调理菜肴作为预制菜的一类可很好满足消费者对新鲜和方便的需求,如何避免消费者对防腐剂排斥的同时防腐保鲜调理菜肴、延长货架期显得十分重要。水产品预制菜的质量安全会受到原材料的影响[1],特别是,淡水鱼因其高水分、高内源酶活性等特点,在加工、贮运、销售等一系列环节中都极易受到微生物的作用而腐败变质,从而引起水产品预制菜质量的下降。气单胞菌属、假单胞菌属和希瓦氏菌属是变质草鱼的主要腐败菌群,其中,前2种微生物都可产生胞外酶加速肉的分解,腐败希瓦氏菌可以产生H2S,它们都可分解肉中的氨基酸,产生胺类物质,使食品腐败变质并产生异味[2-3],严重影响食品质量与安全。据报道,草鱼死后的36 h,苦味氨基酸的含量逐步增加,趋势与甜味氨基酸相反,货架期仅为6 d[4-5]。因此,寻求预制菜中淡水鱼类食材的天然防腐保鲜措施非常必要[6]。
香辛料精油作为可替代化学防腐剂的天然防腐剂,目前在果蔬、禽畜、海鲜等防腐保鲜领域备受关注。香辛料精油是一种富含天然活性成分的植物提取物,对许多真菌和细菌都展现出良好的抑菌效果,且具有强抗氧化性、环境友好等优点,在食品保鲜方面具有很大的应用潜力[7-8]。ZHANG等[9]使用0.1%(体积分数)的牛至精油作用于草鱼片,发现可显著降低乳酸菌数量,延长4 d保质期。CAI等[10]使用0.5%(体积分数)百里香精油结合壳聚糖涂层包被草鱼片,发现该处理可保持鱼肉硬度,延缓油脂和蛋白质氧化。
本研究分析了5种从传统食用香辛料中提取的精油对淡水鱼优势腐败菌的抗菌活性,优选出抗菌效果最好的3种精油复配物,并结合真空包装技术对草鱼肉进行低温保鲜,探究其对鱼肉保鲜期间微生物总数、pH值、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)以及生物胺的影响,以期为延长预制菜调理草鱼食材货架期的生产实践提供科学依据和数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活草鱼(2±0.1) kg,购于广州大学城南亭村农贸市场,去头、鳞、内脏后立即低温保藏备用;食品级肉桂、牛至、百里香、香茅、山苍子精油,广州市香思馨情健康科技有限公司提供;荧光假单胞菌ATCC 35858、嗜水气单胞菌ATCC 35654,广东省微生物研究所;腐败希瓦氏菌ATCC BAA-1097,广州市左克生物科技有限发展公司;平板计数琼脂,北京奥博星生物科技有限公司;假单胞菌CFC选择性培养基,青岛日水生物技术有限公司;乙腈,上海迈瑞尔化学技术有限公司,丙酮,中国赛默飞世尔科技有限公司,均为色谱纯。其他试剂皆为分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2F超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;LRH-70F生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;YXQ-70A高压灭菌锅,上海博讯实业有限公司;SHA-BA水浴恒温振荡器,常州澳华仪器有限公司;PHS-3C pH计、DDSJ-308F电导率仪,上海仪点科学仪器股份有限公司;H1750R冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;LC-20AT高效液相色谱仪,岛津(香港)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 单一精油的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)测定
采用固态直接接触法测定精油对供试菌的MIC。分别吸取不同浓度精油100 μL放入已灭菌的空培养皿中,倒平板,轻轻摇晃使精油与培养基混合均匀,使混合培养基中保持浓度梯度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3 μL/mL。静置冷却后,取100 μL 稀释到106 CFU/mL的菌悬液加入已倒好的培养皿中,涂匀培养,丙二醇作为空白对照。于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,平板内无菌生长的最小精油浓度为最小抑菌浓度。
