大部分果蔬具有明显的季节性和地域性,贮藏时间短,采后受呼吸作用、微生物侵害等影响,极易出现腐败变质,导致无法食用,从而影响其经济价值。因此,适宜的保鲜是延长果蔬货架期的有效途径,也是研究热点。草莓组织娇嫩,风味独特,营养价值高,其含水量高达90%,采后不耐贮藏,极大地限制了其经济价值[1]。近年来,新兴的生物保鲜技术因绿色、安全、高效而引起了人们的关注和兴趣。其中,以天然提取物为抑菌剂制备的包装膜或涂膜材料备受研究者青睐[2]。
黄芩苷(C21H18O11,BCL)是从双子叶植物黄芩(Scutellaria baicalensis)根部分离得到的一种黄酮类化合物,具有抗炎、抑菌等作用[3]。近年来,BCL被广泛应用于农产品保鲜。研究指出,负载了BCL、姜辣素的复合保鲜膜对鸡蛋具有较好的保鲜作用[4];喷涂BCL-Nisin复合保鲜液显著降低了香蕉的失重率和褐变程度[5]。另外,含有BCL的复合保鲜液能够有效抑制鲜肉脂肪氧化与蛋白质分解,对鲜肉表现出较好的保鲜效果[6]。
随着人们安全环保意识的增强,生物可降解保鲜膜已成为食品包装的主要材料,其制备工艺主要有流延法和静电纺丝法[7]。静电纺丝技术是一种制备平均直径在亚微米到纳米范围内超细纤维的新工艺,具有简单易行、制备率较高、成本低、纤维性能可控等优点[8]。聚乳酸(poly lactic acid,PLA)是一种新型可降解材料,具有易加工、易成型等优点,广泛用于静电纺丝膜材料制备[9-10]。然而,PLA 缺乏抗菌、抗氧化等性能,作为食品包装材料有局限性,常将其与其他大分子及活性小分子混合用于保鲜膜制备。YANG等[11]利用静电纺丝技术制备了聚乙烯醇/乙基纤维素/茶多酚复合纳米纤维膜,该纤维膜具有较好耐水性和水蒸气阻隔性能,且表现出良好的抗氧化和抗菌活性,可使猪肉的货架期延长3 d。费燕娜等[12]发现,PLA和透明质酸混合物的静电纺丝膜具有抑菌作用。另外,蛋白质也常被作为辅料与PLA混合进行保鲜膜制备,如花生分离蛋白和PLA可通过静电纺丝技术制备出纳米纤维[13]。
酪蛋白(casein,CN)是牛奶中含量最高的蛋白质,由αs1-,αs2-,β-,κ-CN四种单体组成,其等电点为4.6,因此常用酸沉淀法制备,即得酸沉淀CN。CN价格低廉,易于获得,可生物降解,并且具有较高的营养价值[14]。已有研究将CN与聚乙烯醇进行静电纺丝制备了纳米纤维膜。本团队前期将胶束态酪蛋白与PLA共混通过静电纺丝技术成功制备了纤维膜[15]。然而,酸沉淀CN与胶束态酪蛋白结构截然不同,而酸沉CN与PLA静电纺丝膜制备及其在草莓保鲜中的应用研究鲜有报道。
本文以不同配比的CN和PLA为基料,采用静电纺丝技术制备出负载BCL的复合膜;采用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)表征了复合膜的结构,分析了复合纤维膜的热分解特性、亲水性、溶胀性、降解性,并评价了复合膜包装对草莓果实外观、失重率、可溶性固形物含量、硬度的影响。研究结果不仅可为草莓保鲜提供新型膜材料,而且可为拓宽CN和PLA的应用领域提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酸沉淀酪蛋白,实验室自制,总蛋白质含量为(91.37±0.29)%(质量分数);聚乳酸(P875107)、六氟异丙醇(H811026)、黄芩苷(B823663),购自上海麦克林生化科技有限公司,均为分析纯。
1.2 仪器与设备
E05静电纺丝机,佛山轻子精密测控技术有限公司;Nicolet iS50 FTIR光谱仪,美国赛默飞世尔科学公司;STA 449 F5 型DSC-TG热分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;S-3400 N扫描电子显微镜,日本日立公司;CA200自动型光学接触角测量仪,广东北斗精密仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合膜制备
