枸杞子为枸杞的成熟果实,含有多种活性成分,如多糖、类胡萝卜素等,具有滋补肝肾、缓解腰痛、降血脂、明目等功效[1-2]。以枸杞子为原料的深加工产品如枸杞原浆、枸杞酒等逐渐进入市场,但精加工水平参差不齐,枸杞子仍以干果销售为主,附加值低。采用益生菌对枸杞子进行发酵,是提升枸杞子的营养品质和口感的研究热点[3]。益生菌在发酵枸杞子过程中通过复杂的代谢途径产生多种活性酶、次生代谢活性产物,并能降低抗营养物质含量,从而提高产品的抗氧化、抗炎和抗肿瘤性能[4]。目前,枸杞发酵产品为打浆后发酵。郭波等[5]发现青梅打浆后会造成营养物质的损失,整果发酵酒附加值高。胡来丽[6]研究发现百香果全果发酵酒呈味氨基酸含量高于果汁发酵酒。枸杞子在乳酸菌的作用下,可以获得较高的营养品质,且整果发酵能较好地保存果实原有的形态。

发酵过程中存在产物产量低、发酵周期长等问题。发酵预处理对于提高发酵效率至关重要,有效的预处理可有效缩短发酵时间、提高产物的产量、改善产品风味。YU等[7]研究发现,低强度超声可以促进微生物生长,加速发酵过程,提高目标代谢物的产量。颉向红[8]研究发现大分子化合物被酶水解后更容易被微生物利用,有利于微生物生长繁殖与产酸产香。TIEN等[9]在发酵过程中补充蛋白酶使乙醇产量提高2.4%,发酵时间缩短为48 h。李婷婷[10]发现经超声加速酸和醇的酯化反应,酸类化合物减少,香醋风味更加柔和。彭雨露[11]发现蛋白酶促进醛、甲基酮和醇代谢转化成关键酯类,有利于关键挥发性风味物质积累。为了提高枸杞子生物活性及深加工利用率,本研究以整果枸杞子为原料进行发酵,开发发酵整果枸杞子新产品,同时采用超声联合酶解技术进行预处理,加速发酵进程。通过主成分分析法(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)比较产品品质特性,从而为超声联合酶解工艺在发酵产品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干制枸杞子,宁夏早康枸杞股份有限公司;植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌,诺佰克(武汉)生物科技有限公司;纤维素酶、果胶酶、蛋白酶,浙江汇泉生物科技有限公司;福林酚、考马斯亮蓝G-250,上海索莱宝生物科技有限公司;芦丁,天津一方科技有限公司;没食子酸、硝酸铝,天津市北方天医化学试剂厂;DPPH,上海晶纯生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;SHP-250B生化培养箱,SYU-10-300DT天津市天宇实验仪器有限公司;超声波清洗机,郑州生元仪器有限公司;GCMS-QP2010气相色谱质谱仪,日本岛津公司;CAR/DVB/PDMS萃取头(50/30 μm),美国Supelco公司。

1.3 超声联合酶解处理发酵整果枸杞子品质分析

1.3.1 处理方法

试验共设置3组,分别为未发酵整果枸杞组(LB)、无预处理发酵整果枸杞组(FLB)和超声联合酶解处理发酵整果枸杞组(UEFLB)。

FLB组枸杞子杀菌后采用经优化实验得到的最佳发酵工艺条件进行发酵:枸杞子在2%(质量分数)乳酸菌菌液中浸渍10 min后沥干,37 ℃条件下发酵55 h。

UEFLB组枸杞子杀菌后,在浸渍液配方为2%乳酸菌与0.75%酶制剂(纤维素酶∶果胶酶∶蛋白酶质量比为1∶1∶1)浸渍并超声10 min后沥干,在37 ℃条件下发酵36 h(参数由优化实验得出)。

1.3.2 品质分析

取LB、FLB、UEFLB分别测定风味物质、总酚、总黄酮、还原糖、总蛋白、花青素、类胡萝卜素、可滴定酸含量、活菌数、色差值(L*、a*、b*)、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、总还原力,并对除风味物质的指标分别采用PCA和OPLS-DA进行比对分析;风味物质则基于NIST11质谱数据库、匹配度和保留时间对各个物质进行检索,选择匹配度>85的物质作为有效的香气成分,按峰面积归一化进行相对定量。

