肉苁蓉(Cistanchesherba)是我国传统名贵中药材之一[1],2020年被列为药食同源试点植物,在我国保健食品中应用[2],肉苁蓉富含苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类等成分、糖类、生物碱及挥发油类等化学成分[3-4],这些成分具有抗氧化[5]、抗疲劳[6]、保肝护肝[7]、抗骨质疏松[8]、润肠通便[9]、提高免疫力[10]等多种功能作用,具有很高的食疗、保健价值。肉苁蓉可鲜食,由于产地区域限制以及新鲜肉苁蓉采收后仍具有非常旺盛的生命活动,在运输和贮藏过程中极易发生褐变、软化甚至霉变等情况,严重影响其经济价值[11]。近年来对新鲜肉苁蓉保鲜方法及贮藏技术有低温、气调包装、壳聚糖浸泡等保鲜方式,但是保鲜技术及相关理论研究匮乏,且新鲜肉苁蓉采后贮藏过程中出现的生理学变化的研究还不够深入,尚未全面研究其品质指标的变化规律和机理,亟待开展研究更多高效的保鲜方法,对于促进肉苁蓉产业的发展具有十分重要的意义。
半胱氨酸(cysteine)是一种天然的具有生理功能的氨基酸[12],在食品保鲜中的应用已有研究。半胱氨酸可作为抗褐变剂单独或与其他保鲜剂联合使用于各类果蔬的贮藏保鲜中[13]。半胱氨酸可抑制褐变,但其作用机理及其复杂。陈晨等[14]研究发现0.5 g/L的半胱氨酸溶液浸泡处理鲜切苹果,可有效抑制鲜切苹果多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力,延缓组织褐变,同时可提高鲜切苹果内部抗氧化酶活力,保持其贮藏品质。冯程程等[15]研究结果表明,2.0 g/L半胱氨酸处理鲜切紫甘薯能有效维持鲜切紫甘薯色泽、营养物质,较好地保留了花色苷的含量,并能延长其货架期。康慧芳等[16]研究表明2.8 g/L半胱氨酸处理巨峰葡萄,能减少果实营养品质流失,一定程度上延长贮藏期和货架寿命,并能有效提高其采后的抗病性。
本研究以鲜切肉苁蓉为研究对象,采用0.5、1.0、1.5 g/L的半胱氨酸浸泡 5 min,以蒸馏水浸泡处理作对照。分析在(0±1) ℃贮藏过程中,半胱氨酸对鲜切肉苁蓉贮藏期间生理生化指标的变化影响,为半胱氨酸对鲜切肉苁蓉贮藏保鲜方面的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
肉苁蓉:2023年3月26日采收于新疆吐鲁番地区。
L-半胱氨酸(食品级),浙江旭美景生物科技有限公司;三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氢氧化钠、二硫苏代糖醇、二硫代硝基苯甲酸,天津市永晟精细化工有限公司;聚乙二醇、愈创木酚、邻苯二酚、乙二胺四乙酸、硼酸、硼砂,天津市北联精细品化学品开发有限公司;以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-T700型紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;3nh阵列分光测色仪,杭州柯盛行仪器有限公司;3HBRI型高速冷冻离心机,湖南海澜仪器设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
将4 ℃预冷24 h后的鲜肉苁蓉清洗后切分为厚度为5 mm 的肉苁蓉圆片,将其分别放入0.5、1.0、1.5 g/L的半胱氨酸浸泡 5 min,以蒸馏水浸泡处理作对照,捞出至表面无水滴下,放入聚乙烯自封保鲜袋中,每袋200 g,每个处理重复3次,处理后立即贮藏于温度为(0±1) ℃恒温冰柜中贮藏10 d,每2 d取1次样,样品用于测定各项指标。
1.4 指标测定方法
1.4.1 色差、总可溶性固形物(total soluble solid,TSS)、可溶性蛋白、还原型抗坏血酸(ascorbic acid,ASA)的测定
色差采用3nh 阵列分光测色仪进行测定;总可溶性固形物采用 PAL-1 型糖度仪测定;可溶性蛋白、抗坏血酸的测定参照曹建康等[17]的方法。
1.4.2 还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、总酚的测定
还原型谷胱甘肽的测定参照曹建康等[17]的方法。
总酚的测定参照路帆等[18]、刘容等[19]和李静等[20]的方法,稍作修改。称取2.0 g肉苁蓉样品,加入10 mL甲醇溶液,冰浴匀浆后于4 ℃避光提取1 h,过滤收集滤液。吸取0.1 mL样品溶液分别加入水5.9 mL、FC 显色剂1 mL和75%碳酸钠溶液3 mL显色。避光反应2 h后在760 nm波长下测定样品的吸光度,再根据标准曲线方程y=0.011 69x-0.019 2(R2=0.996 5)计算出样品中总多酚。
