红枣是鼠李科枣属植物,是一种很好的药食同源的食品,具有很高的的药用价值和营养价值[1-2]。在目前的研究中表明红枣中含有多糖、黄酮、环磷腺苷,生物碱等多种活性物质,具有免疫调节、抗疲劳、抗炎、抗氧化等多种活性[3-6]。环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)作为第二信使,可以通过G蛋白偶联系统抑制或者激活酶的活性,正因为如此,环磷腺苷对于糖脂代谢有一定的调节作用[7-10]。此外,环磷腺苷还具有抑制血小板凝集[11]、抗过敏[12-13]的作用。且环磷腺苷及其衍生物已经用于心绞痛、急性心肌梗死的辅助治疗[14-15]。
环磷腺苷的提取多来自于动物内脏,成本偏高,并且采用化学合成方法得到环磷腺苷的副产物多,浪费严重,对环境污染大,使成本居高不下[16-18]。红枣中含有丰富的环磷腺苷[19-20],环磷腺苷作为第二信使,通过调节体内酶、激素等物质,发挥着免疫调节、疾病调控的作用,具有潜在的抗过敏作用[21]。乳霜具有操作简单、肤感清爽、有较好的铺展性等优点,为红枣环磷腺苷的精深加工提供了思路。本研究以金丝小枣为原料,以环磷腺苷的含量为指标,选用响应面法对环磷腺苷的提取工艺进行优化并对提取物进行应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金丝小枣,乐天食品有限公司;无水乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾(分析纯),天津市天力化学试剂有限公司;cAMP标准品(色谱纯),上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪,配有(CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm的XSelect色谱柱),Waters;立式真空冷冻干燥机,上海争巧科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 提取方式
分别考察水浴提取与超声辅助提取对于环磷腺苷得率的影响。精密称取干燥红枣粉末5 g,置入小烧杯中,加入50 mL蒸馏水,分别在数显恒温水浴锅中80 ℃和超声波辅助下提取30 min,提取液用台式离心机在6 000 r/min的转速下离心10 min,分别取其上清液添加蒸馏水至50 mL,并取10 mL上清液定容100 mL。再取少量稀释液过0.22 μm滤膜,于-20 ℃贮存,备用,用HPLC检测提取液中环磷腺苷的含量。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 料液比对提取率的影响
精密称取干燥红枣粉末5 g,分别置入5个小烧杯中,分别加入30、60、90、120、150 mL的蒸馏水配成料液(g∶mL)比分别为1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30的溶液,保鲜膜封住烧杯口,用超声提取60 min得到提取液,提取液用台式离心机在6 000 r/min的转速下离心10 min,分别取其上清液添加蒸馏水至原体积,并取10 mL上清液定容至分别100 mL。再取少量稀释液过0.22 μm滤膜,于-20 ℃贮存,备用,用HPLC检测提取液中环磷腺苷的含量。
1.3.2.2 提取时间对提取率的影响
精密称取干燥红枣粉末5 g,分别置入5个小烧杯中,加入90 mL的蒸馏水,保鲜膜封住烧杯口,在30 ℃的温度下,用超声提取的方式分别提取30、45、60、75、90 min,提取液按照1.3.2.1节的方式处理。
1.3.2.3 乙醇体积分数对提取率的影响
精密称取干燥红枣粉末5 g,分别置入5个小烧杯中,分别加入乙醇体积分数为0、25%、50%、75%、100%的溶液90 mL,保鲜膜封住烧杯口,在30 ℃的温度下,用超声提取的方式提取60 min,提取液按照1.3.2.1节的方式处理。
1.3.3 响应面试验
1.3.3.1 响应面试验因素及水平
本试验根据单因素试验的结果,利用Design-Expert V8.0.6软件进行中心组合设计法设计3因素3水平响应面实验组,以环磷腺苷的含量为响应值,试验因素和水平见表1。
表1 响应面优化试验因素及水平
Table 1 Response surface optimization test factors and levels
水平因素A(乙醇体积分数)/%B(料液比)(g∶mL)C(提取时间)/min-1501∶1845062.51∶24601751∶3075
1.3.3.2 验证试验
在响应面模型预测得到的最佳提取工艺的基础上进行4次重复性验证试验,判断模型的稳定性与重现性。
1.3.4 总环磷腺苷得率的计算
采用HPLC法[22]测定环磷腺苷的含量。
1.3.4.1 色谱条件
色谱条件为:色谱柱为pH 2-11,XSelect色谱柱 CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm,流动相是V(甲醇)∶V(0.05 mol/L磷酸二氢钾)=20∶80,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量10 μL。