准确称取80 mg的BCL溶于六氟异丙醇中,制成质量浓度为10 mg/mL的溶液。称取适量的CN溶解于六氟异丙醇中,制成质量浓度为0～200 mg/mL的CN溶液。将8 mL BCL溶液与8 mL CN溶液混合后于37 ℃下磁力搅拌1 h。以CN和PLA质量比为0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1在上述溶液中加入PLA,继续搅拌4 h后得到静电纺丝共混液(所有比例下CN和PLA总质量为2.56 g)。
将配制好的共混液吸入10 mL注射器中,配备20 G钢针,安装于注射泵上,采用静电纺丝机进行复合膜制备。纺丝速度为1.0 mL/h,电压为19 kV,针尖-滚筒接收间距为12.5 cm,滚筒转速为120 r/min,纺丝温度为25 ℃[15]。将收集的复合膜置于密封袋中,备用。
1.3.2 SEM表征
将复合膜置于导电硅胶上,喷金后采用SEM观察表面形貌。
1.3.3 FTIR分析
将复合膜样品置于衰减全反射(attenuated total reflection,ATR)元件上,设置光谱分辨率为4 cm-1,扫描32次,记录样品在400～4 000 cm-1的红外光谱。
1.3.4 差示扫描量热-热重(differential scanning calorimetry-thermo gravimetric,DSC-TG)分析
准确称取6～8 mg复合膜置于氧化铝坩锅中,用DSC-TG热分析仪测定样品的热分解特性,升温速率为10 ℃/min,测定范围为30～500 ℃,用空坩埚作对照。
1.3.5 接触角测定
将复合膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形,利用接触角仪测量其水接触角。
1.3.6 溶胀性和降解性测定
参考GHORBANI等[16]的方法,将复合膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形,称重后于室温下浸泡在0.05 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,分别在设定时间点将复合膜取出,用吸水纸吸去表面多余水分并称重。溶胀性计算如公式(1)所示:
溶胀率
(1)
[:W0为复合膜初始质量,g;Wt为复合膜溶胀不同时间后的质量,g。
将复合膜裁剪成2 cm×2 cm的矩形,称重后置于0.05 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡48 h后,小心取出未溶复合膜,在60 ℃下干燥48 h后称重。降解率计算如公式(2)所示:
降解率
(2)
[:M0为复合膜初始质量,g;M为复合膜浸泡48 h后剩余质量,g。
1.3.7 复合膜的生物相容性分析
挑选大小相近的斑马鱼,分为空白对照组和复合膜组;将复合膜组的斑马鱼分成3组(每组包含5条斑马鱼)放置于直径90 mm、底部铺有纤维膜的培养皿中培养,分别在第1、5、10天计算斑马鱼存活率。
1.3.8 复合膜的草莓保鲜性分析
挑选大小、成熟度相近、外观均匀、无物理损伤和真菌破坏的草莓。选取的草莓随机分为4组:空白对照组、PLA膜组(未负载BCL)、0∶1复合膜组、1∶1复合膜组;再将每组草莓均分成3组(每组平行样品包含3个草莓)。在贮藏过程中用相机记录草莓的变化情况,并在第1、3、5天测试草莓的可溶性固形物含量、质量和硬度变化。
1.4 数据统计分析
所有试验重复3次,数据用平均值±标准偏差表示,用Origin Pro 9.0作图,用IBM SPSS Statistics 22进行差异显著性分析,数据间差异显著分析采用Duncan法,以P<0.05为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 复合膜的结构表征