1.3.3 指标测定方法

抗氧化能力测定参照王娜[12]的方法,取1 g枸杞样品,研磨,用70%(体积分数)乙醇溶液定容到20 mL,超声10 min,25 ℃浸提20 min后,4 000 r/min离心15 min,配置成5 mg/mL的提取液,进行抗氧化能力测定。

总酚含量采用福林酚法进行测定,结果以没食子酸当量表示[13]。总黄酮含量采用硝酸铝比色法测定,结果以芦丁当量表示[14]。还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[15]。总蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定。花青素含量采用pH示差法测定[16]。类胡萝卜素含量测定参照熊巧仪等[17]的方法,采用比色法,测定样液在440 nm处吸光度。可滴定酸含量采用GB 12456—2021《食品中总酸的测定》进行测定。活菌数测定参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》。

挥发性风味物质测定参照周艳平等[18]的方法。气相色谱条件:DB-WAX 色谱柱;程序升温:40 ℃保留3 min,然后以4 ℃/min 升至150 ℃保留1 min,再以8 ℃/min 250 ℃保留6 min。传输线温度为250 ℃,载气为He,柱流量1 mL/min,分流比10∶1。质谱条件:离子源温度200 ℃,连接杆温度200 ℃,溶剂延迟时间1.5 min,电离方式为EI,能量70 eV,扫描范围(m/z)35～350。

1.4 数据统计分析

通过SPSS 25.0软件进行数据处理以及进行综合评分,采用Origin 2017编辑作图,使用SIMCA 14.1软件进行PCA和OPLS-DA。

2 结果与分析

2.1 PCA综合评价不同处理组枸杞子的品质差异

表1为不同处理组品质指标,参照王振斌等[19]的方法进行PCA。由表2可知,以特征值>1为原则共得出2个主成分,2个主成分包含的信息量占总信息量的94.191%,仅需2个主成分,便可以表现出15种指标。根据主成分特征值、载荷值得到主成分F1和F2的模型表达式为:

F1=0.286X1+0.293X2-0.287X3+0.105X4-0.273X5-0.283X6+0.291X7+0.243X8-0.103X9-0.246X10-0.223X11+0.261X12+0.286X13+0.293X14+0.288X15

F2=0.004X1-0.068X2+0.137X3+0.550X4+0.205X5+0.172X6-0.079X7+0.338X8+0.554X9-0.268X10-0.104X11+0.258X12-0.136X13-0.082X14+0.033X15

其中X1～X15分别为总酚、总黄酮、还原糖、总蛋白、花青素、类胡萝卜素、可滴定酸含量、活菌数、L*、a*、b*、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、总还原力。由此得到枸杞子综合评价模型F=(F1×76.004+F2×18.187)/94.191,模型得分越高,说明该工艺得到的枸杞子品质越好。由表3可知,UEFLB排名最高。UEFLB在较短发酵时间的前提下,达到了更佳的品质,超声联合酶解处理缩短了枸杞子发酵时间,提高了产品品质。

2.2 PCA分析不同处理组枸杞子各品质指标间差异

对各组枸杞子品质指标测定结果采用PCA进行降维处理后得到二维的得分图(图1)和载荷图(图2)。图1得分图中样本点距离越近,其变量差异越小。由图1可知,3组样本点有着明显的区分,其中发酵组UEFLB、FLB和未发酵组LB在PC1和PC2均有明显区分,UEFLB和FLB两组沿着PC2也具有明显区分,说明发酵后枸杞品质发生了明显变化,超声联合酶解处理使发酵枸杞品质发生了进一步变化。图2为枸杞子各品质指标的载荷图,与得分图结合来看,在同一角度的样本与指标呈现正相关。由图1、图2可知,LB组还原糖、类胡萝卜素、花青素含量较高,UEFLB组和FLB两组枸杞子总酚含量、总黄酮含量、活菌数及抗氧化指标等较高,其中UEFLB组活菌数、DPPH自由基清除率要高于FLB组(P<0.05)。枸杞子经发酵后类胡萝卜素、花青素含量有一定的损失,但总酚、总黄酮含量及抗氧化能力得到了明显提升。类胡萝卜素、花青素易受到加工过程中氧气、温度的影响而损失[20]。乳酸菌代谢产生的酶,使得总酚、总黄酮含量增加[21]。UEFLB活菌数达FLB组的5.74倍;DPPH自由基清除率为比FLB组高2.67%,超声联合酶解处理增强了发酵强度,活菌数和抗氧化能力得到了进一步增强。OJHA等[22]发现超声的空化效应,改善了传质和微生物细胞渗透性,加速了发酵进程,提高产物产量。

