酒糟是高粱、大米、糯米等粮食原料或其混合物酿酒后所剩余的固体残渣,是白酒酿造中主要副产物[1]。而合理和充分地利用酒糟这一资源,有利于酒糟副产物相关产品的开发。酒糟成分复杂多样,其中富含蛋白质、纤维素、维生素等多种营养素,同时还含有酚类、多糖和多肽等功能成分[2],具有抗氧化、抑制血管紧张素转换酶和抑制HepG2细胞增殖等[3-4]。多酚类物质是酒糟中重要活性成分之一,而将其提取分离出来可以为今后将其在功能性食品、药品等中应用提供重要依据。
目前酒糟多酚类物质提取方式有传统固液提取、辅助提取(超声和微波)和亚临界水萃取等[5-6]。固液提取及其辅助方式是目前应用较多的,虽操作简便,但耗时长且容易溶剂残留。近年来,为符合可持续发展的要求,绿色萃取技术(亚临界水萃取)及绿色提取剂(深共熔溶剂)回收多酚类物质受到广泛关注。与传统方法相比,亚临界水萃取法虽提取效果显著,但设备依赖性较高。所以寻求绿色环保、经济高效的提取溶剂就变得尤为重要,其中深共熔溶剂就是绿色提取剂中研究较多的一种。深共熔溶剂是由氢键受体(hydrogen bond acceptor,HBA)和氢键供体(hydrogen bond donor,HBD)联合形成的一种新兴溶剂,因其易制备、稳定性好和可回收利用等,被认为是传统提取溶剂的良好替代品[7]。目前国内外不少学者构建了深共熔溶剂(deep eutectic solvents,DES)体系来提取天然产物,张洋洋等[8]采用氯化胆碱与尿素组成的DES体系提取杨树桑黄子实体中的多酚物质,结果显示,DES提取法的多酚提取率是传统方法的1.86倍。DE ALMEIDA PONTES等[9]通过DES(氯化胆碱∶丙二酸=1∶1,摩尔比)提取的橄榄渣酚类总含量比乙醇提取高了9%。总之,DES在活性物质的提取方面都取得了较好的效果。但目前未见深共熔溶剂提取酒糟多酚类物质及其活性的研究报道。
因此,本文采用超声辅助DES提取酒糟多酚类物质,构建适宜于酒糟多酚提取的 DES 体系,采用响应面法优化最佳工艺条件,并对提取产物中酚类化合物进行分析,同时评估酒糟多酚物质的体外抗氧化和降血糖活性,旨在获得一种绿色、高效提取酒糟多酚的方法,以期为酒糟的资源化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒糟,采自于四川宜宾。氯化胆碱、丙三醇、尿素、乙二醇、乳酸、碳酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、DPPH、对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,PNPG)等所有试剂均为分析纯,成都科隆化学试剂公司;没食子酸、原儿茶素、阿魏酸、抗坏血酸(维生素C)等标准品(纯度≥98%),标准物质网标准物质中心伟业计量;乙腈、冰乙酸等试剂为色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;α-淀粉酶(50 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(50 U/mg)、阿卡波糖(纯度≥98%)等,上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
EvolutIon300型紫外可见光光度计,赛默飞世尔科技有限公司;HWS26型恒温水浴锅,上海一恒科技有限公司;GTSONIC-L10型超声波提取仪,固特超声股份有限公司;PB203-N型分析天平,上海力辰仪器有限公司;2500C型304粉碎机,永康市红太阳机电有限公司;SCIENTZ-10 N/C型真空冷冻干燥机,新芝生物科技股份有限公司;HC-2066高速离心机,科大创新股份有限公司;1260型高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酒糟的预处理
将酒糟在温度-80 ℃,真空度10 Pa的条件下真空冷冻干燥48 h,粉碎过60目筛,-4 ℃贮存备用。
1.3.2 深共熔溶剂的制备
按照表1中的摩尔比称取一定量的HBA与HBD物质,然后将2种物质置于恒温磁力搅拌器中,为了降低其黏度,加入20%的水,在80 ℃下加热搅拌4～6 h,直至形成无色透明且稳定的溶液,冷却后置于广口瓶中保存备用。