1.3.4.2 标曲的制作
精密称取环磷腺苷标准品50 mg,用超纯水定容于1 000 mL的容量瓶中,配制成50 mg/L的标准品母液,并稀释母液分别得到25、12.5、6.25、3.125、0.125 mg/L的标准品溶液。使用1.3.4.1节的色谱条件检测,每个标准品溶液进样3次,取平均值作为峰面积,以标准品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得到环磷腺苷的标准曲线。
1.3.4.3 总环磷腺苷的测定及得率的计算
环磷腺苷的得率计算如公式(1)所示:
(1)
式中:W表示环磷腺苷得率,%;c表示根据HPLC峰面积计算出的环磷腺苷的质量浓度,mg/mL;D表示溶液稀释倍数;V表示供试品溶液体积,mL;m表示红枣取样量,mg。
1.3.5 乳霜的制备
1.3.5.1 乳霜配方设计
按照红枣环磷腺苷的最佳提取工艺得到提取液,利用旋转蒸发器浓缩除去提取液中的乙醇,并浓缩,冻干成粉末。利用冻干粉设计一款具有抗过敏效果的乳霜,具体的原料及功能如表2所示。
表2 乳霜试剂
Table 2 Cream reagents
试剂 功能司班80乳化剂硬脂酸油相单硬脂酸甘油酯辅助乳化剂鲸蜡硬脂醇油相,调节稠度苯氧乙醇防腐剂二甲硅油润滑剂吐温80乳化剂红枣冻干粉主药蒸馏水水相玫瑰纯露保湿剂透明质酸原液保湿剂
1.3.5.2 制备工艺
将油相与水相分别加入2个烧杯中,按照配方配比添加试剂。再把油相和水相分别加热至80 ℃,直到所有试剂全部融化,把水相倒入油相中,搅拌使其充分乳化,室温冷却到40 ℃时加入苯氧乙醇和玫瑰纯露。
1.3.6 乳霜稳定性检测
1.3.6.1 感官评价
设计出乳霜的感官评价表,通过涂展性、清爽度、黏稠度、细腻性等4个指标进行判断。涂展性:检测产品使用过程中是否会泛白。清爽度:检测产品使用过程中是否有油腻感。黏稠度:检测产品的流动性是否合适。细腻性:检测产品使用过程中是否细腻,是否有颗粒物。
1.3.6.2 耐热耐寒测试
取适量的样品,分成3组,分别置入50 ℃烘箱,4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3种不同的条件下分别放置24 h,观察是否有油水分离的现象。
1.3.6.3 离心稳定性测试
在离心管中加入适量的样品,放入到37 ℃的恒温箱中1 h,然后使用台式离心机在2 000 r/min的转速下离心30 min,观察是否有油水分离。
1.3.6.4 刺激性测试
将该乳霜涂敷手臂内侧,每天2次,连续3 d涂抹,并在24 h后观察涂敷部位,未出现疼痛、红肿、起疹、水疱等不良反应。可证明本制剂对皮肤无刺激性。
1.4 数据处理
所有实验均重复3次,采用GraphPad Prism 8.0.2和Design Expert 8.0.6 进行数据的处理和绘图分析。
2 结果与分析
2.1 提取工艺优化
2.1.1 提取方式的确定
如图1所示,可以明显看见超声提取的环磷腺苷得率大于水浴提取,因此提取的方式选择超声辅助提取。这可能是超声引起的空化现象所造成的。超声空化中形成的微小气泡爆裂时会产生极大的压力,使植物细胞壁快速破裂,同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放,从而显著提高提取效率。
图1 提取方式对环磷腺苷得率的影响
Fig.1 Effect of extraction methods on the yield of cAMP
2.1.2 料液比对环磷腺苷得率的影响
如图2所示,随着提取液的增加,环磷腺苷的得率在逐渐增加,但是料液比达到一定程度时,环磷腺苷的得率变化不大,说明环磷腺苷的提取量接近饱和,再增大料液比会造成资源的浪费。因此选择料液比为1∶24(g∶mL)较合适。
2.1.3 提取时间对环磷腺苷得率的影响
如图3所示,随着提取时间的延长,刚开始环磷腺苷的得率在逐渐升高,但是到达一定时间后,环磷腺苷的得率反而有所下降,可能是由于长时间的超声使得环磷腺苷结构被破坏导致得率降低。因此选择提取时间为60 min较合适。
图2 料液比对环磷腺苷得率的影响
Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of cAMP
图3 提取时间对环磷腺苷得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of cAMP
2.1.4 乙醇体积分数对环磷腺苷得率的影响
如图4所示,随着乙醇体积分数的增加,环磷腺苷的得率也在逐渐增加,但在75%以后环磷腺苷的得率变化不大,且从经济方面考虑,选择乙醇体积分数为75%时较合适。
图4 乙醇含量对环磷腺苷得率的影响
Fig.4 Effect of ethanol content on the yield of cAMP
2.1.5 响应面优化提取工艺
按照表1的方式设计响应面实验组,共得到17个试验点,其中分析的试验点有12个,中心点有5个。采用响应面法分析实验结果,以环磷腺苷的得率为响应值,最终得到的回归方程为环磷腺苷得率=711.358 75+1.247 20A+38.339 04B+11.863 95C+0.102 33AB+0.054 40AC-0.102 64BC-0.059 246A2-0.749 99B2-0.099 243C2。