1.4.3 抗氧化性酶的测定
过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxydes,APX)、谷胱甘肽还原酶(gluathione reductase,GR)测定参照曹建康等[17]的方法。
1.4.4 PPO、苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase,PAL)测定
PPO、PAL测定参照曹建康等[17]的方法。
1.4.5 H2O2、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定
H2O2含量采用南京建成科技有限公司试剂盒测定。
MDA的测定参照曹建康等[17]的方法。
1.5 数据处理
采用 Excel 2010 软件进行数据结果计算。用SPSS 22.0软件对试验数据进行方差分析,采用Duncan式进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著。使用GraphPad Prism 5.0.1软件作图。
2 结果与分析
2.1 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉色泽的影响
色泽是反映鲜切肉苁蓉衰老褐变最直观的指标之一。L*值表示果实的亮度。如图1-A所示,3组半胱氨酸处理组和对照组鲜切肉苁蓉的L*值呈下降趋势。且在整个贮藏期内,1.5 g/L半胱氨酸处理组的L*值均显著高于对照组(P<0.05),说明1.5 g/L半胱氨酸处理能有效缓解鲜切肉苁蓉亮度的降低。a*值表示果实的红绿程度,a*值越大则颜色越红,反之越绿。如图1-B所示,在贮藏过程中,各组鲜切肉苁蓉的a*值不断上升。对照组的a*值上升较快,在贮藏末期,1.5 g/L半胱氨酸处理组分别比对照组、0.5、1.0 g/L半胱氨酸处理组低20.1%、14.3%、11.9%。如图1-C所示,在整个贮藏过程中,鲜切肉苁蓉的3组半胱氨酸处理组和对照组的b*值均呈上升的趋势,在第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组b*值比对照组低11.8%(P<0.05)。说明1.5 g/L半胱氨酸处理鲜切肉苁蓉能延缓a*、b*值的升高,从而减轻鲜切肉苁蓉颜色的加深。
A-L*;B-a*;C-b*
图1 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉L*、a*、b*值的影响
Fig.1 Effect of cysteine on L*,a*,and b* value of fresh-cut Cistanchesherba
注:图中字母不同表示相同贮藏时间不同浓度半胱氨酸组和对照组相比差异显著(P<0.05),字母相同则差异不显著(P>0.05)(下同)。
2.2 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉TSS的影响
TSS能反映果实成熟度和耐贮性的重要指标[21]。如图2所示,各组TSS含量都呈下降趋势,可能是因为鲜切肉苁蓉在贮藏期间自身代谢导致可溶性固形物下降。贮藏第2天后,1.5 g/L半胱氨酸处理组TSS含量均高于对照组(P<0.05),第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组TSS含量是对照组的1.41倍。说明1.5 g/L半胱氨酸可有效维持鲜切肉苁蓉在贮藏期间TSS含量的下降。
图2 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉TSS含量的影响
Fig.2 Effect of cysteine on TSS contents of fresh-cut Cistanchesherba
2.3 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉可溶性蛋白的影响
可溶性蛋白质含量是能最明了反映果蔬组织细胞衰老的生理指标之一[22]。如图3所示,各组在整个贮藏期间可溶性蛋白含量总体呈下降趋势,3组半胱氨酸处理组的可溶性蛋白含量均高于对照组,可能是因为半胱氨酸处理可延缓鲜切肉苁蓉可溶性蛋白的水解降低,使其保持较好的营养价值。对照组和0.5、1.0 g/L半胱氨酸处理组的可溶性蛋白质含量在贮藏第2天出现峰值,而1.5 g/L半胱氨酸处理组的可溶性蛋白质含量在第4天出现峰值。在贮藏第2天之后,1.5 g/L半胱氨酸处理组可溶性蛋白含量均显著高于对照组(P<0.05),说明1.5 g/L半胱氨酸处理对可溶性蛋白含量影响较大,处理效果相对较好。
