草莓,蔷薇科,具有独特的香气特征和丰富的营养物质。草莓具有一定生物活性,这些特性归因于酚类、黄酮类化合物以及具有抗癌和抗炎特性的花青素[1]。酿制草莓酒,可有效解决原料保鲜时间短,不便运输,难贮藏,极易腐烂等问题[2]。既可以丰富果酒市场,也可增加草莓的利用率及附加值。

果酒中通常含有一些分散的胶体颗粒物质,这对贮存和消费有很大的影响。澄清工艺可以去除果酒中导致浑浊的悬浮颗粒和胶体颗粒,还可以去除不稳定的大分子物质[3]。草莓含有的蛋白质、胶体及单宁等物质,发酵后会导致浑浊和沉淀,影响草莓酒品质。在加工和贮存过程中,在保证草莓酒感官品质及风味特征的同时,如何避免酒体发生浑浊及提高草莓酒贮存稳定性的问题亟待解决。李英蕊等[4]探究了3种澄清剂(果胶酶、皂土、壳聚糖)对葡萄小麦复合酒澄清效果的影响,结果表明,果胶酶澄清效果最佳,花色苷等营养物质损失少,透光率、色度均较好。时文青[5]研究了不同澄清剂对黑化红枣酒的影响,实验结果表明壳聚糖具有良好的生物相容性,可以螯合果酒中的部分金属离子,去除大量杂质,澄清效果好。

故本研究以优质红颜草莓为原料酿制草莓酒,拟探索皂土、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVPP)、蛋清粉、壳聚糖、明胶5种不同澄清剂对草莓酒澄清效果、理化指标和挥发性风味物质的影响,结合感官评价,以期优选出草莓酒的最适澄清方案,为草莓酒澄清的深入研究奠定基础,为草莓酒产业化提供有效理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室自酿草莓酒,原料为红颜草莓;X16酵母,法国拉氟德公司;绵白糖,天津市茂达食品有限公司;皂土、PVPP,天津密思特生物科技有限公司;明胶,天津沃太生物科技有限公司;壳聚糖,天津市江天统一科技有限公司;蛋清粉、酒石酸,河南万邦实业有限公司;氯化钠、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖,上海国药集团试剂有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝,天津百奥泰科技发展有限公司;氯化钾、乙酸钠、没食子酸、碳酸钠,天津光复科技发展有限公司;福林酚,上海源叶生物科技有限公司;芦丁,上海迈瑞尔生化科技公司;标准品:2-辛醇,上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TRACE 1310-ISQLT气相色谱-质谱联用仪,美国Thermo Fisher公司;TP-A500型电子分析天平,上海精密科学仪器有限公司;HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;HWS28型电热恒温水浴锅,上海恒科学仪器有限公司;GSP-9160MBE恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;L3660D低速离心机,上海知信实验仪器技术有限公司;L4紫外可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 草莓原酒的酿制

根据前期实验室对草莓酒发酵工艺的探究,挑选优质草莓,破碎后及时添加0.1 g/L焦亚硫酸钾溶液。添加0.02 g/L果胶酶,22 ℃酶解8～12 h。调整成分至总糖质量浓度为180 g/L,总酸质量浓度为7.5 g/L(以酒石酸计)。以X16作为发酵菌种,接种量为0.2 g/L,置于18 ℃发酵,发酵结束后得到草莓原酒。

1.3.2 下胶澄清实验

用适量温水配制5%质量分数的皂土溶液,1%质量分数的明胶溶液,浸泡膨润12～24 h,充分混匀备用;PVPP、蛋清粉和明胶配制为质量分数为1%的水溶液,混匀备用。根据不同澄清剂的适用量设置质量浓度梯度,如表1所示。

1.3.3 草莓果酒理化指标检测

还原糖:斐林试剂滴定法;总酸:指示剂滴定法;酒精度:酒精计法;pH值:pH计法;游离硫及总硫:直接碘量法,采用王华[6]的检测方法;总酚:福林酚比色法;总黄酮:芦丁试剂法,采用张秀玲等[7]方法;花色苷:pH示差法;色度、色调:分光光度计法,采用蒋文鸿等[8]方法进行测定。

