酪氨酸(L-tyrosine,Tyr)又称2-氨基-3-对羟苯甲丙酸,分子式为C9H11NO3,由LIEBIG于1846年从酪蛋白中首次发现,是20种氨基酸之一,其晶体呈丝光细针状结晶或结晶性粉末,含有酚羟基,属于芳香族条件必需氨基酸[1]。酪氨酸有2种同分异构体,分别是D-酪氨酸和L-酪氨酸,只有L-酪氨酸具有生理活性,在人与动物的正常生长发育和新陈代谢过程中起到重要作用[2]。
随着对L-酪氨酸功能研究的进一步深入,L-酪氨酸在饲料、化工、医药及食品领域的应用愈加广泛。作为重要饲料添加剂的一种,在日粮中添加一定量的L-酪氨酸可以显著加深淅川乌骨鸡的鸡背和胸肌乌度,也可以在一定程度上提高淅川乌骨鸡的屠宰性能[3];L-酪氨酸作为一种重要的芳香族氨基酸,是在化工领域合成芳香族化合物的重要前体物质,如酪醇作为一种具有高附加值的芳香族化合物,可以用于抗衰老[4]、治疗高血压[5]等,阮小波[6]以L-酪氨酸为反应底物,在模式生物大肠杆菌中设计了一个四酶级联的代谢通路,成功地以L-酪氨酸为底物合成了酪醇;黑色素是一种常见的氨基酸衍生物[7],具有出色的安全性及重要的机体保护作用,如抗氧化[8]、螯合重金属离子[9]等,酪氨酸在黑色素合成中起到主要作用[10];L-酪氨酸作为芳香族氨基酸的一种,会和还原糖类物质发生美拉德反应以增加食品风味,L-酪氨酸也是组成黑巧克力蛋白的重要氨基酸之一,有利于增加巧克力的口感[11]。因此,L-酪氨酸的生产愈发引人关注。
传统的L-酪氨酸生产方式主要是化学合成法和水解法。化学合成法制备L-酪氨酸主要是对另一种芳香族氨基酸L-苯丙氨酸进行羟基化修饰,或者通过对羟基苯甲醛与海因反应产生的产物进行缩合、碱解等反应步骤来获得[12]。化学合成法存在着明显劣势,合成的产物通常为酪氨酸的D型外消旋体,整个生产过程对于生产条件的要求较高,生产时使用的化学试剂也可能造成一定的环境污染[13]。蛋白质水解物提取法制备氨基酸是一种较为简单的制备方法。该方法常利用的蛋白质资源,如动物的毛发、蹄脚等原料,通过水解、脱色、浓缩、结晶等步骤获得较为纯净的酪氨酸[14]。该提取法制备L-酪氨酸的得率通常不够高,并且会产生一定的环境污染,因此不适合大规模制备L-酪氨酸[15]。
随着代谢工程技术在生物合成中的应用越来越广泛,利用微生物代谢工程生产所需的目标产物已经越来越受到大家的重视。微生物合成法相较于传统生产方式,具有原料来源广泛、环境友好、可塑性高等优点[16],已经成为生产L-酪氨酸的新路线。本文综述了L-酪氨酸的合成途径及利用代谢工程提高L-酪氨酸产量的方法,以期为利用微生物高效合成L-酪氨酸的研究提供一定的参考。
1 L-酪氨酸的微生物合成途径
利用代谢工程手段实现微生物高产L-酪氨酸的前提是必须清晰L-酪氨酸的合成途径。如图1所示,L-酪氨酸的合成途径主要分为2部分,首先是从碳源开始到合成L-酪氨酸的重要前体物质莽草酸,第二部分是莽草酸通过一系列基因编码的酶催化反应生成目标产物L-酪氨酸。
图1 L-酪氨酸合成途径
Fig.1 L-tyrosine synthesis pathway
注:图中红色代表过表达,绿色代表弱化,蓝色×代表敲除。glucose:葡萄糖;xylose:木糖;acetate:乙酸盐;Acetyl-CoA:乙酰辅酶A;OAA:oxalaceticacid,草酰乙酸;G-6-P:glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸;PEP:磷酸烯醇式丙酮酸;E4P:4-磷酸赤藓糖;PYR:pyruvate,丙酮酸;DAHP:3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸;DHQ:3-脱氢奎宁酸;DHS:3-脱氢莽草酸;SA:莽草酸;S3P:shikimate-3-phosphate,莽草酸-3-磷酸; X5P:5-phosphoxylulose,5-磷酸木酮糖;PCA:protocatechuic acid,原儿茶酸;chorismate:分支酸;anchranilate:邻氨基苯甲酸盐;prephenate:预苯酸;phenylpyruvate:苯丙酮酸;Trp:Tryptophan,色氨酸;Phe:Phenylalanine,苯丙氨酸;Tyr:酪氨酸。
