足够的蛋白质摄入量是老年健康的必要保障[1]。牛肉蛋白质含量高、脂肪含量低,可提供平衡的氨基酸且消化率高,是非常适合老年人食用的健康蛋白食品[2]。但是,大部分老年人存在消化系统疾病,过量蛋白质摄入易增加老年人肠胃负担,且存在肾脏损伤、骨质疏松等风险[3]。因此,倡导高蛋白饮食的同时,促进老年机体外源蛋白质的消化吸收具有重要意义。特别是在国家和民众越来越重视大健康的今天,通过食物改善机体健康已成为新的研究热点,而天然、绿色、安全的食材干预则成为众多研究学者的首选。魔芋(Amorphophallus konjac)富含葡甘聚糖(konjac glucomannan, KGM),能够调节肠道健康,防治便秘、结肠癌、促进肠道益生菌生长[4]。桑叶是桑科(Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的树叶,富含黄酮、多糖、生物碱、氨基酸、甾类等天然活性成分,在大肠中被微生物发酵产生丁酸、乙酸等,降低肠道pH值,抑制有害细菌(大肠杆菌等)增殖[5]。前期研究发现,桑叶粉和魔芋粉组合物(以下简称组合物)显著提高动物源性高蛋白饮食老年小鼠盲肠内容物水分及短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)含量,降低盲肠内容物pH值和游离氨含量,提高肠道消化酶活性,调节肠道菌群结构,改善老年小鼠全肠道结构,促进肠道健康[6-7]。组合物是否对高牛肉蛋白消化和代谢具有促进作用,值得研究。
本研究以15月龄BALB/c老年小鼠为受试动物,以AIN-93M标准日粮为正常对照,以高牛肉蛋白饲料为实验组,通过不同剂量的组合物干预,并以消食片干预为阳性对照,采用代谢组学和多肽组学技术,研究不同剂量的组合物对高牛肉蛋白饮食老年小鼠蛋白质消化性的影响,以期为预防和改善老年蛋白质消化代谢等问题提供新的思路,同时为魔芋粉和桑叶粉的增值开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑叶粉,嘉陵20号品种,四川省大竹县今日农产品开发有限公司。水分含量(3.53±0.06)%,蛋白质含量(19.79±0.33)%,粗纤维含量(13.63±0.11)%,粗脂肪含量(6.71±0.21)%。魔芋粉,由花魔芋制得,重庆康家客食品公司,KGM含量93%,质量分数1%溶液黏度达40 000 mPa·s以上。鲜牛里脊,购于重庆永辉超市。江中牌健胃消食片,江中药业股份有限公司。AIN-93M饲料,蛋白质含量为13.53 g/100 g,南通特洛菲饲料科技有限公司。15月龄BALB/c小鼠,30只,雌性,购于重庆医科大学实验动物中心,合格证号:SCXK(渝)2018-0003。于西南大学药学院实验动物中心开展实验。
总氨基酸试剂盒、尿素氮试剂盒、白蛋白试剂盒、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,GOT)试剂盒、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)试剂盒,南京建成生物工程研究所;L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、4-氨基丁酸、4-羟脯氨酸、5-羟基赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、1-甲基-L-组氨酸、3-甲基-L-组氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、 L-蛋氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸,分析纯,Sigma或Solarbio公司;甲酸、乙腈、甲醇,LC色谱纯,赛默飞世尔科技;其余为实验室常用分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