1.3.4 挥发性香气成分测定及分析

香气成分萃取:取4 mL酒样放于20 mL顶空瓶中,加入1.5 g氯化钠和40 μL 2-辛醇内标(质量浓度为500 μg/L),55 ℃平衡10 min后顶空萃取20 min。萃取结束后,取出萃取头插入气相色谱进样口,250 ℃解析3 min。色谱条件:HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升温至120 ℃,保持2 min,再以7 ℃/min升温至240 ℃,保持5 min;载气为氦气,流速1 mL/min;进样口温度为250 ℃;柱流量:1 mL/min,分流模式,分流流量20 mL/min。质谱条件:电子电离源(electron ionization,EI),电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;传输线温度:250 ℃;质量扫描范围m/z 33～350,溶剂延迟时间为3 min[9]。

1.3.5 感官评价

感官描述被广泛应用于酒类风味品评中,参考已有研究[10-11]与《葡萄酒工业手册》及GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对本研究感官品评方法进行改进。选择15名系统学习果酒感官品评且年龄在20～26周岁专业人员进行初步实验,共进行3周。首先进行为期2周(每周7 h)的香气识别培训。在初步实验中提供相关参比风味溶液(表2),评价强度分为0～4,依次表现为没感觉、弱、中等、强、非常强。培训2周后检验品评人员对香气强度识别的准确度,选用80%准确描述度的12名品评人员(男女各6名)进行后续实验。感官评估在温度为20～25 ℃的品评室内进行,样品需提前编号,随机顺序呈递给品鉴人员,对草莓酒色泽、澄清度、香气、口感及典型性逐个打分评价,感官评定标准见表3。

1.4 数据处理

利用Microsoft Office Excel 2013对样本所得数据进行处理,采用Origin 8.0绘制主成分分析(principal component analysis,PCA)图,IBM SPSS 26.0进行显著性、单因素方差(邓肯检验,P<0.05)分析,SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA分析。每个样品重复检测3次,最终结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 五种澄清剂对草莓酒澄清效果的影响

皂土的结构为多孔性大分子物质,可通过强大的吸附力吸附引发浑浊的物质,又能通过自带正电荷的Na+和Ca2+等离子吸附草莓酒中带负电荷的果胶、蛋白质和酚类物质[12]。聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone,PVPP)在葡萄酒工业中被广泛用作澄清剂,可吸附单宁絮凝沉淀,进而抑制草莓酒中蛋白质与单宁的结合,从而提高草莓酒的澄清度[13]。壳聚糖是一种具有伯胺基团的天然阳离子聚合物,酒中含有阴性成分,如蛋白质、果胶及纤维素等;在澄清过程中,以上物质与壳聚糖凝聚缠绕,产生沉淀使草莓酒透光率提高[14-15]。蛋清粉与明胶澄清机理相似,主要是利用本身的蛋白质与单宁物质发生化学反应,形成黏稠物质,进而吸收草莓酒中果胶、单宁等胶体物质,使其沉降达到澄清效果[16]。

根据表1中下胶澄清的浓度加入酒样,结果如图1所示。各处理组酒样的透光率均显著高于对照组(明胶组除外),且随着5种澄清剂用量的增加呈先增加后减小或不变的趋势,这是因为澄清剂的过量添加会阻碍酒中悬浮物的聚集和沉淀,并且其本身也会造成酒的浑浊[17]。0.8 g/L皂土与0.3 g/L PVPP的澄清效果最佳,处理酒样透光率较高(94.87%、95.63%)。其次为0.2 g/L壳聚糖,壳聚糖添加量过高会使酒中形成稳定的黏稠体系,不利于澄清。明胶澄清效果较差,这可能是因为明胶属于蛋白类澄清剂,利用本身所带的正电荷与酒中带负电荷的物质聚合沉降[18],而草莓酒中酸性环境接近明胶的等电点,使其呈稳定的凝胶状态,不能很大程度地与酒中的单宁及其他物质聚合沉降,故显现出澄清效果较差的结果。

