧化程度呈现出负相关关系[20]。如图2所示,在冷藏期间,各组牦牛肉MP总巯基含量先降低后增高。在1 d时,添加儿茶素和姜黄素的牦牛肉MP总巯基含量显著低于空白组(P<0.05),其中姜黄素组变化最为显著(P<0.05),为86.14 nmol/mg;在3 d时,姜黄素组和葡萄多酚组的牦牛肉MP总巯基含量显著低于空白组(P<0.05);在5 d时,茶多酚、儿茶素和葡萄多酚组的牦牛肉MP总巯基含量显著低于空白组(P<0.05);在7 d和9 d时,儿茶素和葡萄多酚的牦牛肉MP总巯基含量显著降低(P<0.05)。
图2 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP总巯基含量的影响
Fig.2 Effect of adding different kinds of plant polyphenols on total sulfhydryl content of MP in yak meat
随着时间的延长,空白组的牦牛肉MP总巯基含量显著增高(P<0.05);茶多酚能很好抑制巯基的增加,在5、9 d时总巯基含量显著下降(P<0.05);儿茶素组的牦牛肉MP总巯基含量在5 d时显著低于1 d(P<0.05);葡萄多酚组的牦牛肉MP总巯基含量在3、5、7 d时显著降低(P<0.05)。综上所述,茶多酚、儿茶素和葡萄多酚在短期内抗氧化效果更好。这可能是因为多与蛋白之间发生交联反应,即酚类化合物结构中的羟基容易被氧化成醌,蛋白质的巯基会与其发生交联形成巯基-醌加成物,从而使巯基含量降低[21]。
2.1.3 MP二聚酪氨酸含量
蛋白质在氧化过程中会形成二聚酪氨酸,二聚酪氨酸是酪氨酸在氧化条件下被自由基所攻击而形成的[22]。因此,以二聚酪氨酸的含量来判断蛋白质是否发生氧化,二聚酪氨酸含量越高,那么蛋白氧化程度越高[23]。如图3所示,与空白组作对照,在1 d时,茶多酚组和儿茶素组的MP二聚酪氨酸含量显著高于空白组(P<0.05),姜黄素组和葡萄多酚组的MP二聚酪氨酸含量显著低于空白组(P<0.05),这可能与茶多酚和儿茶素的自我聚集有关,在油脂中使用时会因溶解性较差而影响其功能的发挥;在3 d时,儿茶素组的MP二聚酪氨酸含量显著低于空白组(P<0.05);在5 d时,儿茶素、姜黄素和葡萄多酚组的MP二聚酪氨酸含量显著低于空白组(P<0.05);在7 d时,儿茶素组和姜黄素组的MP二聚酪氨酸含量显著低于空白组(P<0.05);在9 d时,添加植物多酚的MP二聚酪氨酸含量都显著高于空白组(P<0.05)。综上所述,加入姜黄素和儿茶素可以有效抑制蛋白质氧化,减少侧链氨基酸的聚合作用,降低酪氨酸被氧化的概率,从而减少二聚酪氨酸的生成,具有一定抗氧化活性,李玲等[23]的研究结果表明多酚能够有效抑制猪肉MP中二聚酪氨酸的含量。
图3 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP二聚酪氨酸含量的影响
Fig.3 Effects of different kinds of plant polyphenols on MP tertiary structure in yak meat
2.1.4 MP表面疏水性
表面疏水性可评判蛋白质分子内部疏水性氨基酸残基暴露程度,常以溴酚蓝结合量来表示[24]。如图4所示,在1 d时,添加姜黄素的牦牛肉糜表面疏水性显著低于空白组(P<0.05);在5 d时,添加不同植物多酚的牦牛肉糜表面疏水性皆显著低于空白组(P<0.05)说明植物多酚有抑制表面疏水性增高的作用,且不同植物多酚的效果各有不同,姜黄素组在5 d时抑制效果最佳;在7 d时,添加茶多酚和儿茶素的牦牛肉糜表面疏水性显著高于空白组(P<0.05),而姜黄素组的表面疏水性显著低于空白组(P<0.05);在9 d时,添加植物多酚的牦牛肉糜表面疏水性皆显著低于空白组(P<0.05)。
图4 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP表面疏水性的影响
Fig.4 Effect of different plant polyphenols on surface hydrophobicity of MP from yak meat