PHSJ-5数显酸度计、DHS20-A烘干法水分测定仪,上海精密科学仪器有限公司;K9860全自动凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司; EASY-nano-LC 1200系统、Heraeus Fresco17离心机,赛默飞世尔科技;1290 Infinity II超高效液相仪、6460 三重四级杆质谱仪,美国Agilent公司;其余为实验室常用仪器设备。
1.3 试验方法
1.3.1 组合物的制备
按照课题组前期实验方法制备含桑叶粉和魔芋粉的组合物[6-7],桑叶粉∶魔芋粉=1∶1(质量比)。
1.3.2 牛肉蛋白粉的制备
参照实验室前期的方法[7]。牛肉蛋白粉水分含量为1.00%,蛋白质含量为93.50%。
1.3.3 高牛肉蛋白饲料制备
按照AIN-93M饲料配方配制高蛋白饲料,用牛肉蛋白粉替代部分玉米淀粉,蛋白质含量为50.56 g/100 g。
1.3.4 动物实验
动物实验室温度 23±1 ℃,相对湿度(53±2)%,每天光照12 h。小鼠适应性喂养1周,随机分为6组(n=5),分别为正常饮食组(normal control group,NC),高牛肉蛋白组(high beef protein group, HBP)、阳性对照组(positive control group,PC, 0.36 g/kg)、组合物高剂量组(composition high dose group, CHD, 0.3 g/kg)、组合物中剂量组(composition middle dose group, CMD, 0.15 g/kg)和组合物低剂量组(Composition low dose group, CLD, 0.075 g/kg)。NC组小鼠进食AIN-93M标准日粮,其他各组进食高牛肉蛋白饲料,全部自由进食。每日下午4点定时灌胃,NC组和HBP组分别灌胃同等剂量的生理盐水。饲养4周,期间定期更换垫料和水。
1.3.5 样本收集
实验结束前一天,收集小鼠新鲜粪便。试验周期结束后,小鼠禁食过夜12～14 h,乙醚麻醉,摘除眼球后用1.5 mL无酶离心管收集血液,静置1 h,3 000 r/min离心10 min,吸取上清液,封口膜封口,-80 ℃ 贮存。小鼠取血后颈椎脱臼处死,收集盲肠内容物。
1.3.6 盲肠内容物、粪便pH值和含水量测定
同组小鼠盲肠内容物和粪便分别混匀,准确称取0.2 g于离心管中,加入10倍去离子水,混匀,静置30 min,pH计测定其pH值。准确称取0.2 g小鼠盲肠内容物和粪便于已恒重的铝盒中,105 ℃ 烘干至恒重,测其水分含量。
1.3.7 蛋白质体内消化率测定
饲料和粪便总蛋白质的测定参照试剂盒方法,表观消化率按公式(1)计算[8]:
表观消化率
(1)
1.3.8 血清指标测定
参照试剂盒说明书,主要测定血清尿素氮、GPT、GOT、白蛋白、总蛋白和血清总氨基酸。
1.3.9 小鼠粪便上清液代谢组学鉴定
参照WEI等[9]的方法并略作修改。称取一定量小鼠粪便于EP管中,加入乙腈∶甲醇∶水= 2∶2∶1(体积比)600 μL,涡旋30 s,加入钢珠,45 Hz研磨4 min,冰水浴中超声波处理5 min,重复步骤3次;-20 ℃静置1 h;4 ℃,12 000 r/min离心15 min,取上清液100 μL,进样。采用UHPLC-MRM-MS/MS对小鼠粪便中25种氨基酸进行测定。
1.3.10 小鼠粪便多肽序列鉴定
参照MACVICAR等[10]的方法略作修改。于粪便样品中加入裂解液,振荡研磨3次,每次400 s,冰上裂解30 min。4 ℃ 15 000 r/min高速离心15 min后取上清液,转移至新的EP管中,使用BCA蛋白试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。随后从各个样本中分别取500 μg蛋白转移至新的EP管中冻干,向每管各加入1 mL预冷的甲醇,4 ℃振荡溶解4 h。高速离心15 min(15 000 r/min, 4 ℃)后取上清液。采用C18柱除盐后,冻干。将冻干样品复溶于水后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS检测。