图3 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉可溶性蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of cysteine on soluble protein content of fresh-cut Cistanchesherba
2.4 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉ASA和GSH含量的影响
抗坏血酸是果蔬中重要的营养成分之一。如图4-A所示,鲜切肉苁蓉中ASA含量相较于第0天呈现下降的趋势。第6天之后,对照组的ASA含量下降速率相对较快,且半胱氨酸处理组ASA含量显著高于对照组(P<0.05)。第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组ASA含量是对照组的2.67倍(P<0.05)。由此可知,半胱氨酸处理能够减缓ASA含量的下降。
A-ASA;B-GSH
图4 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉ASA和GSH含量的影响
Fig.4 Effect of cysteine on ASA and GSH contents of fresh-cut Cistanchesherba
还原型谷胱甘肽的含量与果蔬抗氧化能力密切相关。如图4-B所示,对照组和处理组的GSH含量都呈先上升后下降的趋势。对照组和0.5 g/L半胱氨酸处理组的GSH含量在贮藏第2天出现峰值,1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组的GSH含量在贮藏第4天出现峰值。第10天时,1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组GSH含量比对照组高47.3%和47.6%(P<0.05)。说明1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理可有效维持鲜切肉苁蓉果实采后贮藏过程中GSH的含量。
2.5 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉抗氧化酶活性的影响
由图5-A可知,3组半胱氨酸处理组和对照组POD活力在0～6 d内呈上升趋势,第6天达到了峰值,0.5、1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组的POD活力是此时对照组的1.39、2.29、2.35倍,这可能是为了应对鲜切产生的机械损伤导致果实体内活性氧水平的升高[23],鲜切肉苁蓉组织中的抗氧化机制被触发,处于氧化应激状态,POD活力增大。第6天之后3组半胱氨酸处理组和对照组POD活力开始下降。第2～8天1.5 g/L半胱氨酸处理组POD活力均高于对照组(P<0.05),在贮藏第10天,1.5 g/L半胱氨酸处理组POD活力比对照组高39.8%。进一步可知,半胱氨酸处理可提高POD活力,这可能是由于机械损伤使组织产生过量H2O2,从而诱导半胱氨酸提高POD活力,及时清除过量H2O2,对延缓鲜切肉苁蓉的衰老具有积极作用[24]。
A-POD;B-CAT;C-APX;D-GR
图5 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉POD、CAT、APX、GR活力的影响
Fig.5 Effect of cysteine on POD,CAT,APX,GR activities of fresh-cut Cistanchesherba
H2O2的积累对组织产生的氧化损伤,而CAT能催化H2O2分解为H2O和O2,从而减轻H2O2产生的氧化损伤[25]。如图5-B所示,鲜切肉苁蓉在贮藏期间对照组CAT活力整体呈下降趋势,这可能是因为随着贮藏时间延长肉苁蓉组织衰老,组织中了产生大量活性氧,从而抑制了CAT的活力[14]。而3组半胱氨酸处理组的CAT活力呈先上升后下降的趋势,在第4天出现峰值,0.5、1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组的CAT活力比对照组高95.3%、118.8%、194.3%,第4天之后3组半胱氨酸处理组的CAT活力开始下降。在整个贮藏期间,1.5 g/L半胱氨酸处理组CAT活力均高于对照组,第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组CAT活力是对照组的4.13倍(P<0.05)。由此可知,半胱氨酸处理能诱导提高鲜切肉苁蓉CAT活力,减轻了H2O2引起的氧化损伤。
