玉米淀粉糖渣是玉米淀粉液化、糖化后压滤得到的残渣,其含有丰富的还原糖、蛋白质和膳食纤维等成分。根据姚宇晨等[1]的预测,到2023年,我国玉米淀粉糖产量将超过2 400万t。相应地,预计每年将产生大约200万t的糖渣。目前,多数企业直接将糖渣作为饲料原料进行销售,但由于糖渣适口性差且含有营养限制因子,导致糖渣的饲喂效率较低[2]。

利用微生物发酵能够提升蛋白含量、改善风味、消除营养抑制因子,是实现糖渣高值利用的有效手段[3]。在玉米淀粉糖渣的发酵方式中,固体发酵具有对设备和发酵环境要求低、能耗低、排废少且利用率高等优势[4]。赵建国[5]以Y9601酵母为出发菌,固体发酵玉米淀粉渣, 通过工艺条件优化,产物酵母数可达7.45×109个/g,表观粗蛋白增加12.7%,真蛋白净增加5.46%,但该方法并不能改善玉米淀粉糖渣的风味、口味;曹磊[6]对玉米淀粉糖渣生产功能性乳酸菌活菌饲料进行了研究,在液态发酵中,将鼠李糖乳杆菌的活菌数由4.10×108 CFU/mL提高到1.08×109 CFU/mL,达到乳酸菌发挥有益作用要求的菌体密度;还对鼠李糖杆菌的固态发酵工艺条件进行了优化,得到了1.10×109 CFU/g的活菌数。前人研究表明,利用糖渣生产乳酸菌制剂是可行的。

本研究以玉米淀粉糖渣为原料,采用枯草芽孢杆菌协同乳杆菌发酵,旨在提高对糖渣中糖的利用率和乳杆菌的活菌数。对双菌发酵进行了种子液接种量、含水量、起始pH、装料量等因素的单因素优化,再选取3个显著影响的条件进行响应面优化,以提高乳杆菌活菌数。对双菌发酵产物和单菌发酵的产物的蛋白质、氨基酸、风味物质、抗营养因子和抗氧化能力进行了分析检测。本研究将为提升玉米淀粉糖渣附加值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

玉米淀粉糖渣由山东菱花集团提供;麸皮采购于市场;化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司、北京伊诺凯试剂有限公司,纯度为分析纯。

1.1.2 菌种

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),山东威昂生物科技有限公司;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),北海强兴生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 种子液培养基

采用LB培养基培养芽孢杆菌;采用MRS培养基培养乳杆菌[7]。

1.1.3.2 固体培养基

固体培养基是将种子液培养基中添加30 g/L的琼脂制备而成。

固态发酵培养基:玉米淀粉糖渣与麸皮质量比1∶1,50%含水量,250 mL三角瓶装料量20 g,起始pH值为7,115 ℃灭菌15 min[8]。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计,博讯(上海)有限公司;高效液相色谱仪,美国安捷伦有限公司;凯氏定氮仪,山东海能仪器有限公司;味觉分析仪,日本INSENT公司;Heracles II电子鼻,法国Alpha MOS S.A.有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固态发酵的条件优化

双菌接种比例的优化:乳杆菌接种量5%,再按照乳杆菌与枯草芽孢杆菌的接种比例为5∶0、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4(体积比,下同)接种,在37 ℃发酵48 h后,测定发酵物中的乳杆菌活菌数、pH、残糖量。

单因素发酵优化试验:种子液接种量、含水量、起始pH和装料量进行单因素发酵试验,以最高的乳杆菌菌落数为确定因素的最适范围。

为进一步提高乳杆菌活菌数,对前期单因素优化试验中确定的种子液接种量、起始pH和含水量为影响显著影响因素因素,进行响应面优化试验(表1)。

乳杆菌发酵工艺响应面优化试验:基于单因素试验结果,以乳杆菌菌落数(Y)为响应值,利用Box-Behnken进行工艺优化设计。根据响应面法建立的数学模型,分析预测乳杆菌最佳发酵工艺条件,对优化的工艺进行验证,对发酵产物进行评价。

1.3.2 乳杆菌计数方法

无菌条件下将样品稀释100倍,200 r/min摇床上振荡15 min,后逐级稀释至10-6,取100 μL稀释后菌液加入平板中,倒双层MRS固体培养基,37 ℃培养48 h,根据菌落数计乳杆菌数[9]。

1.3.3 葡萄糖测定方法:

葡萄糖测定参照SBA法[10]。

1.3.4 氨基酸、植酸、总酚、DPPH自由基清除率测定方法

将样品冷冻干燥后采用高效液相色谱法测定氨基酸含量[11]、双吡啶法测定植酸含量[12]、福林酚法测定总酚含量[13]、分光光度法测定DPPH自由基清除率[14]、凯氏定氮法测定蛋白质含量[15]。