共上样3 μL样品(捕集柱:Thermo Fisher Scientific Acclam PepMap 100, 75 μm×2 cm;分析柱:PepMap RSLC C18, 75 μm×50 cm),以线性梯度分离:90 min内5% B至38% B[含0.1%(体积分数)甲酸的乙腈溶液]。柱流量控制在250 nL/min,柱温40 ℃,电喷雾电压2 kV。串联质谱图经过PEAKS Studio X分析。设置非酶切,PEAKS DB对Bos_taurus_201907.fasta数据库搜库。碎片离子质量容许误差:0.05 Da;母离子质量容许误差:10 ppm;固定修饰:氨基酸(+57.02 Da);可变修饰:蛋氨酸氧化(+15.99 Da);蛋白质N端乙酰化(+42.01 Da)。蛋白卡值为:-10 lgP≥20,至少含1 个特有肽段;肽段卡值为:-10 lgP≥20。
1.3.11 小肠质构及小肠组织测定
小肠质构测定参照实验室前期的方法[11]。鼠肠冷却至室温,拉直后量取10 cm,清除脂肪,两端用透气胶带固定。使用A/MTG夹具测试,校正高度,夹具之间间距5 cm,样品自然伸直,拧紧固定。采用两次拉伸的测试模式,第一次拉伸6 mm,保持10 s,得到弹性指标;第二次拉伸30 mm,拉断,得到断裂指标。测前速度1 mm/s,测后速度10 mm/s,测定速度1 mm/s。
小肠组织测定按照实验室前期方法[11],按病理检验标准操作程序脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片后,待测。
1.3.12 数据处理
实验结果用平均值±标准偏差表示。应用Excel 2010进行数据计算和绘图。应用Statistix 9完成单因素方差分析,P>0.05表示无显著性差异,P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 组合物对高牛肉蛋白饮食老年小鼠摄食量的影响
实验期间各组老年小鼠进食正常,毛皮色泽和活动情况未见异常。组合物干预组老年小鼠大便较为湿润,成型好,而包括NC组在内的其它各组老年小鼠大便干结,且大便量较组合物干预组少。每天测定不同实验组老年小鼠的摄食量,并计算实验周期内总摄食量,结果见图1。第1周摄食量差别不大,随着饲喂时间的延长,HBP组摄食量明显低于其它各组。其原因主要是高蛋白饮食能增加机体饱腹感,而消食片组能促进食物消化,组合物组的KGM会增加肠道蠕动和排便量[4]。
图1 摄食量的比较分析
Fig.1 Analysis of food intake
2.2 组合物对高牛肉蛋白饮食老年小鼠粪便、盲肠内容物含水量及pH值的影响
表1结果表明,HBP组盲肠内容物和粪便含水量显著性低于NC组(P<0.05),组合物干预后水分含量显著性增大,且高于NC组(P<0.05)。HBP组盲肠内容物和粪便pH值显著性高于NC组(P<0.05),组合物干预后显著性降低,且与NC组和PC组差异显著(P<0.05)。说明组合物使高牛肉蛋白饮食老年小鼠盲肠内容物和粪便含水量增大,pH值降低。因此,组合物干预组老年小鼠大便较为湿润,成型好,可以减少便秘的发生。魔芋粉中的KGM为可溶性膳食纤维,吸水性极强,可以吸收相当于其自身体积80～100倍的水,同时保水性好[4];ZHANG等[12]的研究表明,KGM具有改善便秘小鼠通便的作用。桑叶粉中的食物纤维、粗脂肪、矿物质和未被吸收的糖类进入盲肠中,使盲肠内容物含水量增大[13];课题组前期研究发现,将桑叶粉和魔芋粉复配后,所得组合物所含膳食纤维在盲肠、结肠内发酵促进SCFAs产生[6,14],因此,盲肠内容物、粪便pH值降低。
表1 盲肠内容物、粪便测定结果
Table 1 Result of cecum contents and faeces
组别盲肠内容物含水量/%盲肠内容物pH粪便含水量/%粪便pHNC64.12±0.63b7.05±0.01b27.57±1.00b6.89±0.04bHBP54.00±0.45d7.35±0.04a23.66±0.90d7.19±0.05aPC59.59±0.74c7.10±0.02b25.34±0.36c6.88±0.02bCHD73.64±1.51a6.89±0.12c33.94±0.24a6.44±0.07cCMD72.99±1.11a6.91±1.01c33.56±0.51a6.50±0.55cCLD72.62±0.51a6.95±1.11c33.18±0.55a6.57±0.31c