2.2 五种澄清剂对草莓酒理化指标的影响

根据上文探索各澄清剂的最佳质量浓度(0.8 g/L皂土、0.3 g/L PVPP、0.2 g/L壳聚糖、0.08 g/L蛋清粉和0.1 g/L明胶)进行对比实验。由表4可知,处理组与对照间还原糖含量无显著差异(P>0.05),主要是因为5种澄清剂大多作用于大分子物质,而草莓酒中主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和一些小分子多糖,澄清剂对这些可溶性物质和小分子化合物的吸附效果不明显[19]。对于酒精体积分数而言,各澄清剂处理组与原酒相比无显著变化(P>0.05),这表示乙醇不易与澄清剂发生吸附作用,与屈慧鸽等[20]研究一致。澄清后,各草莓酒样的pH值与对照组相比均有微幅降低,但仍保持在3.2左右,表明5种澄清剂对草莓酒pH值的影响较小。6种草莓酒甲醇含量为0.24～0.3 g/L,符合GB 15037—2006《葡萄酒》中对果酒甲醇含量(<0.4 g/L)的规定。同时,酒样中的游离硫含量为25.15～28.98 mg/L,总硫为127.17～138.48 mg/L,在澄清过程中略有下降且均符合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对果酒中总SO2含量<250 mg/L,游离SO2<50 mg/L的规定。

2.3 五种澄清剂对草莓酒活性物质及颜色指标的影响

酚类物质对人体健康有益,并且是果酒重要的质量参数;但含量过高会导致果酒苦涩味过重,适量减少有益于提升果酒品质。由表5可知,经皂土与PVPP处理后的草莓酒总酚及黄酮含量较低,结合上文研究,两者的澄清效果较好,可通过其氨基化合物中的氢与多酚的氢氧基结合产生吸附作用,故而使酒中总酚及黄酮含量降低[21]。壳聚糖、蛋清粉、明胶对酒总酚及黄酮含量的影响较小,并且,壳聚糖具有抗氧化、灭菌抑菌、保鲜等功效,可以较好地保护酒中多酚物质的挥发与氧化[22];三者总酚保留率分别为85.29%、89.74%、85.46%,黄酮保留率分别为93.55%、93.57%、88.16%。

花色苷是草莓酒重要的呈色物质,对酒的感官品质有重要影响。色度、色调表示酒颜色的呈色强度,可作为酒色泽的评价指标。5种澄清剂均对草莓酒的颜色具有一定吸附作用,皂土与PVPP吸附了草莓酒中过量的显色物质和着色颗粒,色度降低,色调升高,花色苷损失较大(下降43.04%、32.20%);说明皂土与PVPP对草莓酒色泽影响较大,这与卢新军等[23]研究一致。明胶对草莓酒花色苷含量的影响较小,仅下降了9.51%。壳聚糖处理组与原酒色度值接近,花色苷保留率相对较高(79.64%),对酒液颜色影响较小。

2.4 挥发性成分分析

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术对6种草莓酒的挥发性成分进行了分析,结果如附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037458)所示,不同处理组草莓酒的挥发性化合物种类和含量存在显著差异。由图2-a可知,与对照组相比,5种澄清剂处理均显著降低了挥发性物质含量(P<0.05),降幅为13.09%～38.45%,皂土与PVPP对草莓酒挥发性成分含量影响最大,其次为蛋清粉、壳聚糖及明胶。草莓酒中含有醇类16种、酯类42种、酸类5种、萜烯类8种、醛酮及其他类6种。由图2-b可知,原酒中共检出69种挥发性成分,澄清处理组分别检出51、53、64、60、64种,皂土处理组酯类种类损失较多,PVPP醇类物质损失较多。利用Up Set 图来评估不同样本之间的挥发性物质分布与组成的相似性[24];由图3可知,6组酒样共有挥发性成分为37种;除皂土外,其他组酒样共有挥发性成分9种;除皂土与PVPP外,其他组酒样共有挥发性成分4种;可见各处理组与对照组挥发性成分种类有较高的相似性,除皂土与PVPP以外,其他处理组挥发性成分相对丰富。