PLA-CN基复合膜的微观结构如图1所示。由图1可以看出,PLA具有较好的纺丝性能,其膜(0∶1)表面呈现均匀纤维状。以CN与PLA质量比为1∶3的配比添加CN后,膜表面纤维直径减小,均匀度迅速变差且出现弯曲现象,混合液成纤性能急剧下降。当CN与PLA质量比为1∶2时,混合液成纤能力依然较差,纤维直径分布极不均匀。然而,当CN添加量进一步增大到与PLA质量比为1∶1时,纤维直径迅速减小且分布均匀,复合膜具有一定的弹性。之后,当CN添加量进一步增大时,纤维直径继续减小,直径均匀度增加,但复合膜脆性较大,易破碎和断裂。当CN与PLA质量比为3∶1时,复合膜表面纤维虽然分布较为均匀,但出现片状和珠状结构,表明混合液的成纤能力降低。因此,选择CN与PLA质量比1∶1为最佳配比。
图1 聚乳酸-酪蛋白基复合膜SEM图
Fig.1 SEM images of composite membranes based on PLA and CN
注:0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1代表CN和PLA的质量比(下同)。
CN静电纺丝性能比PLA差,当添加CN后,纺丝溶液的黏度迅速降低,且CN的存在阻碍了PLA间的分子链缠结,使其成纤能力下降,纤维直径分布不均,并无法充分拉伸,与张思远等[17]的研究结果相似。当CN添加量增加到50%时,混合液黏度进一步降低,PLA分子间作用力进一步被削弱,但CN分子链之间的作用增强,且很好地分散了PLA分子,纤维直径反而变得均匀,推测PLA被均匀分散且包封在纤维内部。然而,当CN添加量进一步增大时,由于CN本身成纤性较差,形成的纤维脆性较大,复合膜难以完整揭下。另外,CN添加量过大时混合液黏度过小而无法形成射流,只能以微滴形态喷射,所以复合膜表面出现片状结构[18]。
复合膜的FTIR如图2所示,其中CN酰胺I带为1 640 cm-1,酰胺Ⅱ带为1 516 cm-1。对于单一PLA而言,2 990 cm-1处为C—H不对称伸缩振动,1 750 cm-1处为C
O伸缩振动,1 454 cm-1和1 382 cm-1处为C—H弯曲振动,1 180 cm-1和1 083 cm-1处为C—O—C伸缩振动,1 043 cm-1处为C—CH3伸缩振动,756 cm-1和869 cm-1处为C—C伸缩振动[19]。BCL的特征峰在复合膜中消失,表明BCL被包封在膜内。随着CN添加量的增加,复合纤维膜中CN酰胺I带和Ⅱ带特征峰逐渐增强,且CN与PLA的质量比>1∶1后,复合纤维膜在2 800～3 100 cm-1处的吸收峰逐渐由PLA特征吸收峰转变为CN特征吸收峰,PLA可能被均匀分散且包封在纤维内部。另外,混合物纺丝后,没有出现新的特征峰,可认为PLA与CN仅为物理混合。安琪等[18]研究发现,玉米醇溶蛋白与PLA共混液中二者也仅为物理混合,纺丝过程中不发生化学反应。
图2 聚乳酸-酪蛋白基复合膜FTIR图
Fig.2 FTIR images of composite membranes based on PLA and CN
注:图中PLA为未添加BCL的PLA膜,CN为酪蛋白原料,BCL为黄芩苷标准品。
2.2 复合膜的热分解特性分析
复合纤维膜的DSC-TG曲线如图3所示。由图3-a可知,BCL在200 ℃左右出现一个吸热峰,为其熔融峰;PLA在66 ℃附近出现的吸收峰为溶剂挥发峰,在165 ℃附近出现的峰为膜的熔融峰,在350 ℃附近出现的吸热峰为大分子的分解峰[20]。CN在280 ℃附近出现吸热峰。与PLA膜相比,添加BCL后,CN-PLA比例为0∶1的复合膜在350 ℃左右的峰移至375 ℃,表明BCL与PLA间形成了相互作用,使其热分解温度升高;然而,添加CN后,复合膜的热分解峰向低温移动,且温度随CN添加量的增加而降低,这是由于CN热分解温度较低所致。
a-DSC曲线;b-焓变;c-TG曲线
图3 聚乳酸-酪蛋白基复合膜的DSC-TG曲线及焓变
Fig.3 DSC-TG curves and enthalpy changes of composite membranes based on PLA and CN