注：同列相同右上标字母代表无显著性差异(P>0.05),同列不同右上标字母代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 组合物对高牛肉蛋白饮食老年小鼠蛋白质表观消化率的影响
由图2看出,HBP组蛋白质表观消化率为86.70%,PC组蛋白质表观消化率最高,达95.45% 以上,组合物干预组蛋白质表观消化率高于92.92%,与 NC组、PC组差异不显著(P>0.05),均显著性高于HBP组(P<0.05)。BA等[15]的研究证实,当饮食中蛋白质的含量超过15% 以上,其表观消化率随之降低,本实验高蛋白饲料的蛋白质含量达到50.56%。研究发现消食片和组合物干预后,高蛋白饲料老年小鼠蛋白质表观消化率较HBP组均提高6.22%以上,说明蛋白质消化率的提高是与组合物的干预作用有关。组合物通过调节高蛋白膳食老年小鼠肠道菌群的种类和数量,增加乳杆菌属(Lactobacillus)和产粪甾醇真菌(Eubacterium coprostanoligenes)、布劳特氏菌属(Blautia)等,竞争性降低有害菌群的丰度,保护肠道屏障,提高蛋白质消化性[11,14]。
图2 表观消化率
Fig.2 The apparent digestibility
注:不同字母代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.4 血清指标测定结果
动物血清生化指标反映机体整体的代谢状况。
从表2和表3可知,高蛋白饮食显著增加动物血清中尿素氮和总氨基酸含量(P<0.05),组合物干预后血清尿素氮含量显著性降低(P<0.05),但未达到NC组水平。有研究表明,在可消化氨基酸范围内,适当增加氨基酸摄入量可降低尿素氮含量,如果继续增加氨基酸水平,超过了机体可消化的范围,血清尿素氮含量将增加。高含量会降低饲粮中氮的利用率,因为高血清尿素氮含量会使氮通过尿液排出体外[16]。
表2 血清中氮代谢指标水平
Table 2 The level of nitrogen metabolism index in serum
NCHBPPCCHDCMDCLD尿素氮(mmol/L)15.60±1.01c19.20±3.83a20.20±3.54a17.98±0.03b17.89±2.11b17.92±0.15bGPT(U/g prot)66.21±1.25b35.50±4.48c39.67±11.22c75.50±4.06a76.25±6.95a75.08±4.35aGOT(U/g prot)29.59±8.18c33.16±4.03c48.06±1.22b79.49±3.61a78.87±9.16a79.72±9.37a
表3 血清中含氮物质水平
Table 3 Nitrogen content in serum
NCHBPPCCHDCMDCLD总氨基酸(μmol/mL)17.72±2.61c27.41±3.85b31.22±2.82a32.77±6.64a33.61±0.09a32.92±2.59a总蛋白(g/L)102.57±0.51b113.58±4.94a98.36±11.62b115.78±28.62a111.08±7.57a108.59±5.60a白蛋白(g/L)45.73±9.07a43.93±5.50a44.40±3.02a43.13±3.02a41.87±2.73a42.20±5.05a球蛋白(g/L)56.83±8.88c69.65±7.56a53.96±14.11c72.65±27.74a69.22±5.11a66.39±9.02b