1.1 莽草酸的合成
莽草酸的合成是从各类碳源代谢中间体磷酸烯醇式丙酮酸(phophoenol pyruvate,PEP)和4-磷酸赤藓糖(erythrose-4-phosphate,E4P)开始,在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(由aroG基因编码)作用下缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino heptulosonate-7-phosphate,DAHP)。因此,莽草酸的合成依赖于糖酵解途径和磷酸戊糖途径来提供它所需要的2种起始物质。DAHP经脱氢奎宁酸合酶(由aroB基因编码)作用下转化成3-脱氢奎宁酸(3-dehydroquinic acid,DHQ),随后在3-脱氢奎宁酸脱氢酶(由aroD基因编码)催化下脱水形成3-脱氢莽草酸(3-dehydrogenated shikimic acid,DHS),DHS再经莽草酸脱氢酶(由aroE基因编码)催化后转化为莽草酸(shikimic acid,SA)。
1.2 L-酪氨酸的合成
莽草酸合成后,经莽草酸激酶(由aroK基因编码)催化后生成分支酸(chorismate,CHA),一部分的分支酸在双功能酶TyrA(由tyrA基因编码)的催化下合成对羟基苯丙酮酸,再通过tyrB基因编码的蛋白酶转氨作用下生成目标产物L-酪氨酸,其余的分支酸则会合成色氨酸以及苯丙氨酸。
2 微生物生产酪氨酸细胞工厂的构建以及优化
构建高产L-酪氨酸的微生物细胞工厂通常有3个关键的步骤,分别是增加前体物质的合成,减少副产物的合成及解除代谢途径中各种反馈抑制。除此之外,改变碳源和使用其他的代谢工程手段达到提高产量的效果。因此,为实现L-酪氨酸的高产,必须从多个方面对于微生物的细胞工厂进行改造。
2.1 增加前体物质合成
构建L-酪氨酸高产菌株时,首先需要考虑的是如何增加前体物质的合成。PEP和E4P的供应对于L-酪氨酸高产必不可少。pyk基因编码的丙酮酸激酶将PEP转化为丙酮酸,为了增加PEP的供给,GOSSET等[17]将pyk基因敲除后增加了L-酪氨酸合成的碳代谢流。ppsA基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸合酶会使丙酮酸转化为PEP,PATNAIK等[18]通过对ppsA基因进行了过表达,显著提高了整个途径中PEP的供给。tktA基因编码的转酮酶将G-6-P转化为E4P,aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶使得E4P和PEP通过反应合成DHAP,因此进一步增加E4P和PEP的供应。LÜTKE-EVERSLOH等[19]对于tktA以及aroG基因进行过表达,显著提高了L-酪氨酸的产量,通过补料分批发酵使得大肠杆菌中L-酪氨酸产量达到了9.7 g/L。
莽草酸是L-酪氨酸合成途径的重要前体物质,积累更多的莽草酸也有利于L-酪氨酸的高产。KOMERA等[20]在大肠杆菌中使用广泛阻遏物TetR和蛋白酶TEVp构建了2个光学遗传系统TPAS和TPRS来分别调控aroB基因和aroK基因,该系统可以做到快速控制基因表达和蛋白质降解,在基因转录和蛋白质表达过程中对莽草酸的积累进行调控,成功地实现了细胞工厂生长和生产过程的分离,在基本培养基中产出35 g/L的莽草酸,并且整个过程不需要添加其他芳香族氨基酸,有效降低了生产成本并极大提高了莽草酸的产量。