综上,经过不同澄清剂处理酒样的挥发性风味物质种类及含量会出现不同程度的减少,这与宫鹏飞等[25]的研究结果一致。其中,壳聚糖与明胶处理组酒样品质较高,而皂土与PVPP对草莓酒的挥发性成分造成较大损失,降低了草莓酒的品质。

2.4.1 草莓原酒及不同澄清剂处理酒醇类物质比较

酒中醇类物质主要赋予酒体花香及酒香,但个别醇类物质也会产生负面作用。同原酒相比,5个处理组草莓酒醇类物质含量均低于对照组。皂土、PVPP、壳聚糖、蛋清粉和明胶处理组中醇类含量分别降低了30.04%、12.61%、7.52%、7.60%、3.60%。异戊醇和正己醇具有白兰地和青草味,若在酒中含量过高,会增加酒体的生青味及辛辣味[26];皂土处理后两者显著下降,可能会减少其对草莓酒香气的负面影响,这与牛见明等[27]的研究结果相似;PVPP、壳聚糖、蛋清粉、明胶对正己醇吸附作用不明显,含量仅下降0.76%～3.60%,与对照组差异不显著(P>0.05)。PVPP处理组的苯乙醇(花香)含量与原酒相比显著降低(P<0.05),其他澄清剂对其影响较小;综上,皂土及PVPP对醇类物质影响较大,明胶影响较小,其次为壳聚糖与蛋清粉。

2.4.2 草莓原酒及不同澄清剂处理酒酯类物质比较

在酒中酯类物质主要产生水果香气[28]。酒样中共检出42种酯类物质,在香气成分中占比最大。与对照组相(824.92 mg/L)比,草莓酒酯类物物质含量有所下降,明胶处理组(716.88 mg/L)高于PVPP、壳聚糖和蛋清粉处理组(646.84、704.19、653.97 mg/L),皂土处理组最低(507.77 mg/L)。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯及癸酸乙酯等贡献较大,主要呈果香、蜜香,是草莓酒的主体香气之一。辛酸乙酯在草莓酒中浓度较大,阈值较低,是草莓酒重要的呈香物质[29],PVPP与蛋清粉对辛酸乙酯影响较大,降低了酒中菠萝、梨香气及甜味。与对照相比,皂土处理酒样中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别降低了17.13%、69.17%、25.15%、33.75%,差异性显著(P<0.05),说明皂土减少了草莓酒中的果香;PVPP和明胶对乙酸异戊酯和己酸乙酯含量的影响小,这与鲁榕榕等[30]的研究结果一致。

2.4.3 草莓原酒及不同澄清剂处理酒其他香气化合物比较

少量的脂肪酸有助于改善葡萄酒的风味,但其含量过高时会令人有不快感[31]。皂土处理组对挥发性脂肪酸影响较大,其次为PVPP,壳聚糖影响最小。辛酸给草莓酒带来油脂味,皂土对辛酸有明显的吸附作用,与对照组相比降低了39.96%;处理组中乙酸、洋绣球酸均有所降低,在皂土、PVPP及蛋清粉处理组未检出。萜烯类化合物是草莓酒中重要的特征香气物质,其中反式-橙花叔醇具有苹果香、玫瑰花香等,PVPP处理对其无显著变化(P>0.05),而皂土影响较大;另外,芳樟醇(花香)在加入明胶的草莓酒样中质量浓度较高,与原酒相比无显著性差异(P>0.05),而在PVPP、壳聚糖、蛋清粉处理酒样中未检出,说明可完全吸附芳樟醇。醛酮及其他类物质含量低,占比小,各澄清剂处理组对醛酮类物质浓度影响较小。