如图5-C所示,鲜切肉苁蓉在贮藏期间APX活力整体呈先上升后下降的趋势,第4天出现峰值,整个贮藏期间3组半胱氨酸处理组APX活力始终高于对照组。0.5、1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组的APX活力是对照组的1.12、1.23、1.29倍,第4天之后的APX活力开始下降,1.5 g/L半胱氨酸处理组APX活力均显著高于对照组(P<0.05),第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组APX活力是对照组的2倍。由此可知半胱氨酸处理能诱导提高鲜切肉苁蓉APX活力。
GR能够将氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)还原成GSH,GSH能起到清除活性氧的功能,从而保护组织不受活性氧伤害[26]。如图5-D所示,对照组在贮藏初期第2天时GR活力降低,在贮藏第4天出现峰值,3组半胱氨酸处理组的GR活力都是呈先上升后下降的趋势。在贮藏末期,第8天、第10天1.5 g/L半胱氨酸处理组的GR活力与对照组有显著性差异(P<0.05),分别是对照组的4.3、4.8倍。
贮藏第4天之后3组半胱氨酸处理组GR活力高于对照组,由此可知半胱氨酸可维持GR活力的下降。APX 和GR 是分别以抗坏血酸和氧化型谷胱甘肽为底物清除过量H2O2 以保护细胞免受氧化损伤的抗氧化酶,使细胞免受活性氧伤害,在防御系统中发挥重要的作用[27]。
2.6 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉PPO酶活性的影响
PPO是引起鲜切肉苁蓉组织发生褐变的主要酶类之一。如图6所示,在整个贮藏期间,对照组和处理组PPO活力较第0天呈现下降趋势,对照组和0.5、1.0 g/L半胱氨酸处理组的PPO活力在第2天和第6天出现峰值,且在贮藏期间PPO活力值与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。可能是因为半胱氨酸浓度低的原因,对PPO活力的抑制效果不明显。而1.5 g/L半胱氨酸处理组的PPO活力在第4天和第6天出现峰值,除第8天外,和对照组相比PPO的活力均低于对照组(P<0.05),在贮藏末期比对照组低61.9%。说明1.5 g/L半胱氨酸溶液浓度对鲜切肉苁蓉PPO活力具有显著的抑制作用,也对延缓鲜切肉苁蓉褐变具有积极作用。
图6 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉PPO活力的影响
Fig.6 Effect of cysteine on PPO activity of fresh-cut Cistanchesherba
2.7 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉总酚含量、PAL活力的影响
酚类物质广泛分布于果蔬中,不仅是果蔬自身抗氧化重要次级代谢产物,而且有益于人体健康[28]。由图7-A可知,3组半胱氨酸处理组和对照组的总酚含量在贮藏第2天出现下降,之后对照组的总酚含量在第6天出现峰值,而3组半胱氨酸处理组的总酚含量在第4天出现峰值,且总酚含量均高于对照组。可能是因为半胱氨酸处理可诱导鲜切肉苁蓉酚类物质的合成积累。在贮藏第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组总酚含量显著高于对照组(P<0.05),是对照组的1.96倍。由此可见半胱氨酸处理还能延缓鲜切肉苁蓉总酚含量的下降。
A-总酚含量;B-PAL活力
图7 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉总酚含量、PAL活力的影响
Fig.7 Effect of cysteine on total polyphenol content and PAL activity of fresh-cut Cistanchesherba