注:不同小写字母表示样品的焓变-1差异显著;不同大写字母表示样品的焓变-2差异显著。
对复合膜在165 ℃附近的熔融峰(焓变-1)和300～350 ℃的热分解峰(焓变-2)积分,得到焓变,见图3-b。由图3-b可知,当CN与PLA的质量比为1∶3时,复合膜在165 ℃附近的焓变与0∶1时差异不显著(P>0.05);当CN添加量进一步增大时,其在1∶1时的焓变与其他样品差异显著(P<0.05),也就是说,当CN与PLA质量比为1∶1时,分子间形成了较强的作用力,使复合膜的熔融吸热量增大。就300～350 ℃的焓变-2而言,0∶1样品的焓变最大,之后随着CN添加量的增加而降低,这是因为CN的热分解温度低于PLA,且其分解时的吸热量低于PLA。当CN添加量增大到50%时,其分解吸热量与纯CN相当,说明PLA被分散,分子链内作用力被削弱。
由图3-c的TG曲线可知,BCL在200 ℃附近出现第1次失重,在300 ℃附近出现第2次失重,由PLA链断裂所致,与文献研究结果一致,表明分子热分解[21-22]。CN在260 ℃附近开始出现缓慢失重。所有纤维膜均在60 ℃开始失重,为溶剂蒸发所致;复合膜在300～400 ℃大量热分解,其残渣剩余量随CN添加量的增加而增大。
2.3 复合膜的亲水性分析
复合膜的水接触角如图4所示。由图4可知,PLA膜疏水性较强,水接触角为(136.27±1.04)°,是一种典型的疏水材料[23]。所有纤维膜的水接触角均大于90°,表现出明显的疏水特性。随着CN添加量的增加,复合膜的水接触角逐渐减小。由于CN具有较好的亲水性,且添加CN后纤维直径减小,孔隙率增大,其吸水性增强,因此复合膜水接触角减小[24]。当CN与PLA质量比为1∶1时,复合膜的水接触角为(122.90±4.08)°,与1∶2及2∶1的样品差异不显著(P>0.05)。文献指出,PLA膜具有较高的疏水性,添加海藻酸钠、壳聚糖后,膜的亲水性增加,与本文研究结果一致[21]。
a-水接触角图;b-接触角和降解率
图4 聚乳酸-酪蛋白基复合膜水接触角及降解率
Fig.4 Water contact angle and degradation rate of composite membranes based on PLA and CN
注:不同大写字母表示样品的水接触角差异显著;不同小写字母表示样品的降解率差异显著。
复合纤维膜的降解性如图4所示。PLA膜在48 h内的降解率为(7.43±1.53)%。由于CN具有较好的水溶性,因此随着CN添加量的增加,复合膜的降解率增大。当CN与PLA质量比增加到2∶1和3∶1时,复合膜的降解率随CN添加量的增加变化不显著(P>0.05)。根据FTIR研究结果,当CN添加量超过50%后,复合膜由PLA包覆CN型转变为CN包覆PLA型,因此CN添加量继续增加对复合膜降解率影响不大。
复合膜的溶胀性如图5所示。由图5可以看出,PLA膜在24 h的溶胀率仅为(8.82±0.62)%。添加CN后,复合膜的溶胀性迅速增大。其中,CN与PLA质量比为1∶3时,复合膜的溶胀率最大;之后随着CN添加量的增加溶胀率下降。这是因为CN为水溶性分子,添加少量CN时,其分散在PLA之间,削弱了PLA分子间相互作用,纤维直径减小,孔隙率增大(图1),复合膜吸水性增大。然而,当CN添加量进一步增大时,虽然纤维直径减小,但CN迅速溶解进入水中,从而使膜的吸水性降低。因此,当CN与PLA质量比为2∶1时,复合膜在24 h的溶胀率仅为(9.92±6.28)%。研究指出,添加透明质酸增大了PLA电纺膜的吸水性[12]。可见,添加亲水性大分子有利于增加复合膜的溶胀性。
图5 聚乳酸-酪蛋白基复合膜溶胀率
Fig.5 Swelling rate of composite membranes based on PLA and CN
2.4 复合膜的生物相容性及草莓保鲜性分析
复合膜生物相容性试验结果如图6所示。由图6可知,斑马鱼在铺有PLA-CN基复合膜的培养皿中培养10 d后存活率为100%,表明复合膜具有良好的生物相容性。