2.5 基于草莓酒挥发性香气成分的主成分分析

PCA是一种有效的化学计量学方法。在充分利用大部分原始变量信息的基础上,该方法能将多个指标简化为多个综合指标,进一步简化数据并揭示变量之间的关系[32]。在通过GC-MS获取的不同澄清剂处理草莓酒挥发性成分的基础上,利用PCA统计学对5种草莓酒进行分析,分析结果见图4。

由图4可以直观看出,不同草莓酒之间有明显区分度,且平行样品之间相互聚集。因此,可以根据特征挥发性物质来区分不同草莓酒。PCA得分图中,样品之间距离近则代表差异小,距离远则代表差异明显[33]。由图4可知,皂土位于第二象限,同原酒相距较远,特征挥发性风味物质物质少,对草莓酒风味品质影响较大;与异戊醇、正己醇、2-乙基己醇、4-羟基苯乙烯、红没药醇等物质接近,主要呈现出酒香、花香。明胶处理组与草莓原酒均位于第一象限,说明明胶对草莓酒香气的影响较小,挥发性物质较为丰富。PVPP、蛋清粉与壳聚糖处理组的离散程度较低,表明这3种澄清剂处理草莓酒的香气结构相似;与苯甲醛、苯乙酮、D-柠檬烯、乙二醇二丁酸酯、亚油酸乙酯等物质接近,主要给酒带来坚果香、花香、新鲜橙子香气及木香等。

2.6 基于草莓酒香气挥发性成分OPLS-DA分析

为了更好地识别样本特征,验证PCA的合理性,建立了OPLS-DA模型。本模型解释变异系数R2X为0.954,R2Y为0.789,Q2为0.864,拟合情况良好。由图5-a可知,模型经过200次置换检验得知Q2回归线与纵轴交点为负值,说明不存在过拟合情况[34]。由图5-b得分图中可知,6个样品可被分为3组,第1组为PVPP、蛋清粉与壳聚糖处理组,三者距离较近,未被清晰地分开,表明其香气特征相似;明胶处理组与原酒可被分为第2组,表明明胶的香气特征最接近原酒;皂土为第3组,其风味变化明显。各澄清剂区分效果与前面PCA结果基本一致,可以证明此模型的合理性。

为了进一步分析组间差异挥发性化合物,进行了变量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)分析,VIP值可以量化每个变量对样品分类的贡献,VIP值>1可认为该变量为该判别模型的潜在差异物质,且VIP值越大说明该物质在判别过程中的贡献越大[35]。由图6可知,各酒样中香气VIP值>1的物质共有19种,主要包括二碳酸二叔丁酯、辛酸乙酯,异戊醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯等。以上各类物质是草莓酒中的关键香气物质,作为主要的判别物质使不同处理组得以区分,主要给酒带来菠萝、梨子、香蕉等果香,玫瑰花香和青草香,白兰地和威士忌等酒香,使不同草莓酒具有典型性特征。

2.7 感官评价

本研究从草莓酒色泽、澄清度、香气、口感和典型性对草莓酒进行感官评价。由表6可知,皂土与PVPP处理组澄清度评分较高,酒体澄清透亮;但两者酒脚较厚,对草莓酒色泽影响较大,使草莓酒颜色变淡,偏向橘色调;香气损失较多,浓郁度低;口感单一,酒体轻薄,层次感较差。明胶处理组香气浓郁度高,香气复杂,但酒体中悬浮颗粒较多,澄清度差,有明显浑浊。壳聚糖与蛋清粉在澄清度方面表现较优,果香花香浓郁,酒体醇厚,平衡性较好,典型性突出。综上,壳聚糖与蛋清粉澄清后的草莓酒表现出较高的感官品质。