从表3中可以看出整个响应面模型的P=0.020 5<0.05,所以响应面模型是显著的,同时失拟项的P=0.924 7>0.1,这说明正交试验结果和模型拟合良好,可以使用模型推测环磷腺苷得率最大时的最优提取条件。且由表3可以看出,各个因素对于环磷腺苷得率的影响由大到小分别是提取时间>料液比>乙醇体积分数。其中每两两因素相互作用的响应面图如图5所示。
表3 响应面模型方差分析
Table 3 ANOVA of response surface model
项目平方和自由度均方F值P值显著性模型10 637.1291 181.905.200.020 5∗A(乙醇体积分数)14.43114.430.0630.808 3B(料液比)367.271367.271.620.244 4C(提取时间)408.571408.571.800.222 0AB235.621235.621.040.342 6AC416.161416.161.830.218 2BC341.331341.331.500.260 1A2360.831360.831.590.248 2B23 069.4213 069.4213.500.007 9∗C22 099.4412 099.449.230.018 9∗
注:*P<0.05为有差异;**P<0.01为差异显著;***P<0.001为差异极显著。
在图5中,X、Y轴为影响因素,Z轴为环磷腺苷的含量,从图中可以明显看出乙醇体积分数与料液比的相互作用,乙醇体积分数和提取时间的相互作用以及料液比与提取时间的相互作用。且每2个因素相互作用,都明显存在最高点。根据响应面法建立的模型,最终得到了最佳工艺,最佳的提取条件是料液比为1∶25.42(g∶mL)、提取时间63.51 min、乙醇体积分数61.63%,理论得率为191.15 μg/g。
2.1.6 验证试验
在理论条件下,提取的环磷腺苷的得率为191.15 μg/g。在此基础上进行4次重复性实验,结果如表4所示,可见预测值与实际提取值吻合度较好,模型具有良好的稳定性与重现性。
2.2 乳霜制备
2.2.1 乳霜配方
经过配方研究后,最终得到的各成分的占比如表5所示:
a-乙醇体积分数和料液比对cAMP得率影响的响应面和等高线;b-乙醇体积分数和提取时间对cAMP得率影响的响应面和等高线; c-料液比和提取时间对cAMP得率影响的响应面和等高线
图5 两个因素相互作用的等高线与响应面
Fig.5 Contours and response surface of interaction between two factors
注:左为等高线,右为响应面。
表4 重复性实验结果
Table 4 Repeatability test results
编号cAMP含量/(μg/g)1186.472191.643179.214198.96平均值189.07
表5 乳霜配方
Table 5 Cream formula
试剂 功能含量司班80乳化剂1.4%硬脂酸油相1.4%单硬脂酸甘油酯辅助乳化剂1.4%鲸蜡硬脂醇油相,调节稠度4.9%苯氧乙醇防腐剂0.2%二甲硅油润滑剂1.4%吐温80乳化剂3.5%红枣冻干粉主药5.5%蒸馏水水相78%透明质酸原液保湿剂2.1%玫瑰纯露矫味剂0.2%
2.2.2 乳霜质量检测
2.2.2.1 感官评价
选取皮肤刺激性实验的5名受试者的使用反馈,并对其主观评价。由乳霜的感官评价(图6)可知,乳霜在涂展性、细腻性、清爽度、黏稠性方面均有良好的性能。
图6 乳霜感官评价
Fig.6 Sensory evaluation of cream
注:优良:9～10分;良好:7～8分;一般5～6分; 较差:3～4分;很差:1～2分。
2.2.2.2 耐热耐寒试验
如图7所示,乳霜在50 ℃烘箱、4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3种不同的环境中进行测试,未发现有油水分离现象,说明乳霜的乳化体系稳定,且红枣水溶液对于乳霜并无不良影响。
a-耐寒试验前;b-耐寒试验后
图7 乳霜耐热耐寒试验前后对比
Fig.7 Cream before and after heat and cold tolerance test
2.2.2.3 离心稳定性试验
如图8所示,乳霜在2 000 r/min的条件下离心30 min并未发现油水分离现象,可见乳霜的离心稳定性良好。
a-离心稳定性试验前;b-离心稳定性试验后
图8 乳霜离心稳定性试验前后对比
Fig.8 Cream before and after the centrifuge stability test
2.2.2.4 皮肤刺激性试验
在进行感官评价时寻找了5位志愿者,在皮肤上涂抹后并未发现红肿瘙痒等过敏现象,可见乳霜对机体无刺激性。
3 结论与讨论