PAL参与多种次生代谢物的生物合成,如酚类物质,是调节果蔬苯丙烷途径的关键酶之一[29]。果蔬在鲜切后,受到机械损伤会激活苯丙烷代谢,诱导酚类物质的合成,间接引发褐变[30]。如图7-B所示,3组半胱氨酸处理组和对照组PAL活力整体呈上升趋势,在贮藏第4天后,1.5 g/L半胱氨酸处理组PAL活力上升速率加快,且对照组PAL活力都低于半胱氨酸处理组,可能是因为半胱氨酸处理能诱导PAL活力增高,增加酚类物质的合成积累。
2.8 半胱氨酸处理对鲜切肉苁蓉H2O2、MDA含量的影响
如图8-A所示,在贮藏期间,鲜切肉苁蓉H2O2含量整体呈先上升后下降的趋势,对照组H2O2含量始终高于3组半胱氨酸处理组。第8天之前,1.5 g/L半胱氨酸处理组H2O2含量显著低于对照组(P<0.05),第10天时,1.5 g/L半胱氨酸处理组H2O2含量比对照组低29.7%(P<0.05)。整个贮藏期间,半胱氨酸处理组H2O2含量低于对照组,由此可知半胱氨酸处理可以减少鲜切肉苁蓉贮藏期间过氧化氢的积累。
A-H2O2;B-MDA
图8 半胱氨酸对鲜切肉苁蓉H2O2、MDA含量的影响
Fig.8 Effect of cysteine on H2O2 and MDA content of fresh-cut Cistanchesherba
MDA含量可用于反映细胞膜脂过氧化程度,也能间接衡量细胞的损伤程度[31]。由图8-B可知,3组半胱氨酸处理组和对照组MDA含量均呈明显上升的趋势,说明随着贮藏时间延长,鲜切肉苁蓉细胞膜脂过氧化加重。在贮藏第2天时,0.5、1.0 g/L半胱氨酸处理组与对照组MDA含量差异不显著(P>0.05),而1.5 g/L半胱氨酸处理组MDA含量均显著低于对照组。贮藏第10天时,0.5、1.0、1.5 g/L半胱氨酸处理组分别比对照组低29.2%、48.7%、63.9%。整个贮藏期间,半胱氨酸处理组MDA含量低于对照组。半胱氨酸处理能有效减缓鲜切肉苁蓉MDA的累积,降低其细胞膜脂过氧化的程度,较好地保持细胞膜完整性,延缓鲜切肉苁蓉衰老变质。
3 讨论
色泽、可溶性蛋白、可溶性固形物、抗坏血酸是影响果蔬贮藏品质的重要指标[32]。经研究发现,半胱氨酸处理鲜切肉苁蓉可延缓L*值(亮度)下降、a*(红度)、b*(黄度)值的升高,且1.5 g/L半胱氨酸浓度处理效果相对最好。1.5 g/L半胱氨酸还可有效缓解鲜切肉苁蓉在贮藏期间可溶性蛋白、可溶性固形物、抗坏血酸含量的下降,对维持鲜切肉苁蓉贮藏品质具有积极影响作用。
果蔬活性氧代谢与果蔬贮藏品质、时间长短密切相关[33]。鲜切肉苁蓉由于机械损伤,组织结构受到破坏,会产生一系列不良的生理生化反应,如活性氧的积累,直接影响贮藏品质[34]。果蔬细胞内存在有两类ROS清除系统:一类是活性氧清除酶,包括POD、CAT、APX、GR等;一类是非酶清除系统,包括ASA和GSH等抗氧化物质[35]。本研究发现,1.5 g/L半胱氨酸处理可有效增强鲜切肉苁蓉贮藏期间POD、CAT、APX、GR的活力,从而减少活性氧的积累,减轻鲜切肉苁蓉的氧化损伤。陈晨等[14]研究结果也表明半胱氨酸处理可诱导提升鲜切苹果贮藏期间POD、CAT、APX、GR等抗氧化酶活力,延缓鲜切苹果的衰老与褐变。而冯程程等[15]的研究结果表明半胱氨酸处理鲜切紫甘薯会抑制POD酶活力,结果差异可能与果蔬种类和不同的处理条件有关。此外,内源抗氧化物质ASA、GSH在正常生理状态下,会清除组织内ROS的产生,保证果实品质[36]。本研究中1.5 g/L半胱氨酸处理可有效延缓ASA和GSH含量的下降,保持较高的抗氧化物质含量,增强果实的活性氧清除能力,从而减少氧化损伤。
PPO能催化氧气与果蔬中多酚类物质结合形成醌类物质,醌类物质发生聚合形成褐色沉积物导致果蔬褐变[19]。1.5 g/L半胱氨酸处理鲜切肉苁蓉可有效抑制PPO酶活力,从而延缓褐变发生。路帆等[18]和魏杰[11]研究发现,通过气调贮藏的方式可以抑制鲜切肉苁蓉PPO活力,减缓褐变,较好地维持鲜切肉苁蓉贮藏品质。机械损伤能够诱导鲜切果蔬PAL活力提高,增加酚类物质合成[37]。本研究发现半胱氨酸处理后的鲜切肉苁蓉PAL酶活力以及总酚含量高于对照组,且1.5 g/L半胱氨酸处理浓度相对最佳,说明半胱氨酸可以增加鲜切产生的机械损伤诱导肉苁蓉PAL活性提高,积累总酚含量的效果。
4 结论
本研究表明,1.5 g/L半胱氨酸处理可有效提高鲜切肉苁蓉贮藏期间POD、CAT、APX、GR活力,延缓可溶性蛋白、TSS、ASA与GSH含量的下降,并抑制MDA与H2O2的积累,较好地保持了鲜切肉苁蓉的贮藏品质。
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