表1 深共熔溶剂的组成
Table 1 Composition of the DESs
溶剂编号氢键受体氢键供体摩尔比DES-1乳酸1∶2DES-2草酸1∶2DES-3苹果酸1∶1DES-4果糖1∶2DES-5氯化胆碱(ChCl)葡萄糖1∶1DES-6丙三醇1∶2DES-71,2-丙二醇1∶5DES-8乙二醇1∶2DES-9尿素∶1,2-丙二醇1∶1∶1DES-10尿素1∶2
1.3.3 酒糟多酚含量的测定
参考MOHD ROSLI等[10]的方法。取提取液0.2 mL与1 mL 10%(体积分数)福林酚溶液混匀,避光放置10 min,加入0.5 mL 75 g/L碳酸钠溶液并充分混匀,室温避光静置45 min,在760 nm下测定吸光度值,平行测定3次,使用没食子酸标准溶液X1(30～300 μg/mL)为横坐标,吸光度值(Y1)为纵坐标绘制校准曲线,绘制标准曲线:Y1=0.009 4X1+ 0.036 6,R2=0.997 8。结果表示为每克干物质中没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)(mg GAE/g)。
1.3.4 提取工艺优化
1.3.4.1 深共熔溶剂的筛选
称取1 g酒糟粉置于50 mL离心管中,加入20 mL不同提取溶剂,混合均匀,于超声功率500 W,温度40 ℃,提取时间30 min,冷却至室温后过滤,按照1.3.3节测定多酚含量。
1.3.4.2 单因素试验
按一定液料比称取酒糟粉末,与DES溶液混合后置于超声波提取仪中以一定功率提取一定时间后过滤备用,按照1.3.3节测定其多酚含量。设定各因素水平:DES溶液含水率20%～60%、超声时间10～50 min、提取温度20～60 ℃和液料比15∶1～35∶1 (mL∶g)。固定条件DES含水率30%、提取时间20 min、提取温度40 ℃、液料比20∶1 (mL∶g)。
1.3.4.3 响应面试验设计
基于单因素试验,多酚含量为实验的响应值Y,进行响应面试验,利用Design Expert.V8.0.6软件优化提取工艺,确定酒糟多酚最优提取工艺条件,实验设计因素见表2。
表2 响应面实验设计
Table 2 Response surface experimental design
水平液料比(mL∶g)DES-X含水率/%提取时间/min-125∶13525030∶14030135∶14535
注:DES-X为溶液编号,同表1。
1.3.5 酒糟酚类化合物测定
参照SANTOS-MART
N等[11]方法。采用色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(Analytical 4.6 mm×250 mm,5-Micron),流动相乙腈(A)和0.1%冰乙酸水溶液(B)进行梯度洗脱。洗脱流速1.0 mL/min,进样量10 μL,柱温30 ℃,检测波长280 nm,梯度洗脱程序:0～5 min,5%～15% A;5～35 min,15%～35% A;35～40 min,35%～45% A;45～50 min,45%～5% A。标准品和样品溶液均过0.22 μm有机滤膜。根据质量浓度为25～250 μg/mL的酚类标准品进行定量。所有样品一式3份进行分析,结果以样品干重(μg/g)表示。
1.3.6 酒糟多酚体外抗氧化活性
总还原能力的测定参考辛小丽等[12]的方法;DPPH自由基清除能力测定参照AFRIN等[13]的方法;羟自由基清除能力的测定参考文献[14]的方法;ABTS阳离子自由基清除能力的测定参考DE SENA ANDRADE等[15]的方法。
1.3.7 酒糟多酚体外降血糖活性测定
参考羡荣华等[16]的方法并稍作修改。α-淀粉酶抑制活性的测定:取0.5 mL 1 U/mL α-淀粉酶溶液和0.5 mL样品混合后37 ℃水浴15 min,再加入1 mL 1%淀粉溶液后37 ℃水浴10 min,最后再加入1 mL DNS试剂,沸水浴15 min,冷却后在540 nm处测定吸光值,以阿卡波糖作对照,按照公式(1)计算抑制率:
抑制率
(1)