本研究考查了提取方式对环磷腺苷得率的影响,发现超声提取比水提取的得率更高,同时查阅文献发现陈恺等[23]的水浴提取最高得率为157.3 μg/g,明显小于在超声辅助下提取的cAMP得率,可见在超声波辅助下提取能显著提高cAMP的得率。乙醇体积分数、料液比、提取时间3个单因素对于环磷腺苷得率的影响,然后采用了Design-Expert V 8.0.6软件进行中心组合设计法设计响应面的实验组,并建立了模型,得到了预测的最优工艺,在预测的最优工艺基础上,进行4次试验验证,发现理论得率与实际得率吻合度达到98.9%,最终确定了最佳提取工艺为:料液比1∶25.42(g∶mL)、提取时间63.51 min、乙醇体积分数61.63%。在此条件下提取的环磷腺苷理论得率为191.15 μg/g,实际得率为189.07 μg/g。
过敏性疾病大多是细胞内环磷酸腺苷浓度下降所致[24]。由于红枣产量过剩,本研究对其进行精深加工,促进红枣资源的合理利用。除了环磷腺苷具有良好的抗过敏活性外,其提取物中还存在大量的多糖、黄酮、酚类等物质,具有良好的抗氧化特性,能有效增加乳霜的功能[25]。本研究利用红枣提取物制备的乳霜,经稳定性实验检验,发现本乳霜稳定性良好,并有望开发成为一款抗过敏乳霜。
[1] LI J W, FAN L P, DING S D, et al.Nutritional composition of five cultivars of Chinese jujube[J].Food Chemistry, 2007, 103(2):454-460.
[2] GAO Q H, WU C S, WANG M.The jujube (Ziziphus jujuba mill.) fruit:A review of current knowledge of fruit composition and health benefits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(14):3351-3363.
[3] CHEN J P, TSIM K W K.A review of edible jujube, the Ziziphus jujuba fruit:A heath food supplement for Anemia prevalence[J].Frontiers in Pharmacology, 2020, 11:593655.
[4] RASHWAN A K, KARIM N, SHISHIR M R I, et al.Jujube fruit:A potential nutritious fruit for the development of functional food products[J].Journal of Functional Foods, 2020, 75:104205.
[5] RUAN J Y, HAN Y, KENNEDY J F, et al.A review on polysaccharides from jujube and their pharmacological activities[J].Carbohydrate Polymer Technologies and Applications, 2022, 3:100220.
[6] LIN T T, LIU Y, LAI C, et al.The effect of ultrasound assisted extraction on structural composition, antioxidant activity and immunoregulation of polysaccharides from Ziziphus jujuba Mill var.spinosa seeds[J].Industrial Crops and Products, 2018, 125:150-159.
[7] YAZDANPANAH Z, GHADIRI-ANARI A, MEHRJARDI A V, et al.Effect of Ziziphus jujube fruit infusion on lipid profiles, glycaemic index and antioxidant status in type 2 diabetic patients:A randomized controlled clinical trial[J].Phytotherapy Research: PTR, 2017, 31(5):755-762.
[8] JEONG O, KIM H S.Dietary chokeberry and dried jujube fruit attenuates high-fat and high-fructose diet-induced dyslipidemia and insulin resistance via activation of the IRS-1/PI3K/Akt pathway in C57BL/6 J mice[J].Nutrition &Metabolism, 2019, 16:38.
[9] LIU S J, MA B Z, TANG Z S, et al.Study on the relationship between different components of jujube and diabetes mellitus[C]//IOP Conference Series:Materials Science and Engineering, 2019, 612(2):022001.