1.3.2 香辛料精油的复配
本着经济的原则,选择效果较好且原料价格较低的肉桂精油与其他精油进行复配。以各精油的MIC值为基础,用棋盘稀释法进行复配,以各精油的1/8 MIC,1/4 MIC,1/2 MIC,1 MIC进行联合,具体见图1。采用固体接触法测定精油两两联合后的MIC值,并按公式(1)计算分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FIC),每个组别重复3次。FIC指数判断标准:FIC≤0.5,表现为协同作用;0.5
FIC值
(1)
图1 棋盘稀释法示意图
Fig.1 Schematic diagram of chessboard dilution method
1.3.3 复配精油浸泡液的制备与草鱼肉片包装处理
5 mL 1,2-丙二醇与495 mL去离子水混匀后添加0.5%(体积分数)的复配精油,使用磁力搅拌器加热和搅拌至分散状态,制备成体积分数为0.5%复配精油粗乳液作为草鱼片浸泡液。无菌条件下,将草鱼背部肌肉切成3 cm×3 cm×2 cm的肉片,随机分成4组,浸入到500 mL的精油粗乳液中浸泡5 min,取出沥干,立即进行包装,在4 ℃下贮存13 d,每3 d进行取样分析,试验设计如表1所示。
表1 试验设计表
Table 1 Experimental design
组别浸泡液包装空白去离子水普通包装真空去离子水真空包装0.5%复配精油0.5%(体积分数)复配精油普通包装0.5%复配精油+真空0.5%(体积分数)复配精油真空包装
1.3.4 微生物总数(total viable count,TVC)测定
参考GB/T 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定。使用假单胞菌CFC选择性培养基和铁琼脂培养基分别检测鱼肉中假单胞菌总数和产硫菌总数,于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。
1.3.5 pH值的测定
参考GB/T 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》测定。
1.3.6 电导率的测定
参考任丽琨等[11]的方法进行。取5 g(精确到0.01 g)混匀鱼肉置于烧杯中,加入45 mL去离子水,均质后静置30 min,过滤后取滤液测定。
1.3.7 挥发性盐基氮的测定
参考GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基总氮的测定》中的半微量定氮法测定。
1.3.8 生物胺的测定
参考GB/T 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定方法》测定。
1.4 数据处理
每组样品平行3次实验。采用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行差异显著性分析,显著水平为0.05。Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 五种常用香辛料精油对淡水鱼优势腐败菌的抗菌活性
表2为5种常见的食用香辛料精油对淡水鱼3种优势腐败菌的MIC测定结果,5种植物精油都表现出良好的抗菌效果,强弱依次为牛至>百里香>肉桂>香茅>山苍子。3种供试菌中,腐败希瓦氏菌对精油的敏感性要强于其他2种菌种,STERNISA等[12]使用15种精油对假单胞菌和希瓦氏菌的抑菌实验也发现了类似的结果。精油的抗菌能力和抗菌机制与其中的活性成分又有很大的关联。肉桂精油中的肉桂醛可通过破坏细胞膜,抑制细胞分裂和生物膜形成达到抗菌作用[13]。牛至、百里香精油中含有的香芹酚和百里酚都是亲脂性化合物,对细胞膜结构具有很强的亲和力,可损害和干扰细胞膜,使细胞内容物泄露,导致细菌坏死和凋亡[14-15]。两者对细菌的作用机制相似,但因精油中成分种类与含量不同,所以对供试菌的抗菌能力有差别。