3 结论

本研究探讨了皂土、PVPP、壳聚糖、蛋清粉、明胶澄清剂对草莓酒澄清效果、理化指标及挥发性物质的影响。研究发现,5种澄清剂对酒的酒精体积分数、总酸含量、pH值等基础理化指标影响较小;根据澄清效果得出各澄清剂的最适质量浓度为:皂土0.8 g/L、PVPP 0.3 g/L、壳聚糖0.2 g/L、蛋清粉0.08 g/L、明胶0.1 g/L。其中0.2 g/L壳聚糖综合得分最高,是草莓酒较理想的澄清剂,其透光率达87.4%,总黄酮含量44.51 mg/L,总酚含量为585.02 mg/L,花色苷含量为142.85 mg/L。通过顶空固相微萃取法与气相色谱-质谱联用技术检测经5种澄清剂澄清后草莓酒中的挥发性风味物质,结果表明,不同处理组草莓酒的挥发性化合物种类和含量存在显著差异,醇类、酯类化合物的含量最高(23.52%、63.33%),挥发性酸类物质次之(7.65%),萜烯和醛酮类化合物含量最少(3.37%、2.13%)。与对照组相比,5种澄清剂处理均显著降低了挥发性物质含量(13.09%～38.45%),皂土与PVPP对草莓酒挥发性成分影响最大,其次为蛋清粉、壳聚糖及明胶。感官评价表明,壳聚糖能更好的降低酒中的苦、涩味,与原酒颜色接近,香气更加平衡协调,感官品质高。综合评定0.2 g/L壳聚糖为草莓酒的最佳澄清方案,研究结果可为草莓酒的澄清生产提供数据支撑和技术参考。

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Effects of five clarifying agents on clarifying effect,physicochemical indexes and volatile flavor substances of strawberry wine

ZHOU Ying,ZHANG Jun*,CHEN Rui,HAO Fengjiao,YU Jie,LI Yunzhe

(College of Food Science and Bioengineering,Tianjin Agriculture University,Tianjin 300392,China)

ABSTRACT The effects of five different clarifying agents including saponite,polyvinylpyrrolidone (PVPP),chitosan,egg white powder and gelatin on the clarifying effect,physicochemical index,volatile composition and sensory quality of strawberry wine were studied.The results showed that the light transmittal of strawberry wine after clarification was significantly increased (P<0.05) by 8.37% to 25.53%.The basic physicochemical parameters such as alcohol volume fraction,total acid and pH had little change,but the contents of total phenol (10.26%-27.75%),total flavone (6.43%-18.88%) and anthocyanin (9.51%-43.04%) were significantly decreased.Headspace solid-phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS technology detected 69 volatile aroma compounds,including 42 esters,16 alcohols,5 acids,8 terpenes,6 aldehydes and other substances.The type and content (11.5%-35.57%) of volatile substances in the wine samples were decreased after gluing and clarifying treatment,and the effect of 0.2 g/L chitosan treatment group on volatile aroma substances was small.The sensory evaluation showed that 0.2 g/L chitosan could better reduce the bitterness and astringency in the wine,and the color was close to that of the original wine,the aroma was more balanced and coordinated,and the sensory quality was higher.A comprehensive evaluation of 0.2 g/L chitosan was the best clarifying solution for strawberry wine,which could provide data support and technical reference for clarifying production of strawberry wine.

Key words strawberry wine; clarification; active substance; aroma component; sensory quality

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037458

引用格式：周颖,张军,陈瑞,等.五种澄清剂对草莓酒澄清效果、理化指标及挥发性风味物质的影响[J].食品与发酵工业,2024,50(18):247-255.

ZHOU Ying,ZHANG Jun,CHEN Rui,et al.Effects of five clarifying agents on clarifying effect,physicochemical indexes and volatile flavor substances of strawberry wine[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(18):247-255.

第一作者：硕士研究生(张军教授为通信作者,E-mail:zjaiwa@163.com)

基金项目：中央引导地方科技发展专项(21ZYCGSN00410);天津市特支计划青年拔尖人才项目(TJTZJHQNBJRC-1-19);天津市技术创新引导专项(21YDTPJC00910)

收稿日期：2023-09-22,改回日期：2023-10-26