2.3 OPLS-DA分析超声联合酶解处理对发酵整果枸杞子品质指标的影响

为更深入地分析超声联合酶解处理对发酵整果枸杞子品质影响的特征指标,采用OPLS-DA对各项指标进行分析,分析结果显示自变量拟合指数R2x为0.967,因变量拟合指数R2y为0.994,模型预测指数Q2为0.984,模型拟合结果较好。图3为模型交叉验证结果,经过200次置换检验,Q2回归线与纵轴的相交点<0,模型不存在过拟合,模型验证有效。由图4可知,有2个在对角线上相差最远的指标,分别为活菌数及还原糖,图5中按变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值。由大到小排序,排在前2位的也是活菌数及还原糖,因此可确定活菌数及还原糖含量为超声联合酶解处理对发酵整果枸杞子品质影响的差异指标。活菌数及还原糖含量成为差异指标的主要原因是乳酸菌对营养物质的利用率经过酶解后提高,增加了乳酸菌生物量,并且微生物生长滞后期经过超声处理后被有效缩短,继而使得细胞束在微生物的培养过程中处于松散状态。而发酵过程中乳酸菌生长的碳源是还原糖,故而乳酸菌生物量大幅增长导致还原糖含量也显著变化[23-24]。

2.4 超声联合酶解预处理对发酵整果枸杞子挥发性风味成分影响

枸杞子挥发性风味成分见表4～表9。LB共检测出挥发性成分58种,醇类、酸类相对含量较高,对其的风味贡献较大。醇类、烯烃类对FLB的风味贡献较大,在酯类化合物的共同作用下FLB风味柔和、花果香风味更明显。超声可以改变物质内部分子运动形式,产生空化效应,使分子键断裂后重组,风味物质间的化学反应加速[25]。细胞壁经过酶解后被分解,挥发性成分逸散,糖苷的部分键合态芳香成分有效被释放,风味物质富集[26]。与FLB相比,UEFLB挥发性风味物质种类增加到72种,烯烃类化合物相对含量更高。

2.4.1 醇类化合物分析

发酵产品的醇类物质主要源于发酵过程中乳酸菌的氨基酸脱羧、脱氢或脂代谢所产生[27]。由表4可知,LB检测出醇类化合物15种;经过发酵后FLB新产生了7种醇类物质、消失了4种醇类物质;UEFLB与FLB相比新产生了2种醇类物质、消失了2种醇类物质。LB中相对含量较高的为2,3-丁二醇具有水果香、洋葱味。FLB、UEFLB中新产生的含量较高的苯乙醇具有蜜香、玫瑰香,芳樟醇则具有薰衣草香。

2.4.2 酸类化合物分析

由表5可知,酸类化合物对LB的风味贡献较大,LB中检测到的9种酸类化合物中,其中含量较高的己酸主要表现出刺激性气味、汗臭味。FLB、UEFLB中酸类化合物相对含量低于其主要呈味的醇类、烯烃类,可见发酵使得枸杞子刺激性酸味减弱、风味更加柔和。张浩然[28]研究了超声对沙果醋的催陈效果,发现发酵后的沙果醋中的酸类化合物的相对含量减少,涩味在超声后略有减少,这与本研究结果相似。

2.4.3 烯烃类化合物分析

枸杞子中烯烃类化合物种类及相对含量见表6。LB中仅检测出2种烯烃类化合物,且相对含量为2.62%,其中右旋萜二烯有柑橘、薄荷的香气,萜品烯具有柑橘和柠檬似香气。发酵后的FLB检测出7种烯烃类化合物,相对含量25.04%,新产生的相对含量较大的β-蒎烯具有特有的松节油香气和松脂气味。UEFLB检测出9种烯烃类化合物,相对含量最高,达到了32.64%,其中右旋萜二烯相对含量达27.05%,是UEFLB的主要呈味风味,右旋萜二烯主要表现出令人愉悦的清香味。可见发酵使得枸杞子烯烃类化合物种类增加、相对含量升高,超声联合酶解预处理进一步扩大了这种趋势,丰富了枸杞子的香气层次。

2.4.4 酯类化合物分析

由表7可知,LB中检测出8种酯类化合物;FLB新产生了12种、消失了2种,新产生的甲酸辛酯具有桃、杏样香气;UEFLB与FLB相比新产生了8种、同时消失了9种,这些新产生酯类物质大多呈现桃子、菠萝、香蕉等果香味,较为柔和。总体上发酵后的枸杞子酯类化合物种类和含量均有所增多,主要是因为酸和醇在发酵的后熟阶段相结合生成羧酸酯类,不同的酸和醇结合产生具有不同香味的酯类[29]。