表2 五种单一精油的MIC 单位:μL/mL
Table 2 MIC of 5 kinds of single essential oils
组别牛至百里香肉桂香茅山苍子嗜水气单胞菌0.250.50.50.51荧光假单胞菌0.1250.250.50.50.5腐败希瓦氏菌0.06250.250.1250.250.25
2.2 植物精油复配的协同抑菌效应
精油两两复配后的FIC见表3,由判定标准可知,肉桂精油与百里香精油、牛至精油的复配对嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌均表现为相加作用,对荧光假单胞菌表现为协同作用,FIC指数为0.5。肉桂精油和百里香精油的最佳复配体积比为2∶1。肉桂精油和香茅精油、山苍子精油的复配分别在嗜水气单胞菌、腐败希瓦氏菌中表现为无关作用,对其他供试菌种都为相加作用。由于牛至、百里香、肉桂精油表现出较强的杀菌性能且两两复配表现为相加或协同作用,因此将三者进行复配,结果见表4。
表3 复配精油的抑菌效果 单位:μL/mL
Table 3 Inhibition effect of compound essential oils
致腐菌名称指标肉桂+牛至肉桂+百里香肉桂+香茅肉桂+山苍子肉桂牛至肉桂百里香肉桂香茅肉桂山苍子MIC单用0.50.250.50.50.50.50.51嗜水气单胞菌MIC联用0.1250.1250.250.1250.50.06250.250.5FIC指数0.750.751.1251精油配比1∶12∶18∶11∶2MIC单用0.50.1250.50.250.50.50.50.5荧光假单胞菌MIC联用0.1250.03130.1250.06250.250.250.250.25FIC指数0.50.511精油配比4∶12∶11∶11∶1MIC单用0.1250.06250.1250.250.1250.250.1250.25腐败希瓦氏菌MIC联用0.03130.03130.06250.03130.06250.06250.06250.25FIC指数0.750.6250.751.5精油配比1∶12∶11∶11∶4
表4 肉桂-百里香精油和牛至精油的FIC指数
Table 4 FIC index of oregano essential oil and cinnamon/thyme essential oil
致腐菌名称肉桂-百里香精油MICA/(μL/mL)牛至精油MICD/(μL/mL)单用联合单用联合FIC指数嗜水气单胞菌MICA1(0.38)1/2MICA1MICB1(0.25)1/8MICB10.625荧光假单胞菌MICA2(0.19)1/2MICA2MICB2(0.125)1/8MICB20.625腐败希瓦氏菌MICA3(0.09)1/4MICA3MICB3(0.0625)1/8MICB30.313
复配后的FIC值见表4,由FIC值的判断标准可知,肉桂-百里香精油和牛至精油联合使用后,对嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的FIC值为0.625,都表现出了相加作用,肉桂-百里香精油和牛至精油的体积比约为4∶2∶1。对腐败希瓦氏菌表现为协同作用,体积比约为2∶1∶4。考虑到抑菌广谱性,选择V(肉桂)∶V(百里香)∶V(牛至)为4∶2∶1为最佳复配体积比。
2.3 复合精油对包装草鱼片的保鲜效果
2.3.1 草鱼片贮藏期间微生物总数(total viable counts,TVC)变化