[:A1为实验组吸光值,A2为背景组吸光值,A0为对照组吸光值。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定:取0.5 mL α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)和 0.5 mL样品混合均匀,37 ℃水浴20 min后加入1 mL 0.1 mol/L pH 6.9磷酸缓冲液和0.5 mL 0.3 mg/mL PNPG,继续在37 ℃条件下水浴20 min。最后加入1 mL Na2CO3溶液(0.2 mol/L)终止反应,在405 nm处测定吸光度,阿卡波糖作对照,计算同公式(1)。
1.4 数据处理与统计分析
响应面设计及其数据处理使用Design Expert.V8.0.6,使用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析,Origin 8.5制图,每组试验样品平行测定3次,结果以均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 深共熔溶剂的筛选
通过考察10种DESs提取的酒糟提取物中多酚含量筛选出最适宜提取酒糟多酚的DES体系,同时与传统溶剂水和70%(体积分数)乙醇进行对比,结果如图1所示。与传统溶剂水(1.22 mg GAE/g)和70% 乙醇(2.91 mg GAE/g)相比,DES-4(4.41 mg GAE/g)回收多酚的性能最高,其次是DES-9(3.59 mg GAE/g)、DES-5(3.51 mg GAE/g)、DES-2(3.24 mg GAE/g)和DES-10(3.23 mg GAE/g),其他组合的 DES 的性能较低。此外,
RAZBOR
EK等[17]通过DES提取黑莓果实中的酚类物质,筛选得到的最优DES组合为氯化胆碱-果糖,与本实验结果相似。故选择DES-4(氯化胆碱-果糖)进行后续试验。
图1 不同溶剂体系对酒糟多酚含量的影响
Fig.1 Effects of different DESs on the content of DGPs
注:误差棒以标准误差(±SE)表示,不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 单因素试验
2.2.1 深共熔溶剂含水率对酒糟多酚含量的影响
DES因HBA和HBD之间的氢键网络,使其黏度较高,溶剂中自由基团的移动受到限制,而加入适量的水,不仅可以降低溶剂黏度,也能调节其表面张力和极性,从而改善提取性能[18]。由图2-A所示,当DES含水率从20%增加到40%时,多酚含量从3.59 mg GAE/g升高到5.84 mg GAE/g,这可能是由于随着DES黏度降低,提取介质的扩散速率加快,同时溶剂的极性也随之增大,从而提高了提取效率。而当DES含水率继续增大时,酒糟多酚含量下降了19%左右,可能是过多的水分破坏了DES的氢键网络结构,使得DES与目标物质之间的相互作用力减弱。因此,选取含水率40%的DES进行后续试验。
A-DES含水率;B-提取时间;C-液料比;D-提取温度
图2 不同提取因素对酒糟多酚含量的影响
Fig.2 Effect of different extraction factors on the content of DGPs
2.2.2 提取时间对酒糟多酚含量的影响
提取时间对酒糟多酚含量的影响结果如图2-B所示,提取时间在10～30 min时,酒糟多酚含量显著增加,呈现出指数增长,最高达到4.78 mg GAE/g;但长于30 min,酒糟多酚含量呈现下降趋势;提取时间在40～50 min时,酒糟多酚含量稳定在4.15 mg GAE/g左右。这可能是超声的空化作用使植物细胞壁迅速破裂,大部分的多酚释放到溶剂中。但时间过长,超声内温度升高,部分多酚可能开始分解,导致提取性能下降[19]。因此,选取提取时间30 min进行后续试验。
2.2.3 液料比对酒糟多酚含量的影响
由图2-C可知,当液料比从15∶1增加到30∶1(mL∶g)时,多酚含量从3.20 mg GAE/g提高到6.11 mg GAE/g,提取性能显着增强。当液料比增加时,原料和溶剂之间的浓度梯度增大,其相互作用也更大,提高了提取效率。而当液料比达到35∶1(mL∶g)时,多酚含量为3.52 mg GAE/g,这可能是因为液料比过大会导致DES对目标物质的溶解以达到饱和状态,提取效率降低[20]。故选用液料比30∶1(mL∶g)进行后续试验。