GOT和GPT与氨基酸的代谢强度相关,是蛋白质代谢关键酶。肝脏功能正常时,转氨酶活性的提高表示蛋白质合成和分解代谢速度加快[11]。HBP组GPT活性显著低于NC组(P<0.05),组合物干预后,其含量显著高于NC组(P<0.05)。GOT也随组合物的干预显著提高1倍以上(P<0.05)。这是因为随着蛋白质摄入量增加,体内蛋白质代谢活动增强,血清总氨基酸含量升高,但HBP、PC组氨基酸水平超过了可消化的范围,氨基酸脱氨基后血清尿素氮含量升高,表明这部分氨基酸在体内并未得到有效利用和转化,经尿排出体外[16]。组合物的干预增加高牛肉蛋白饮食老年小鼠血清中氨基酸水平的同时降低了血清尿素氮水平,血清白蛋白、球蛋白和总蛋白均无显著性差异(P>0.05)。该结果说明,CHD组、CMD组、CLD组氨基酸代谢强度高。
2.5 小鼠粪便上清液代谢组学
从表4可以看出,除L-苏氨酸、甘氨酸外,HBP组所有的粪便氨基酸含量均显著高于其他组,而消食片和组合物的干预均降低了代谢产物中氨基酸的含量,说明消食片和组合物的干预明显增加了机体对蛋白的吸收。从粪便氨基酸总含量看,HBP组氨基酸含量最高,达(3 783.49±0.46) nmol/g,PC组氨基酸含量次之,为(2 388.89±0.07) nmol/g,NC组最低,为(2 049.05±0.54) nmol/g,而组合物干预组氨基酸含量居于NC和PC组之间,说明组合物的干预使高蛋白饲料老年小鼠粪便代谢产物中氨基酸含量降低,已经极大改善了肠道对蛋白质的代谢。这个结果进一步说明组合物能够促进牛肉蛋白的消化,但消化能力还是未达到PC组水平。王喆等[17]比较了不同牛品种、性别肉中氨基酸含量,发现牛肉蛋白中谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸含量较高,其含量高达1 000 mg/100 g以上,特别是谷氨酸含量达3 000 mg/100 g,其次为精氨酸、丙氨酸。从测定结果看出,HBP组L-丙氨酸含量为(1 072.70±98.66) nmol/g,L-谷氨酸含量为(350.57±34.70) nmol/g,而PC组和CMD组L-丙氨酸含量分别为(665.15±26.98)和(657.32±91.45) nmol/g,L-谷氨酸含量分别为(274.29±23.23)和(280.36±0.03) nmol/g。HBP组粪便氨基酸含量均显著高于其他各组(P<0.05),说明高牛肉蛋白饲料提高了代谢产物中氨基酸含量,而消食片和组合物的干预降低了代谢产物中此类氨基酸含量(P<0.05),这一结果与蛋白质表观消化率测定结果一致,说明组合物和消食片的干预都促进了牛肉蛋白质消化。有研究表明,膳食纤维通过减少促炎细胞因子的释放发挥改善全身炎症反应[18],足量的膳食纤维摄入量可以促进老年人肌肉质量维持[19]。
表4 组合物对高牛肉蛋白饲料老年小鼠氨基酸代谢的影响
Table 4 Effect of combination on amino acid metabolism of old mice fed with high beef protein diet
氨基酸(nmol/g)NCHBPPCCHDCMDCLD甘氨酸44.36±3.11a55.81±0.72a47.74±1.00a48.90±0.66a49.50±0.45a49.72±1.54aL-丙氨酸826.04±24.42b1 072.70±98.66a665.15±26.98c658.09±28.67c657.32±91.45c659.30±86.74cβ-丙氨酸1.66±0.10d5.47±0.07a3.33±0.27c3.50±0.39c4.24±0.72b3.66±0.17bc4-氨基丁酸4.86±0.07ab5.03±0.06a4.87±0.18ab4.83±0.12b4.83±0.04b4.83±0.01bL-丝氨酸60.63±2.64c75.64±0.30a68.31±0.07b61.60±1.94c61.28±0.91c61.64±0.32cL-脯氨酸51.38±1.03b91.83±16.22a57.35±4.34b53.67±15.19b54.56±1.95b53.32±0.68bL-缬氨酸216.26±2.85bc444.76±10.42a285.93±38.49b115.86±87.92d157.81±10.41cd127.32±39.07dL-苏氨酸46.54±0.79a57.87±2.68a46.55±0.02a47.43±1.62a47.74±2.