随着时间的变化,茶多酚组和儿茶素组的MP表面疏水性在3 d时最低且显著低于1 d时(P<0.05);姜黄素组在7 d时显著低于1 d时(P<0.05);葡萄多酚组在9 d时MP表面疏水性最低,且显著低于1 d时。研究表明,冷藏过程中牦牛肉MP表面疏水性增加是由于MP分子结构展开造成的[25],由此可知,添加不同植物多酚均可以改变MP的表面疏水性,抑制MP分子结构的展开,从一定程度上使蛋白质结构的稳定得到了维持,可能是扼制了肉糜中因氧化反应而引起的蛋白质折叠,疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的侧链基团暴露出来的数量降低,说明植物多酚处理后能使牦牛肉氧化程度降低,且添加姜黄素和添加葡萄多酚组的效果更佳。
2.2 添加不同种类植物多酚对牦牛肉糜MP功能特性的影响
2.2.1 MP溶解性
测定蛋白是否变性和聚集使用的方法是测定蛋白溶解度,蛋白溶解度是判断蛋白质功能的指标[26]。如图5所示,与空白组作对照,在1 d时,儿茶素组的牦牛肉MP溶解度最高(P<0.05),蛋白溶解度为25.23%,姜黄素组和葡萄多酚组的MP溶解度显著低于空白组(P<0.05),蛋白溶解度分别为4.87%和5.91%;在7 d时,添加茶多酚的牦牛肉MP溶解度显著高于其余组(P<0.05);在3、5、9 d时,添加了不同植物多酚的牦牛肉MP溶解度无显著差异。
图5 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP溶解性的影响
Fig.5 Effects of different plant polyphenols on solubility of MP in yak meat
随着贮藏时间的增加,4组植物多酚的MP溶解度整体呈降低趋势,可能是由于蛋白质发生氧化反应,氨基酸残基的氧化修饰能引起蛋白质天然构象的改变,使疏水基团暴露,提高表面疏水性,蛋白质通过分子间疏水相互作用发生聚集,导致溶解度降低,说明添加不同植物多酚对牦牛肉的MP起到一定的稳定或者保护作用[27],此研究结果与胡思[28]的研究相一致,可见添加不同植物多酚能够减少牦牛肉的损耗,且姜黄素和葡萄多酚的效果更好。
2.2.2 MP乳化特性
2.2.2.1 乳化活性
乳化活性是评价蛋白质乳化性能的重要指标之一,是指当水与油相互融合时,单位质量蛋白质稳定油水界面的能力[29]。由图6可知,与空白组作对照:在1 d时,茶多酚组和葡萄多酚组的牦牛肉MP乳化活性显著降低(P<0.05);在3 d时,茶多酚组、儿茶素组和葡萄多酚组的乳化活性显著高于空白组(P<0.05);在5 d时,除儿茶素组的牦牛肉MP乳化活性显著低于空白组(P<0.05)外,其余添加组的乳化活性显著高于空白组(P<0.05),葡萄多酚组乳化活性最高,为195.23 m2/g;在7 d时,葡萄多酚组的乳化活性显著高于空白组(P<0.05),为177.20 m2/g;在9 d时,4个添加植物多酚组的乳化活性显著低于空白组(P<0.05)。
图6 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP乳化活性的影响
Fig.6 Effect of different plant polyphenols on emulsifying activity of MP in yak meat
随着贮藏时间的延长,空白组在3、7、9 d时乳化活性显著上升(P<0.05);与1 d时对比,茶多酚组、姜黄素组和葡萄多酚组牦牛肉糜MP乳化活性整体均显著提高(P<0.05);儿茶素组在3 d和7 d时牦牛肉MP乳化活性均显著上升(P<0.05)。由此分析,不同植物多酚能够提高牦牛肉MP乳化活性,可能是由于植物多酚的添加使蛋白经过氧化后,蛋白结构展开,暴露出了一些的亲油性和亲水性基团,水相和油相发生融合,从而使乳化活性增加[30],添加植物多酚可以使牦牛肉展现出最佳乳化活性,其中葡萄多酚提高牦牛肉MP乳化活性的效果更佳。
2.2.2.2 乳化稳定性
蛋白乳化稳定性也是评价蛋白质乳化性能如何的重要指标之一,是指蛋白质在贮藏过程中能够维持乳液体系稳定且不分层的能力[29]。由图7可知,与空白组对比,在1 d时,姜黄素组的牦牛肉MP乳化稳定性显著上升(P<0.05),其乳化稳定性指数为25.59%;在3 d时,添加不同植物多酚的牦牛肉MP乳化稳定性均显著上升(P<0.05);在5 d时,添加茶多酚、姜黄素和葡萄多酚的牦牛肉MP乳化稳定性均显著上升(P<0.05);在7 d时,葡萄多酚组的牦牛肉MP乳化稳定性显著上升(P<0.05);在9 d时,添加茶多酚、姜黄素和葡萄多酚的牦牛肉MP乳化稳定性显著上升(P<0.05)。实验结果表明随着冷藏时间的增加,添加不同的植物多酚有利于牦牛肉MP的乳化稳定性,能够延缓蛋白质变性,这与常海军等[29]的研究结果相似,且添加葡萄多酚的效果最佳。