2.2.4 提取温度对酒糟多酚含量的影响
温度对多酚含量影响结果如图2-D所示,温度在20～40 ℃时,多酚含量呈现增加趋势,当温度达到40 ℃,多酚含量增加到4.70 mg GAE/g,但当温度从40 ℃升高到50 ℃时,多酚含量急剧下降,而继续增加温度至60 ℃时,多酚含量趋于稳定。提取温度在20～40 ℃时,可能由于DES分子动能增加,DES黏度降低,溶剂与溶剂的相互作用增强,从而提高了提取效率。然而,继续升高温度可能会导致生物活性物质降解,同时空化的强度随着温度的升高而下降,提取效率随之降低[21]。故选取提取温度40 ℃进行后续试验。
2.3 响应面结果分析
2.3.1 模型拟合与方差分析
为了优化酒糟多酚提取工艺,在单因素试验结果的基础上,固定提取温度40 ℃,采用响应面对多酚含量影响较大的3个因素(DES含水率、提取时间和液料比)进行优化,试验结果见表3。根据表3拟合二次多项式回归方程为:Y=6.05+0.35A+0.33B+0.27C+0.14AB-0.76AC+0.11BC-0.68A2-0.16B2-0.68C2。模型方差分析结果见表4,由表4可知,模型的F值为25.62,P值为0.000 2,表明模型极显著。方程失拟项P=0.137 9>0.05,说明该模型能较好地拟合响应。此外,相关系数R2和调整后的R2分别为0.970 5和0.932 7,表明实验值和预测值之间具有良好的拟合度。一次项和二次项中除B外,其余的P值均小于0.01,表明其对结果的影响极显著;交互项AB的P<0.05、AC的P<0.01。Design-Expert软件系统给出最佳参考工艺为:DES含水率41.57%、液料比30.52∶1(mL∶g)、提取时间30.57 min,在此条件下预测的酒糟多酚含量为6.32 mg GAE/g。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface test design and results
试验号A(含水率)/%B(液料比)(mL∶g)C(提取时间)/min多酚含量/(mgGAE/g)14030∶1306.4424535∶1305.9134530∶1354.7644030∶1306.2453535∶1304.1563530∶1253.4374035∶1254.1284035∶1355.4794530∶1255.70104025∶1355.22114030∶1306.01123530∶1355.55134025∶1254.75144030∶1306.12154030∶1306.28163525∶1304.43174525∶1305.09
表4 二次响应面回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic response surface regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值模型12.1991.3525.620.0002∗∗A1.8911.8935.830.0006∗∗B3.36E-0313.36E-030.0640.8082C1.1311.1321.290.0024∗∗AB0.3110.315.80.0469∗AC2.3412.3444.190.0003∗∗BC0.210.23.710.0955A21.9411.9436.630.0005∗∗B21.7711.7733.520.0007∗∗C21.9511.9536.960.0005∗∗残差0.3770.053失拟项0.2630.0883.330.1379纯度差0.1140.026总和12.5616R2=0.9705R2Adj=0.9327AdepPrecision16.929
注:*为差异显著(P<0.05),**为差异极显著(P<0.01)。
2.3.2 验证试验
为检验模型预测的准确性,采用Design-Expert软件系统给出的最佳工艺条件进行3次平行试验。考虑到实际操作便捷,将提取工艺条件调整为 DES含水率41%、液料比31∶1(mL∶g)、提取时间31 min,其他条件不变,在此条件下进行验证试验,获得的酒糟多酚含量为(6.28±0.18) mg GAE/g,ASD为0.38%,与模型预测值接近,该模型拟合效果较好,此法是有效可行的。
2.4 酒糟多酚含量测定