55a47.25±0.13aL-羟基脯氨酸0.97±0.03d7.76±3.42a3.49±1.14c3.94±0.09bc4.28±1.12bc5.77±0.00abL-天冬酰胺0.75±0.04d3.38±0.01a2.55±0.04b1.93±0.03c1.95±0.04c1.98±0.01cL-鸟氨酸11.75±0.91d51.28±7.76a36.36±2.05b20.36±0.50c20.53±0.72c20.49±0.31cL-天冬氨酸30.90±0.07a32.64±0.01a18.98±0.27b19.11±7.04b19.54±0.03b19.84±0.91bL-谷氨酰胺44.77±2.43c133.20±0.22a94.55±3.19ab54.69±2.97bc56.41±0.05bc57.42±0.40bcL-赖氨酸202.05±0.66b736.70±0.05a339.38±0.80b374.92±44.92b375.20±30.14b379.17±17.81bL-谷氨酸192.04±16.07c350.57±34.70a274.29±23.23b276.21±54.41b280.36±0.03b287.51±17.72bL-甲硫氨酸33.29±3.13c47.28±1.77a40.34±6.59b32.33±2.84c31.38±0.66c34.26±0.72cL-组氨酸14.79±0.18b30.55±0.01a30.32±4.26a14.76±2.02b15.77±3.86b16.93±2.55b5-羟基-L-赖氨酸0.17±0.08e3.86±0.01a0.47±0.04d0.98±0.05c0.88±0.14c1.23±0.04bL-苯丙氨酸26.64±1.71c48.78±0.13a34.95±0.02b31.84±2.02b30.38±0.49b34.98±1.85b1-甲基-L-组氨酸0.39±0.02e5.66±0.92a2.15±0.28cd1.29±0.66de2.58±0.18bc3.45±0.68b3-甲基-L-组氨酸0.46±0.03c9.69±1.35a4.30±0.23b4.40±0.01b4.41±0.01b4.46±0.02bL-精氨酸17.78±1.49cd87.58±0.85a25.23±1.14b12.82±0.83e15.09±2.37de18.77±2.00cL-瓜氨酸105.37±0.02b158.58±2.36a115.72±2.09b105.56±0.75b106.01±2.79b106.55±2.52bL-酪氨酸104.52±0.13b245.47±141.76a175.74±29.53ab130.20±26.66ab127.18±17.31b140.57±31.84abL-色氨酸10.43±0.38b21.40±1.00a10.88±0.00b5.66±0.31e6.73±0.17d7.85±0.56c合计2 049.05±0.54d3 783.49±0.46a2 388.89±0.07b2 084.88±0.09d2 135.96±0.00c2 148.27±0.01c
2.6 粪便中多肽的鉴定结果
2.6.1 组合物对高蛋白饮食老年小鼠粪便中肽段数量的影响
不同种类蛋白质消化率和消化产物存在差异,与蛋白质组成有一定的关系,蛋白质消化所得肽段的大小和序列与蛋白质的消化吸收性有关[20]。通过nano-HPLC-MS/MS获取消化产物序列数据,数据采集集中在可信度较高(>20)的500～4 000 Da范围内,如表5所示,共鉴定到1 326条肽段,主要分布在1 000～1 500 Da,其次为1 500～2 000 Da和500～1 000 Da,分子量在3 000 Da以下占93%。从图3-a可知,高蛋白饮食使小鼠粪便中肽段数量相较于NC组均显著增多(P<0.05),组合物的干预降低了粪便中肽段数量,且肽段主要分布于1 000～1 500 Da,说明被机体吸收的肽段增加,这与表观消化率测定结果一致。从图3-b看出,在这些肽段中,各组粪便中特有的肽段数量分别为48、154、123、78、70、62条。高蛋白饲饮食小鼠粪便中肽段数量明显增多,且组合物的干预可减少粪便中特有肽段数。这些结果提示,组合物促进了蛋白质的消化。