TVC是评价鱼肉受微生物污染程度的重要参数。如图2所示,鱼肉样品的初始TVC总量为5.4 lg CFU/g,精油处理后的鱼肉样品初始TVC总量为4.9 lg CFU/g。13 d时,4个组别的TVC含量分别为9.1、7.4、8.3、6.5 lg CFU/g,上升趋势放缓。其中,0.5%精油(体积分数,下同)+真空组的样品期微生物总量始终保持在7 lg CFU/g以内,仍未达到食品中微生物总量的可接受上限。假单胞菌是引起冷藏肉制品变质的主要腐败菌群之一[3],其增长趋势与TVC相似。第13天,相比对照组8.7 lg CFU/g,真空组、0.5%精油组、0.5%精油+真空组别分别减少了2.0、1.1、2.5个对数增长值。低温条件下,产硫菌(如腐败希瓦氏菌)的生长繁殖会使鱼肉产生异味。保鲜的最后一天,空白组的产硫菌数量为8.4 lg CFU/g,其他3组为6.5、6.0、5.0 lg CFU/g,其中,使用精油浸泡过的鱼肉的产硫菌总数一直保持在较低的范围内,这与体外抑菌实验结果相对应,说明精油处理可通过减少产硫菌的生长。
A-TVC;B-假单胞菌总数;C-产硫菌总数
图2 贮藏期间草鱼微生物数量的变化
Fig.2 Changes of total bacterial count of grass carp during storage
保鲜末期,空白组的微生物总数为9.1 lg CFU/g,假单胞菌数量为8.7 lg CFU/g,产硫菌数量为8.4 lg CFU/g,后两者较高的含量表明,假单胞菌属和产硫菌属可能是草鱼肉的优势腐败菌群,与先前的研究得出的结论一致[16]。相比于空白组,0.5%精油+真空组的鱼肉在最后一天的微生物总数、假单胞菌数量、产硫菌数量分别下降3.2、2.5、3.5 lg CFU/g,说明0.5% 复配精油浸泡与真空包装相结合的方式可以减少草鱼肉在低温贮藏下微生物的生长,尤其是产硫菌。空白组的保质期为7 d,相较于空白组,0.5%精油组可延长3 d保质期,0.5%精油+真空组可延长6 d 以上的保质期。综上,0.5%精油+真空处理是减缓草鱼肉冷藏过程中微生物增殖的有效途径。
2.3.2 草鱼片贮藏期间pH值变化
pH值是衡量鱼肉的重要质量指标。如图3所示,在13 d的保存期内,所有组别的pH值随时间的延长呈现出先下降后上升的趋势。鱼肉的初始pH值为6.42,处于新鲜硬骨鱼pH范围内(6.0～7.0)。在保存过程中,鱼肉会因产乳酸菌的增殖而导致pH值下降,除真空组和0.5%精油+真空组在第7天达到最低之外,其余组均在第4天达到最小值。之后,所有样品的pH值均逐渐升高,这与蛋白酶的数量和活性有关,蛋白质的降解产生氨、三甲胺等碱性化合物,导致pH值上升[17-18]。处理组与对照组的pH值在前4 d 无显著性差异,在第10和13天时存在显著差异,pH值由大到小依次为空白组>0.5%精油组>真空组>0.5%精油+真空组,这是由于使用精油或真空处理可对微生物的繁殖起到不同的抑制作用,所以鱼肉中碱性化合物含量不同。
图3 贮藏期间草鱼pH的变化
Fig.3 Changes in pH of grass carp during storage
2.3.3 草鱼片贮藏期间电导率变化
电导率(electric conductivity,EC)可反映鱼肉组织中电解质的浓度,组织中的蛋白质、脂肪等大分子物质因会分解成氨基酸、短链脂肪酸等具有导电性的小分子物质,使鱼肉浆液中电导率增大[19]。电导率越大,说明鱼肉被分解的越严重,鱼肉品质越不好。图4为实验期间对照组和实验组的电导率变化情况。鱼肉的初始EC值为1 050 μs/cm,所有组别的EC值均随贮藏期的延长而增大,贮藏13 d后,空白组为2 105 μs/cm,真空、0.5%精油、0.5%精油+真空组的电导率值分别为1 612、1 892、1 400 μs/cm,显著低于空白组。说明精油和真空处理都可以抑制微生物引起的大分子物质分解,从而减缓电导率的增加。
图4 贮藏期间草鱼电导率的变化
Fig.4 Changes of electrical conductivity of grass carp during storage
2.3.4 草鱼片在贮藏期间TVB-N变化
鱼肉在贮藏过程中,会受到微生物作用和酶促作用,导致蛋白质被分解,产生氨或胺类具有挥发性的含氮物质,其含量可反映鱼肉的新鲜程度。如图5所示,所有样品的初始TVB-N值为14.4 mg/kg,处于一级鲜度(≤15 mg/kg)内。所有样品在前4 d的TVB-N值增长缓慢,推测是微生物总量较少,分解速度较慢。随着第7天空白组的TVC含量超过限定范围,其TVB-N值将近40 mg/kg,处于不可食用的范围,其他组的增长速率仍较缓慢。与对照组和0.5%精油组相比,真空组、0.5%精油+真空组在整个贮藏过程中的TVB-N值一直保持在较低的范围内,说明该2种处理方法更好地抑制微生物的增殖和酶促反应,减缓蛋白质的分解速度,从而使鱼肉保持新鲜,效果与刘婷等[20]在保鲜羊肉中使用牛至精油结合真空包装的结果类似。