通过高效液相色谱对酒糟多酚中没食子酸、儿茶素、咖啡酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸等7种酚类物质进行了定量分析,多酚标准品和酒糟多酚样品高效液相色谱图如图3所示,回归方程及酒糟酚类含量结果见表5,除咖啡酸以外,其他6种酚类含量均在180 μg/g以上,对香豆酸含量[(466.7±0.20) μg/g]最高,占7种酚类物质总量的30%左右,其次是儿茶素[(305.9±0.19) μg/g]和没食子酸[(280.7±0.65) μg/g]。此外,王鑫等[20]从白酒酒糟中也检测出了对羟基苯甲酸、对香豆酸和阿魏酸;WANG等[22]检测出酒糟多酚物质包括儿茶素、原儿茶素、阿魏酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸和没食子酸,这与本试验结果相似。但前期研究大多数定性分析,对酒糟多酚物质定量分析研究报道相对较少。本试验虽然在一定程度上弥补了酒糟多酚物质定量研究的空白,但仅对酒糟酚类中7种酚类物质进行了定量分析,后续可进一步探讨其他不同种类酚类物质在酒糟多酚中的含量。
图3 多酚标准品和酒糟多酚的HPLC图
Fig.3 HPLC chromatogram of polyphenol standards and DGPs
表5 七种酚类物质标准曲线及酒糟酚类含量
Table 5 Standard curve of seven phenolic compounds and content of phenolic compounds in DGPs
标准品回归方程决定系数(R2)保留时间/min酚类含量/(μg/g)没食子酸y=14.095x-69.6460.99984.322280.7±0.65b原儿茶素y=7.375x-16.1350.99517.117181.9±0.38c儿茶素y=3.163x-13.9450.99758.981305.9±0.19b对羟基苯甲酸y=8.292x+3.5480.99359.480138.7±0.16cd咖啡酸y=21.027x+16.9120.994910.61515.8±0.25e对香豆酸y=14.838x+2.7520.994914.357466.7±0.20a阿魏酸y=13.781x+7.5640.994615.997180.9±0.70c
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.5 酒糟多酚体外抗氧化活性试验结果
以自由基清除率和总还原能力来评估酒糟多酚的抗氧化能力,结果见图4。清除50%自由基浓度所需的抗氧化剂的量被称为自由基清除效果(IC50),IC50值越低,说明抗氧化潜力越大[23],酒糟多酚清除自由基的IC50值结果见表6。
A-羟自由基清除率;B-DPPH自由基清除率;C-ABTS阳离子自由基清除率;D-总还原能力
图4 酒糟多酚的抗氧化活性试验结果
Fig.4 Antioxidant of DGPs
表6 羟自由基、DPPH自由基、ABTS阳离子自由基抗氧化试验的IC50值
Table 6 IC50 value of antioxidant assay of hydroxyl radical,DPPH radical,ABTS cationic radical
样品羟自由基/(mg/mL)DPPH自由基/(mg/mL)ABTS阳离子自由基/(mg/mL)维生素C0.2630.1680.200酒糟多酚0.8860.2910.302
2.5.1 羟自由基清除能力
如图4-A所示,在0.1～1 mg/mL质量浓度内,酒糟多酚提取物对羟自由基的清除率从2.21%增加到58.61%,并呈剂量依赖性,但清除羟自由基的能力不及抗坏血酸(维生素C)。同时维生素C和酒糟多酚对羟自由基清除率的IC50值分别为0.263、0.886 mg/mL。由此可见,酒糟多酚具有一定的清除羟自由基能力,虽与维生素C比较仍有一定的差距,但可增加酒糟多酚提取物的含量来提高羟自由基清除能力,故可考虑将其开发为天然可食用抗氧化剂运用到保健食品中。