2.2 减少副产物合成
在微生物代谢工程中,竞争模块会产生各种各样的副产物,从而分流了碳源至目标产物,因此减少副产物的合成是提高产量的一种有效手段。在L-酪氨酸合成途径中,莽草酸生成后被分支酸分解成3种芳香族氨基酸,除L-酪氨酸外的2种芳香族氨基酸的合成是实现酪氨酸高产的最大阻碍。为了阻断另外2种芳香族氨基酸过多的合成,OLSON等[21]通过敲除编码苯丙氨酸合成的pheL基因和pheA基因,实现了高产苯丙氨酸菌株向生产L-酪氨酸菌株的转变,使得改造后的大肠杆菌摇瓶发酵后生成0.18 g/L的L-酪氨酸。
2.3 解除代谢途径的反馈抑制
L-酪氨酸的整个合成途径中存在着众多反馈抑制,必须解除这些反馈抑制才能够完成L-酪氨酸的大量积累。合成途径中主要的反馈抑制包括L-酪氨酸对于编码DAHP合成酶DS和双功能酶TyrA的抑制以及全局转录因子tyrR对于合成途径的反馈抑制等。为了解除这些反馈抑制,IKEDA等[22]通过利用质粒对编码谷氨酸棒杆菌分支酸变位酶CM的基因csm以及编码DAHP合酶的DS基因进行过表达,使得生产色氨酸的菌株也可以实现L-酪氨酸的高产,补料分批发酵后获得了26 g/L的L-酪氨酸。在大肠杆菌中,aroF、aroG和aroH基因编码DAHP合成酶,这些基因受到L-酪氨酸的反馈抑制,KIKUCHI等[23]对于aroG基因的第146位氨基酸进行点突变,解除了这类反馈抑制。
2.4 改造葡萄糖转运系统以及更换碳源
微生物生产L-酪氨酸常用的碳源为葡萄糖,微生物利用葡萄糖时通常是通过ptsG基因编码的葡萄糖转运途径来摄取[24]。但是对于非PTS的葡萄糖摄取途径来说,可以不消耗PEP,而是通过消耗ATP和磷酸化葡萄糖来摄取碳源,此种方式可以增加PEP的供应。KOGURE等[25]删除了编码葡萄糖摄取途径PTS的ptsG基因,使得传统的葡萄糖摄取途径失活,这一举措使得谷氨酸棒杆菌的莽草酸产量增加至114.1 g/L。对于酪氨酸的产量来说,
等[26]将编码葡萄糖转运系统PTS的基因ptsG敲除后,引入来自于谷氨酸棒杆菌的iolT2基因以及枯草芽孢杆菌的glk基因来实现葡萄糖的摄取,结果显示L-酪氨酸的摇瓶产量为2.1 g/L。
为了进一步提高L-酪氨酸产量,FUJIWARA等[27]利用平行代谢途径工程(PMPE),同时利用葡萄糖和木糖作为碳源来进行研究。PMPE是指在微生物细胞工厂运行过程中,存在着2条代谢途径,分别是产生目标产物的途径和提供细胞正常生长所必需的代谢物的途径,这2条代谢途径在同一菌株中完全分开,互不干扰。将大肠杆菌CFT5菌株中编码丙酮酸激酶的pyrA和pyrK基因敲除,同时敲除了编码PEP合酶的ppsA基因、编码PEP-OAA互相转化的ppc基因和pck基因以及编码2-酮-3-脱氧葡萄糖酸-6磷酸醛缩酶的eda基因,引入并过表达了来自于新月柄杆菌的分别编码木糖脱氢酶和木糖酸内酯酶的xdh基因和xylC基因,并且含有编码反馈抗性分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的tyrAfbr基因,在不影响微生物正常生长的情况下使用葡萄糖和木糖作为共同碳源,利用葡萄糖来生产L-酪氨酸,木糖来提供细胞生长必需的代谢物,可以实现糖酵解和磷酸戊糖途径与三羧酸循环完全分开。结果显示大肠杆菌摇瓶生产出(1.34±0.05) g/L L-酪氨酸,相较于对照菌株增加了1.73倍,相当于理论最大产量的64%。
在另外一项研究中,JO等[28]尝试利用乙酸盐作为碳源高效生产L-酪氨酸。为了获得L-酪氨酸的高产,研究人员通过过表达编码乙酰辅酶A合成酶的acs基因和编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pck基因增强了乙酸盐摄取途径,并且通过使用不同强度的启动子对于编码异柠檬酸裂解酶的aceA基因进行精确调控来优化乙醛酸循环,实现了乙醛酸循环和三羧酸循环的平衡。最终在大肠杆菌中摇瓶生成了0.70 g/L的L-酪氨酸,与亲本菌株相比增加了1.6倍。