表5 所有粪便样本中肽段数量分布
Table 5 Distribution of peptides in all faeces samples
分子质量/Da500～1 0001 000～1 5001 500～2 0002 000～2 5002 500～3 0003 000～3 5003 500～4 000肽段数/条2014712851671106131
a-肽段数量;b-韦恩图
图3 各组粪便中肽段数量和韦恩图
Fig.3 Peptide number and Venn diagram in faeces
2.6.2 组合物对高蛋白饲料老年小鼠小肠质构及组织结构的影响
当食糜进入小肠,蠕动波有助于将其移动至大肠,并与消化酶和液体混合。维持正常的肠道运动、恢复肠壁弹性,有助于提高小肠推进率[21-22]。由表6可知,HBP组小肠断裂力、断裂距离、坚实度和弹性均最小,组合物干预后小肠各指标均提高(P<0.05),且高于NC组(P<0.05)。CLD组与HBP组相比,坚实度提高了14.49%,弹性提高了10.38%,断裂力提高了41.92%,断裂距离提高了7.88%。PC组断裂力和断裂距离与HBP组无差异(P>0.05),坚实度和弹性优于HBP组(P<0.05),但不及组合物干预组。说明组合物干预能够改善小肠组织健康。
表6 小肠质构的测定结果
Table 6 Result of intestinal texture
NCHBPPCCHDCMDCLD断裂力/g39.2±5.0b32.2±0.4c32.0±5.7c45.9±1.1a45.9±2.6a45.7±3.1a断裂距离/mm8.9±0.7b8.3±0.2c8.3±0.4c9.3±0.2a9.5±0.3a8.9±1.0b坚实度/g30.1±1.6b28.3±2.8c30.0±2.8b33.1±0.2a32.9±4.6a32.4±7.3a弹性/%79.6±0.1a71.3±1.4c75.3±3.8b79.2±5.2a78.9±8.1a78.7±3.0a
由图4可知,NC组小肠未见明显病理变化和炎细胞浸润,固有层内管状肠腺结构清晰、黏膜层肠绒毛结构和上皮完整。与NC组相比,HBP组小肠黏膜上皮少量脱落,杯状细胞数量减少,部分固有层肠腺萎缩坏死,其他未见明显病理变化。PC组、CHD组、CMD组及CLD组与NC组无显著性差异。由表7～表9可知,HBP组十二指肠、空肠和回肠绒毛高度最低,绒毛宽度最小,组合物干预后绒毛高度和绒毛宽度均显著增大(P<0.05)。隐窝深度测定结果显示,组合物干预后十二指肠、空肠和回肠隐窝深度较HBP组变浅(P<0.05),十二指肠隐窝深度与NC组无显著性差异,空肠和回肠隐窝深度较NC组更浅(P<0.05);肌层厚度测定结果显示,组合物干预后十二指肠、空肠和回肠肌层厚度变大,与HBP组差异显著(P<0.05),且组合物干预后绒毛高度/隐窝深度(V/C)值显著增大(P<0.05),说明组合物干预能改善老年小鼠高牛肉蛋白饮食对小肠造成的伤害。前期实验通过高牛肉蛋白饮食分别对老年小鼠十二指肠、空肠、回肠苏木精-伊红染色观察发现,高牛肉蛋白饮食会导致老年小鼠小肠上皮脱落、绒毛萎缩、断裂、肠腺坏死,而组合物干预未见小肠明显病理变化,且能改善高牛肉蛋白饮食对老年小鼠小肠造成的损伤[7]。主要是因为组合物中的魔芋粉可作为肠道益生元,在肠道中吸水溶胀形成胶体,在肠道壁形成保护膜,且能够促进肠道蠕动,具有调节肠道菌群的肠道益生性[12]。而组合物中的桑叶粉也具有降低肠道炎性因子的作用[5]。并且,组合物干预高鱼肉蛋白饮食老年小鼠蛋白质代谢实验发现,组合物通过降低高鱼肉蛋白膳食老年小鼠促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β)含量,提高抗炎性细胞因子(IL-10)含量,降低脂多糖结合蛋白和脂多糖水平,增加肠道SCFA含量,进而改善高鱼肉蛋白膳食老年小鼠胃肠道结构[11]。因此,组合物能够提高小肠各项指标性能,维持肠道屏障的完整性,保护肠道结构。
表7 十二指肠组织测定结果
Table 7 The results of duodenal tissue