图7 添加不同种类植物多酚对牦牛肉MP乳化稳定性的影响
Fig.7 Effects of different plant polyphenols on emulsifying stability of MP in yak mea
2.3 添加不同种类植物多酚对牦牛肉糜MP结构的影响
2.3.1 MP二级结构
傅里叶红外光谱作为测定蛋白质二级结构的有效工具。吸光光谱可以反映蛋白质二级结构的信息[31],1 600～1 640 cm-1为β-折叠结构;1 640～1 650 cm-1为无规卷曲结构;1 650～1 660 cm-1为α-螺旋结构;1 660～1 700 cm-1为β-转角结构。α-螺旋构象的变化与蛋白质疏水区域内氢键与多酚结合有关,β-折叠含量与蛋白质疏水性区域展开后蛋白质位点暴露有关,特征结构的变化使得蛋白质变得高度无序。如图8所示,与空白组作对照,在1 d和5 d时,不同植物多酚组的MP α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲无明显差异;在3 d时,儿茶素组的MP β-折叠显著高于空白组(P<0.05),无规卷曲显著降低(P<0.05),说明儿茶素与蛋白质发生络合,诱导蛋白质形成了有序结构,这与YAN等[32]的试验结果一致;在7 d时,茶多酚组、姜黄素组和葡萄多酚组的α-螺旋含量显著高于空白组(P<0.05),说明这3种多酚明显抑制了氢键作用力的减弱,从而提高了α-螺旋含量。
a-1 d;b-3 d;c-5 d;d-7 d;e-9 d
图8 添加不同种类植物多酚在不同时间对牦牛肉MP二级结构的影响
Fig.8 Effects of different plant polyphenols on MP secondary structure of yak meat at different time points
除了儿茶素组α-螺旋含量与空白组无明显差异外,其余3组能有效抑制蛋白质结构的破坏,降低蛋白氧化聚合的程度,蛋白的氧化会导致α-螺旋结构向β-结构或无规则卷曲结构转变,使α-螺旋结构损失[33],因此可以得出添加不同植物多酚可以抑制蛋白质氧化,达到延长冷藏期的效果,这与常海军等[29]的实验结果类似,其中茶多酚组、姜黄素组和葡萄多酚组效果更好。
2.3.2 MP三级结构
蛋白质内源色氨酸荧光对色氨酸残基周边的微环境十分敏感,因此色氨酸荧光时常作为表现蛋白质变化的方法之一[34]。由图9可知,在各个时间段姜黄素组的荧光强度都显著低于其他各组(P<0.05),且所有组都在340 nm附近逐渐发生荧光猝灭现象,随后随波长增加荧光强度开始下降;各个组在3、5、7、9 d时的荧光强度都显著低于1 d时的荧光强度(P<0.05),总体呈现出下降趋势。因此可以得出添加不同的植物多酚会与牦牛肉的MP发生作用,使MP三级结构改变,从而导致荧光强度发生变化,这与隋晓楠等[35]的研究结果类似,且添加姜黄素组效果最佳。
a-1 d;b-3 d;c-5 d;d-7 d;e-9 d
图9 添加不同种类植物多酚在不同时间点对牦牛肉MP三级结构的影响
Fig.9 Effects of different kinds of plant polyphenols on MP tertiary structure in yak meat at different time points
3 结论
不同植物多酚对冷藏牦牛肉MP氧化特性、功能特性及蛋白质结构均有一定影响,且影响不尽相同。与空白组作对照,加入不同植物多酚能够显著降低牦牛肉MP总羰基含量、继续保持巯基的抗氧化活性,降低二聚酪氨酸含量和表面疏水性指数,对牦牛肉的MP起到保护和稳定作用,能够有效提高乳化活性和乳化稳定性,还能减少MP的展开,更可以大幅度降低α-螺旋结构向β-结构或无规则卷曲结构转变而导致的α-螺旋结构损失。
综合所述,添加不同植物多酚均可有效抑制蛋白质的氧化变质,有效延长牦牛肉冷藏时间,提高冷藏牦牛肉的货架期,其中添加葡萄多酚的效果最优。本研究为延长牦牛肉冷藏时间提供参考。
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