图6 聚乳酸-酪蛋白基复合膜生物相容性
Fig.6 Biocompatibility of composite membranes based on PLA and CN
复合膜对草莓的保鲜性能如图7所示。由图7-a可知,在贮藏过程中,所有草莓样品的颜色都有不同程度的变暗,且在第3天出现腐烂现象,表皮光滑度下降,果实开始收缩。在第5天时,空白组、PLA组、CN∶PLA为0∶1组草莓均严重腐烂。然而,CN∶PLA为1∶1组草莓霉变现象较轻,且其贮藏3 d后霉变程度变化较小。可见,复合膜包装可有效防止草莓在贮藏过程中的腐烂,保持果实颜色和表观状态。
a-贮藏期草莓外观;b-硬度;c-失重率;d-可溶性固形物含量
图7 聚乳酸-酪蛋白基复合膜包装对草莓品质的影响
Fig.7 Quality of strawberry packaged by composite membrane based on PLA and CN during storage
注:不同大写字母表示同一样品不同贮藏时间下相关参数差异显著;不同小写字母表示不同样品同一贮藏时间下相关参数差异显著。
贮藏期草莓硬度变化曲线如图7-b所示。由图7-b可知,随着贮藏时间延长,各组草莓的硬度均显著降低(P<0.05)。贮藏5 d时,复合膜包装组草莓硬度最大,且与其他组差异显著(P<0.05),而其他3组样品硬度差异不显著(P<0.05)。果实硬度大小与水果的果胶含量有关,随着贮藏时间的延长,果胶分解酶分解果胶和其他细胞壁成分,果实硬度逐渐降低[25]。复合膜包装后,显著降低了草莓的有氧呼吸,减缓了果胶分解,因此硬度降低缓慢,与冯云霄等[26]研究结果一致。另外,有研究指出,经聚乙烯抗菌膜包装后,草莓硬度降低显著减缓[27]。可见,适宜的膜材料包装可有效延缓草莓硬度变化。
贮藏期草莓失重率变化曲线如图7-c所示。由图7-c可知,随着贮藏时间延长,各组草莓的失重率均显著增加(P<0.05)。贮藏3 d后,复合膜包装组草莓的失重率为(9.96±0.17)%,而空白对照组草莓的失重率为(17.70±0.38)%。贮藏过程中进行的呼吸和蒸腾作用是导致草莓质量变化的主要原因,其表皮高气孔率导致大量失水[27]。用0∶1的复合膜包装后,由于复合膜的吸水性极差(图5),草莓呼吸作用产生的热量难以及时散发,因此其失重率较其他组样品大[28];特别是贮藏5 d后其失重率显著高于其他组(P<0.05)。添加CN后,复合膜吸水溶胀性较好,能及时吸收草莓蒸腾作用和呼吸作用产生的水分,溶胀后及时散发呼吸产生的热量,且膜中负载的BCL具有一定的抑菌作用[3],因此有效延长了草莓货架期。
贮藏期草莓可溶性固形物含量变化如图7-d所示。由图7-d可知,空白对照组在贮藏1 d后可溶性固形物含量有所增高,之后随着贮藏时间延长均逐渐降低。复合膜包装组草莓的可溶性固形物含量降低较慢,且在贮藏5 d后显著高于其他组(P<0.05)。研究表明,由于呼吸作用及糖和其他营养物质被微生物消耗,导致果实的可溶性固形物含量随着贮藏时间的延长而逐渐降低[29]。研究指出,在常温下用壳聚糖/维生素C/植酸复合保鲜剂对草莓进行保鲜处理延缓了果实可溶性固形物含量的下降[30],与本文研究结果一致。
综上所述,负载了BCL的PLA-CN基复合膜具有良好的生物相容性,用于包装草莓可有效延缓果实呼吸作用和蒸腾作用,进而有效保持果实的色泽、硬度等感官品质,降低失重率,延长保鲜期。
3 结论
以PLA和CN为基质,以BCL为抑菌剂,采用静电纺丝技术制备了复合膜,当CN与PLA质量比为1∶1时,混合液具有较好的成纤性能,复合膜具有规则形貌,纤维直径较小。添加CN提高了PLA纤维膜的亲水性和降解率,改善了其吸水性。经PLA-CN复合膜包装后,草莓果实硬度、可溶性固形物含量均显著高于对照组,失水率显著降低。可见,PLA-CN复合膜可用于草莓包装,以有效延长草莓货架期;该膜基质为可降解材料,是一种绿色环保包装膜,具有较好的开发前景。
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