绒毛高度V/μm绒毛宽度/μm隐窝深度C/μm肌层厚度/μmV/CNC274.26±1.21e78.36±0.06d76.88±0.32c56.87±0.33a3.57±0.31eHBP269.96±0.02f73.82±0.34e92.33±0.19a40.93±0.31c2.92±0.12fPC331.02±0.12d93.85±0.73b81.89±0.18b56.57±0.32a4.04±0.45dCHD417.43±0.16a102.17±0.07a76.01±0.23c56.04±0.44b5.49±0.37aCMD368.65±0.18c95.19±0.13b76.08±0.41c56.90±0.11a4.84±0.82cCLD389.32±0.12b82.31±0.15c75.99±0.70c56.06±0.26b5.12±0.34b
表8 空肠组织测定结果
Table 8 The results of jejunum tissue
绒毛高度V/μm绒毛宽度/μm隐窝深度C/μm肌层厚度/μmV/CNC355.18±0.20c107.25±0.02a76.02±0.30b30.92±0.13e4.67±0.21cHBP281.67±0.07e72.89±0.04d82.47±0.03a31.79±0.01d3.42±0.01ePC327.37±0.18d83.46±0.13c76.65±0.08b37.79±0.08c4.27±0.05dCHD495.22±0.66a100.77±0.01b71.80±0.03c39.12±0.01b6.90±0.07aCMD430.86±0.23b100.29±0.14b70.74±0.01c37.29±0.01c6.09±0.01bCLD428.55±0.10b99.24±0.20b71.24±0.01c48.96±0.04a6.02±0.22b
表9 回肠组织测定结果
Table 9 The results of ileum tissue
绒毛高度V/μm绒毛宽度/μm隐窝深度C/μm肌层厚度/μmV/CNC166.8±1.20a69.29±0.06c57.51±0.35c30.36±0.13b2.90±0.11bHBP120.97±0.07d54.54±0.04e84.59±0.09a28.21±0.01c1.43±0.23dPC143.11±0.28c63.82±0.13d61.14±0.10b30.58±0.02b2.34±0.03cCHD162.16±0.46b74.70±0.02a51.10±0.30d32.05±0.04a3.17±0.21aCMD161.27±0.28b70.56±0.11c50.64±0.10d31.79±0.01a3.18±0.04aCLD160.16±0.10b72.43±0.10b50.97±0.01d30.96±0.06b3.14±0.02a
图4 小肠苏木精-伊红染色
Fig.4 Small intestine hematoxylin-eosin staining
3 结论
本研究探索我国具有特色的农产资源桑叶粉和魔芋粉的组合构建天然食材配方。通过动物体内实验,结合多肽组学、氨基酸代谢组学评价组合物对高蛋白饲料老年小鼠蛋白质消化和代谢作用。通过对粪氮和尿氮的综合评价结果发现,组合物在促进动物源性蛋白消化的同时,也提高了机体对蛋白质的利用率,是真正意义上的膳食“消食片”。研究发现,组合物使机体氨基酸代谢强度提高,有利于机体蛋白质的合成,促进了机体对蛋白质的消化和吸收。而消食片提高蛋白质表观消化率是促进了尿氮排泄。组合物改善了高蛋白饲料老年小鼠小肠健康,提高小肠绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度,降低隐窝深度,利于小肠的推进作用。高蛋白饲料中的蛋白质含量和种类会对老年小鼠肠道产生氧化应激损伤,组合物是否能通过提高肠道组织局部抗氧化能力达到改善高蛋白饲料引起的机体氧化应激反应,进而发挥保护肠黏膜屏障功能值得探讨。
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