2.5.2 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基是稳定的自由基,当它与抗氧化剂接触时会接收电子或氢原子并变成中性,检测混合物的颜色从紫色变为黄色,吸光度低于对照[24]。由图4-B可知,酒糟多酚质量浓度在0.1～1 mg/mL内,酒糟多酚对DPPH自由基的清除率随着质量浓度增大上升,与维生素C的差距逐渐缩小;当质量浓度达到0.6 mg/mL时增长程度趋于平缓。而当质量浓度为1 mg/mL时,酒糟多酚和维生素C对DPPH自由基清除能力相当,分别为97.27%和97.78%。
2.5.3 ABTS阳离子自由基清除能力
酒糟多酚提取物对ABTS阳离子自由基的清除能力结果如图4-C所示。在质量浓度为0.1～1 mg/mL时,清除ABTS阳离子自由基的能力随浓度增加而增加。当质量浓度达到1 mg/mL时,清除率可达90%左右。同时由表6可知,酒糟多酚和维生素C清除ABTS阳离子自由基的IC50值分别为0.200、0.302 mg/mL。
2.5.4 总还原能力
总还原能力是衡量物质抗氧化能力的重要指标之一,一般两者之间呈正相关[25]。酒糟多酚质量浓度为0.1～0.6 mg/mL的吸光值A700为0.54～1.37,且呈上升趋势(图4-D),维生素C则变化趋势较为平缓;而继续增大样品质量浓度,吸光度值趋于稳定,最高可达到1.41(样品质量浓度1 mg/mL),同样质量浓度维生素C的总还原能力为1.40。可见,在质量浓度1 mg/mL下,酒糟多酚的总还原能力与维生素C相当。
2.6 酒糟多酚的体外降血糖活性
酚类物质因其具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的作用,被认为是具有潜在的替代商品降糖药物(如阿卡波糖)的天然化合物[18]。近年来,天然酚类物质因其安全性而受到研究者的关注。从图5-A可知,随着样品质量浓度的增加,对α-淀粉酶抑制率也随之增加,并具有很好的量剂关系;酒糟多酚质量浓度达到3 mg/mL时,对α-淀粉酶的抑制率为95.25%,与阿卡波糖相差不大(98.68%)。由图5-B可知,随着浓度的升高,酒糟多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性也增强,当酒糟多酚质量浓度为3 mg/mL时,对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达60.94%。综上,酒糟多酚可通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性发挥降血糖功能。这可能跟酒糟多酚中不同种酚类物质之间有关系。FAN等[26]研究发现儿茶素、原儿茶素、对香豆酸等酚类化合物可以显着抑制α-葡萄糖苷酶。此外,刘强等[27]通过建立糖尿病小鼠模型探究了酒糟的体内降血糖功能。结果显示,酒糟能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠的体重和血糖水平,并对胰腺损伤有一定的改善作用。因此后续可考虑从体内进一步评价酒糟多酚的降血糖活性,从而为开发相关功能性食品或药品提供更多的理论指导。
A-α-淀粉酶抑制率;B-α-葡萄糖苷酶抑制率
图5 酒糟多酚的降血糖试验结果
Fig.5 Hypoglycemic of DGPs
3 结论
本文筛选出提取酒糟多酚最佳的 DES体系为氯化胆碱-果糖,最佳提取工艺为DES含水率41%、液料比31∶1(mL∶g)、提取时间31 min,提取温度40 ℃,在此条件下酒糟多酚含量为(6.28±0.18) mg GAE/g。并且酒糟多酚中除咖啡酸以外,其他6种酚类(对香豆酸、儿茶素、没食子酸、原儿茶素、阿魏酸和对羟基苯甲酸)含量均在180 μg/g以上,对香豆酸含量[(466.7±0.20) μg/g]最高,占7种酚类物质的30%左右。同时酒糟多酚提取物表现出较强的体外抗氧化活性和降血糖活性,该试验结果将为酒糟多酚的绿色制备及其作为抗氧化和降血糖功能成分的开发利用提供理论参考。此外,本研究虽运用DES有效提取了酒糟多酚类物质,但缺乏对于DES提取与传统溶剂提取之间酒糟多酚的活性对比研究以及对DES提取机理的探讨,所分析的酚类物质的种类也还不够全面。因此,下一步将重点探讨DES对酒糟多酚活性成分及药理功能的影响、DES提取机理等,以期为酒糟的深度开发利用提供理论参考。
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