图5 贮藏期间草鱼TVB-N含量的变化
Fig.5 Changes of TVB-N content of grass carp during storage
2.3.5 草鱼片在贮藏期间生物胺变化
生物胺是由氨基酸脱羧后形成的含氮元素小分子有机化合物,适量的生物胺对身体有益,但摄入过量的生物胺会对人体产生危害[21]。图6是对照组和处理组在4 ℃下贮藏了13 d的生物胺含量变化,相较于最后一天空白组的生物胺总量为2 427.8 mg/kg,真空、0.5%精油、0.5%精油+真空组的含量分别为643.5、1 215.1、422.1 mg/kg,分别减少73.5%、50%、82.6%生物胺的产生,说明各处理组都表现出较强的抑胺能力,尤其是对腐胺、尸胺、组胺、酪胺。
图6 贮藏期间草鱼生物胺含量的变化
Fig.6 Changes of biogenic amines content of grass carp during storage
注:A-空白组;B-真空组;C-0.5%精油组;D-0.5%精油+真空组。
腐胺、尸胺和组胺被认为是对鱼类质量影响最重要的胺类。空白组的腐胺、尸胺、组胺初始含量分别为20.6、8.4、0 mg/kg,含量在第7天的时候快速上升,其中腐胺的增长速率最快,成为草鱼贮藏期间的优势胺,这与它的多种产生途径有关,假单胞菌和产硫菌的生长代谢有助于产生腐胺[22],而精油浸泡处理对假单胞菌、希瓦氏菌的生长起抑制作用,因此腐胺含量一直处于较低的状态。相比之下,组胺产生的途径单一,含量上升趋势缓慢,组胺在前期未检出可能是与样品内的嗜温性细菌和组胺脱羧酶的活性低有关[23-25],个别组在贮藏后期检出,说明新鲜鱼肉中这组胺类物质的含量都很低。
2.3.6 草鱼片贮藏期间各品质指标的相关性分析
图7为草鱼贮藏期间各个保鲜指标间的相关系数。结果显示,草鱼的微生物总数、假单胞菌总数、产硫菌总数、pH值、TVB-N值和生物胺总量之间都有极显著的正相关性(P<0.01),说明鱼肉贮藏过程中,这些指标与其品质劣变有较大关系。电导率与其他指标之间存在很微弱的相关性,所以,电导率可能不适合作为冷藏草鱼品质检测的重要指标。
图7 贮藏期间草鱼品质指标变化的相关性分析
Fig.7 Correlation analysis of quality indicators of grass crap during Larimich storage
注:“*”P<0.05,“**”P<0.01。
3 结论
本文通过棋盘稀释法,将牛至、百里香和肉桂3种香辛料精油进行复配,得出一种对淡水鱼优势腐败菌有良好抑制作用的复配精油,最佳复配比为V(牛至)∶V(百里香)∶V(肉桂)=1∶2∶4。在此基础上研究了复配精油结合真空包装对草鱼肉低温贮藏的影响,发现该方式可有效抑制草鱼肉片在4 ℃贮藏期间的微生物生长繁殖,尤其是产硫菌;还可延缓pH、电导率和TVB-N的快速上升,减少82.6%生物胺的产生,维持草鱼肉的新鲜度,延长6 d以上的保质期。本文是基于4 ℃恒温冷藏下得出的结论,可为草鱼的贮藏保鲜技术提供理论参考。在实验期间,使用紫外分光光度法测定了鱼肉样品中的精油含量,数据显示,生鱼肉中精油含量为8.07 μg/kg,蒸煮1 min后含量下降至2.00 μg/kg,蒸煮5 min后含量为0.68 μg/kg,残留量较低,但应用至水产保鲜中,该添加量还有待研究,且该方法在水产品预制菜行业的应用中尚存不足,如水产品预制菜的原料并非是均一物质,浸泡处理容易产生精油分布不均匀的现象,风味不能统一;冷链过程温度不稳定,温度反复变化容易引起肉质、精油保鲜性能的变化等,面对此类问题,仍需进一步的研究,以期推动我国水产品预制菜的发展。
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