2.5 转运系统的改造
在利用微生物细胞工厂生产目标产物时,对于目标产物的转运蛋白进行改造也可以在一定程度上增加最终产量[29]。在大肠杆菌的L-酪氨酸合成途径中,L-酪氨酸的转运系统主要由aroP和tyrP这2个基因编码,其中aroP基因编码的酪氨酸转运蛋白主要是将细胞外的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸转运至细胞内[30],tyrP基因编码的转运蛋白则特异性地将细胞外的酪氨酸转运至细胞内[31]。KIM等[32]在大肠杆菌BTY2.13中过表达aroGfbr、aroL和来自于运动发酵单胞菌的tyrC基因,并且敲除了tyrP基因,最终获得了43.14 g/L的L-酪氨酸。王钦等[33]通过对于aroP基因以及tyrP基因进行同时敲除和单独敲除后得到结论,同时敲除aroP及tyrP基因会影响菌株生长,分别单独敲除基因后L-酪氨酸产量均有所提升,但是单独敲除aroP基因的效果要优于单独敲除tyrP基因,最终在大肠杆菌中进行摇瓶发酵后L-酪氨酸的产量达到了3.74 g/L,较对照菌株提高了19.9%。yddG基因编码的转运蛋白负责将芳香族氨基酸由胞内转运至胞外[34],PING等[35]在敲除aroP和tyrP基因基础上过表达了yydG基因后,细胞内的L-酪氨酸含量下降了60%,产量较对照菌株提升了17.8%,达到了4.97 g/L。
2.6 其他代谢工程手段提高产量
5′-UTR是启动子下游一小段非编码区,其功能类似于RBS序列,相较于普通的RBS序列,5′-UTR含有更多的特殊序列,因此存在更多潜在修饰的可能[36]。为了使得酪氨酸合成途径更加合理有效,KIM等[37]在ppsA基因前引入了含有5′-UTR的启动子,对于ppsA基因的表达进行微调,优化了整个代谢途径中PEP的供给,同时敲除了tyrR基因,解除了终产物L-酪氨酸对于代谢途径的反馈抑制,通过优化后大肠杆菌中L-酪氨酸的产量从1.0 g/L提高到了3.0 g/L。
密码子优化是指在信使RNA的编码区进行的一系列优化行为,包括部分序列的调整以及GC含量的改变,目的是使得蛋白质更好的表达[38]。酪氨酸酚裂解酶(TAL)在酪氨酸合成中起重要作用,XU等[39]筛选了来自于不同菌株的TAL,包括弗氏柠檬酸杆菌(CfTPL)、草欧文氏菌(EhTPL)和荚膜红杆菌(TutA),分别对它们进行密码子优化,同时在大肠杆菌中进行过表达,并对pH值和温度等影响酶活性的因素进行测试,结果显示来自于弗氏柠檬酸杆菌的CfTPL具有更好的稳定性,通过间歇补料发酵后L-酪氨酸产量达到了48.5 g/L,转化率达到了75%。
sRNA(small RNA)是细菌体内的一小段非编码的核糖核酸,由几十到几百个碱基构成,通过与靶向mRNA的碱基配对后影响mRNA的稳定性或者影响其翻译,从而达到调节基因表达的作用[40]。NA等[41]设计了一系列sRNA对14株可以生产L-酪氨酸的大肠杆菌中4个基因(tyrR、csrA、pgi、ppc)分别进行组合调控,发现S17-1菌株中的对tyrR、csrA进行调节后获得了最高的L-酪氨酸产量(2 g/L),再通过对csrA的sRNA进行微调后获得了csrA的最佳表达菌株,该菌株高密度培养后的L-酪氨酸产量为21.9 g/L。
模块化共培养工程是通过将微生物生产代谢途径中各类酶按照性质分别导入至不同宿主细胞内构建一个模块化体系,以弥补单一宿主培养时巨大的代谢负担降低生产效率[42]。JUMINAGA等[43]通过将大肠杆菌的L-酪氨酸合成过程的基因分为2个模块(编码从PEP和E4P合成莽草酸的6个基因为模块一,编码从莽草酸合成L-酪氨酸的5个基因为模块二),再对2个模块进行启动子优化、终止子优化、拷贝数优化等改造,最终L-酪氨酸产量达到了0.44 g/g葡萄糖,为理论产量的80%。