2.4.5 醛类、酮类化合物分析

如表8所示,3种样品中共检测出10种醛类化合物,其中主要成分3-甲基丁醛具有麦芽香,糠醛具有杏仁气味,正己醛则具有油脂似刺激性气味,正己醛在LB中相对含量最高,为6.84%,在FLB及UEFLB中相对含量则大大降低,该变化使得FLB、UEFLB刺激性风味减少。LB中检测出8种酮类化合物,FLB、UEFLB中检测出4种酮类化合物,可见发酵使得酮类化合物的种类减少,这与郭静[30]在研究发酵猕猴桃果酒香气得到的结果相似。

2.4.6 其他类化合物分析

枸杞子中还检测到醚类、酚类等风味物质,但含量均相对较少,对产品风味的贡献率较小。

3 结论

a)本研究通过PCA建立评价模型得出综合品质评分由高到低依次为:超声联合酶解处理发酵整果枸杞子>无预处理发酵整果枸杞子>未发酵整果枸杞子,枸杞子经发酵后类胡萝卜素、花青素含量有一定的损失,但总酚、总黄酮含量及抗氧化能力得到了显著提升,超声联合酶解处理进一步增强了发酵强度、活菌数和抗氧化能力,结合OPLS-DA确定活菌数及还原糖含量为超声联合酶解处理对发酵整果枸杞子品质影响的差异指标。

b)未发酵整果枸杞子中共鉴定出58种挥发性物质,醇类、酸类对风味的贡献较大;发酵后的枸杞子风味物质种类和含量均有所提升,其中超声联合酶解预处理后的发酵枸杞子挥发性风味物质增加到72种,且烯烃类化合物相对含量达到了32.64%,赋予其柠檬、薄荷似偏向清新风味,丰富枸杞子的风味层次。

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Quality evaluation of lactic acid bacteria fermented Lycium barbarum

CHEN Junran1,LI Keyi1,LI Haichuan1,BAI Yahui1,HU Yunfeng1*,MA Yun2,DUAN Yazong3

1(College of Food Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

2(Zaokang Gojiberry Inc.,Zhongwei 751700,China)

3(Tianjin Yesen Fruit Tree Planting Professional Cooperative,Tianjin 301913,China)

ABSTRACT To fully exploit the resources of Lycium barbarum,this study investigated the fermentation of Lycium barbarum using whole fruit as raw material and lactic acid bacteria.Ultrasonic combined with enzymatic treatment technology was used as pretreatment to shorten fermentation time and improve the functionality and flavor of Lycium barbarum,and the quality indexes were tested.The results showed that the total phenols,total flavonoids,and antioxidant capacity of Lycium barbarum were significantly improved after fermentation,and the ultrasonic combined enzymatic treatment further enhanced the fermentation strength,viable bacterial count,and antioxidant capacity.The comprehensive evaluation function of the principal component analysis showed that the quality of Lycium barbarum was best after the combined enzymatic treatment,and the orthogonal partial least squares discriminant analysis identified the number of viable bacteria and reducing sugars as the difference indicators of the effect of the combined enzymatic pretreatment on the quality of fermented whole Lycium barbarum.The volatile flavor species and content of the fermented Lycium barbarum were increased after the pretreatment,and the relative content of olefins reached 32.64%,which gave it a lemon-like and mint-like fresh flavor,masked the irritating odor to a certain extent,and enriched the flavor level of the Lycium barbarum.

Key words Lycium barbarum; Lactobacillus; whole fruit fermentation; ultrasonic pretreatment; enzymatic pretreatment

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035853

引用格式：陈君然,李岢祎,李海川,等.超声联合酶解处理对发酵整果枸杞子品质影响[J].食品与发酵工业,2024,50(18):201-208.

CHEN Junran,LI Keyi,LI Haichuan,et al.Quality evaluation of lactic acid bacteria fermented Lycium barbarum[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(18):201-208.

第一作者：博士,讲师(胡云峰研究员为通信作者,E-mail:hu-yf@163.com)

基金项目：天津市林果现代农业产业技术体系项目(ITTHRS2021000);天津市科技支撑重点项目(20YFZCSN00980)

收稿日期：2023-04-17,改回日期：2023-06-03