[10] ZHAO Y, YANG X B, REN D Y, et al.Preventive effects of jujube polysaccharides on fructose-induced insulin resistance and dyslipidemia in mice[J].Food &Function, 2014, 5(8):1771-1778.
[11] SEO E J, LEE S Y, KANG S S, et al.Zizyphus jujuba and its active component jujuboside B inhibit platelet aggregation[J].Phytotherapy Research, 2013, 27(6):829-834.
[12] JIANG T Y, HE F, HAN S W, et al.Characterization of cAMP as an anti-allergic functional factor in Chinese jujube (Ziziphus jujuba Mill.)[J].Journal of Functional Foods, 2019, 60:103414.
[13] SANG C W, BAI Q A, FENG X P, et al.Optimized extraction of cAMP from jujube by ultra-high pressure technology and the anti-allergic effect for peanut allergy mouse[J].Frontiers in Nutrition, 2022, 9:862900.
[14] 张艳婷. 环磷腺苷葡胺治疗冠心病不稳定型心绞痛疗效观察[J].基层医学论坛, 2011, 15(28):932-933.
ZHANG Y T.Observation on therapeutic effect of meglumine cyclic adenosine monophosphate on unstable angina pectoris of coronary heart disease[J].The Primary Medical Forum, 2011, 15(28):932-933.
[15] 曹继云, 张学颖.环磷酸腺苷葡甲胺及参麦注射液佐治心肌梗死后心力衰竭[J].临床误诊误治, 2007, 20(10):30-32.
CAO J Y, ZHANG X Y.Clinical study on effect of meglumine cyclic adenylate and Shenmai injection in auxiliary treatment of congestive heart failure complicate with myocardial infarction[J].Clinical Misdiagnosis & Mistherapy, 2007, 20(10):30-32.
[16] 闫忠心, 鲁周民, 刘坤, 等.我国红枣资源加工利用研究现状与展望[J].西北农林科技大学学报(自然科学版), 2010, 38(6):102-108.
YAN Z X, LU Z M, LIU K, et al.The present situation and prospect of Chinese jujube resource in processing and utilization[J].Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition), 2010, 38(6):102-108.
[17] 张小梅, 白友强.关于新疆红枣产业精深加工的思考[J].农业科技通讯, 2017(1):35;185.
ZHANG X M, BAI Y Q.Thoughts on deep processing of jujube industry in Xinjiang[J].Bulletin of Agricultural Science and Technology Newsletter, 2017(1):35;185.
[18] 程丽娜, 陆海燕, 曲淑玲, 等.微生物发酵法生产环磷酸腺苷研究进展[J].中国生物工程杂志, 2018, 38(2):102-108.
CHENG L N, LU H Y, QU S L, et al.Production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)by microbial fermentation—A review[J].China Biotechnology,2018,38(2):102-108.
[19] ZHAO A L, LI D K, WANG Y K, et al.Study on the content of polysaccharides in different cultivars, growing periods and organs in Chinese jujube[J].Acta Horticulturae, 2013(993):219-224.
[20] WANG R R, DING S H, ZHAO D D, et al.Effect of dehydration methods on antioxidant activities, phenolic contents, cyclic nucleotides, and volatiles of jujube fruits[J].Food Science and Biotechnology, 2016, 25(1):137-143.
[21] 白乔. 红枣中环磷酸腺苷抗过敏活性及机理研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2019.
BAI Q.Anti-allergic activity and mechanism of cyclic adenosine monophosphate in jujube[D].Yangling:Northwest Agriculture &Forestry University, 2019.
[22] 蒋劢博. 红枣中环磷酸腺苷提取与纯化工艺研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学, 2013.
JIANG M B.Studies on separation arid purification for cAMP from Ziziphus jujube[D].Urumqi:Xinjiang Agricultural University, 2013.
[23] 陈恺, 李瑾瑜, 宋丹, 等.新疆哈密大枣中cAMP提取工艺研究[J].中国食物与营养, 2015, 21(1):51-53.
CHEN K, LI J Y, SONG D, et al.Study on extraction technique of c AMP from Hami jujube[J].Food and Nutrition in China,2015,21(1):51-53.
[24] CHINN A M, LEE J, RAZ E, et al.Cellular compensation for chronic decreases in cyclic AMP concentration:Gas-deficient dendritic cells as a model and implications for allergic disorder therapeutics[J].The FASEB Journal, 2018, 32:686.13.
[25] KOU X H, CHEN Q, LI X H, et al.Quantitative assessment of bioactive compounds and the antioxidant activity of 15 jujube cultivars[J].Food Chemistry, 2015, 173:1037-1044.