2.7 L-酪氨酸合成的培养基优化
培养基优化是对微生物发酵时使用的培养基通过各种手段进行优化和调整,以消除发酵后期部分发酵产物溶于发酵液后对微生物产生不利影响导致产量降低[44]。L-酪氨酸的溶解度较低,发酵过程中会以晶体的形式出现在发酵液中,氧化锆可以让L-酪氨酸析出更小的晶体,从而促进L-酪氨酸排出细胞以增加产量,郑鹏凌[45]通过对地衣芽孢杆菌培养基中添加氧化锆的量进行优化,发现当添加1 g/L的氧化锆时,L-酪氨酸的产量要显著高于其他添加量,此时产量达到了10.52 g/L。刘韪玮等[46]通过极差分析后确定了大肠杆菌在发酵生产L-酪氨酸过程中培养基中生物素、酵母粉以及磷酸氢二钾为主要影响因素,再通过响应面优化后确认生物素、酵母粉、磷酸二氢钾添加量分别为0.24 mg/L、4.77 g/L、2.35 g/L时,L-酪氨酸产量较优化前提高了25.3%,达到了(56.87±1.24) g/L。
3 总结与展望
L-酪氨酸是具备优异营养功能的芳香族氨基酸,因而在食品、饲料、医药、化工等领域应用广泛。近年来,随着L-酪氨酸的市场需求量不断加大,高效生产L-酪氨酸的研究愈发引人关注。相较于传统的制备方法,代谢工程改造微生物生产L-酪氨酸因其高效、绿色等优势在众多合成方法中脱颖而出。L-酪氨酸的合成分为前体物质莽草酸的合成以及由莽草酸合成L-酪氨酸的2个部分,为了构建一株高产L-酪氨酸的菌株,必须通过增加合成L-酪氨酸的前体物质、减少副产物的合成、解除代谢途径的反馈抑制、改造碳源利用途径、使用其他碳源、改造转运途径等众多手段对微生物进行相应的改造,表1汇总了目前L-酪氨酸生产菌株的改造工作。
表1 生产L-酪氨酸工程菌株的构建
Table 1 Construction of Engineered Strains for L-tyrosine Production
菌株改造策略碳源产量参考文献大肠杆菌过表达:tktA、aroG葡萄糖补料9.7g/L[19]大肠杆菌敲除pheL、pheA葡萄糖摇瓶0.18g/L[21]谷氨酸棒杆菌过表达:csm、DS葡萄糖补料26g/L[22]大肠杆菌敲除:ptsG导入:iolT2、glk葡萄糖摇瓶2.1g/L[26]大肠杆菌平行代谢途径工程葡萄糖+木糖摇瓶(1.34±0.05)g/L[27]大肠杆菌过表达:acs,pck使用不同启动子表达aceA乙酸盐摇瓶0.7g/L[28]大肠杆菌过表达:aroG、aroL、tyrC导入:tyrC敲除:tyrP葡萄糖补料43.14g/L[32]大肠杆菌敲除:aroP葡萄糖摇瓶3.74g/L[33]大肠杆菌过表达:yydG葡萄糖摇瓶4.97g/L[35]大肠杆菌ppsA前增加5′-UTR敲除:tyrP葡萄糖摇瓶3.0g/L[37]大肠杆菌导入:CfTPL对TPL进行密码子优化葡萄糖补料48.5g/L[39]大肠杆菌对tyrR、csrA、pgi、ppc进行组合调控对csrA的sRNA进行微调葡萄糖高密度21.9g/L[41]大肠杆菌模块化共培养葡萄糖补料0.44g/g葡萄糖[43]地衣芽孢杆菌添加1.0g/L氧化锆葡萄糖摇瓶10.52g/L[45]大肠杆菌响应面优化生物素、酵母粉、磷酸二氢钾添加量葡萄糖摇瓶(56.87±1.24)g/L[46]
目前对于L-酪氨酸高产菌株的构建已日益成熟,但是高浓度L-酪氨酸对于菌株的毒性问题仍然没有得到较好的解决,并且生产的碳源只局限于葡萄糖,而使用葡萄糖在进行生产时存在着葡萄糖效应阻碍碳源的高效利用。未来的研究方向将致力于解决菌株对于高浓度L-酪氨酸的耐受性,同时探索更多物美价廉的碳源来生产L-酪氨酸。
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