1.3.5 电子鼻测定方法:

样品经冷冻干燥后采用Heracles Ⅱ电子鼻[16]进行分析测定。

1.3.6 电子舌测定方法:

样品经冷冻干燥后采用味觉分析仪[17]分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌与乳杆菌双菌试验

曹磊[6]对糖渣的固态发酵研究,发现鼠李糖乳杆菌不能直接利用糖渣中的粗蛋白,外源添加2%(质量分数)的蛋白胨可以促进乳杆菌的增殖。因此,氮源可能是限制乳杆菌在糖渣中增殖的主要因素。然而,外部添加氮源的方法不仅会增加成本并且增加了染菌的风险。ZHANG等[8]利用枯草芽孢杆菌MA139的固态发酵提高路氏乳杆菌G8-5的活力,多菌制剂的最高乳酸菌数目为9.01×109 CFU/g,最大芽孢杆菌数目为1.03×1010 CFU/g。研究认为枯草芽孢杆菌分泌蛋白酶并水解粗蛋白,为乳杆菌提供氮源,同时因枯草芽孢杆菌生长消耗了氧气,为乳杆菌增殖营造了厌氧环境。

基于上述已有研究结果,本研究尝试在糖渣中按不同比例同时接入乳杆菌和枯草芽孢杆菌。结果(图1)表明,随着枯草芽孢杆菌比例的增加,葡萄糖消耗量先增加后减少,终pH先下降后上升。乳杆菌活菌数在两菌比例为5∶2时最高,为1.50×109 CFU/g,比未添加枯草芽孢杆菌(5∶0)时高2.86倍,同时,终pH也因为乳杆菌的生长而降低。随着枯草芽孢杆菌比例的继续增加,导致乳杆菌活菌数下降,表明二者之间的竞争加剧,枯草芽孢杆菌成为优势菌株,这不利于葡萄糖利用率的增加。以上现象说明,适量添加枯草芽孢杆菌可以促进乳杆菌的生长,提高葡萄糖利用率。

2.2 响应面优化试验优化提高乳杆菌数

2.2.1 响应面试验优化试验

固定条件为发酵37 ℃、双菌种子液比例为5∶2、发酵时间为48 h、250 mL三角瓶装料量为20 g。以种子液接种量(A)、培养基含水量(B)、初始pH(C)为响应因子,以乳杆菌菌落数(Y)为响应值,根据Box-Behnken设计3因素3水平优化试验,试验设计见表2,响应面二次模型方差分析见表3。

根据Design Expert分析软件进行回归分析,得到乳杆菌活菌数对接种量、培养基含水量、初始pH的二次回归模型方程:

Y=4.99+0.268 3A-0.048 7B+0.125C-0.11AB-0.207 5AC+0.292 5BC-0.468 8A2-0.328 7B2-0.116 2C2

失拟项P=0.099 7>0.05影响不显著,说明回归方程有显著性,模型能较好分析和预测响应值;决定系数R2=0.98,说明模型的拟合性较好,调整决定性系数说明能利用该模型解释95.01%的响应值变化,可信度高。

2.2.2 响应面试验验证的试验

根据响应面法建立的数学模型,分析预测出乳杆菌发酵工艺的最佳条件为:双菌种子液体积比为5∶2,乳杆菌与枯草芽孢杆菌接种量为7.8%,含水量为72%,初始pH为7.26,乳杆菌预测值为5.05×109 CFU/g。

根据优化后的工艺条件,在相同的实验条件下,对单菌和双菌发酵进行了测定,以获取乳杆菌的生长曲线,包括菌落数、pH值和残糖。实验结果如图2所示。

结果表明,在经过枯草芽孢杆菌协同发酵后,乳杆菌活菌数明显增加。相较于单一乳杆菌的发酵,双菌发酵的乳杆菌活菌数增加了2.42倍,达到了5.05×109 CFU/g。验证与模型预测值相符,说明响应面法优化乳杆菌发酵工艺是可行的,枯草芽孢杆菌和乳杆菌在发酵中具有协同作用。同时,发酵后的pH明显下降,这表明乳杆菌代谢活动增强,导致有机酸的累积。另外,葡萄糖消耗量也显著提高,表明协同发酵的代谢效率更高。

2.3 发酵产物组分分析

2.3.1 发酵产物功能性与抗营养因子等物质的分析

总酚在饲料中起到抗氧化、保护营养成分、提高稳定性和延长保存期的作用[18]。表4结果表明发酵可以显著增加总酚含量,其中双菌发酵的含量高于单菌发酵;植酸是一种抗营养因子,抑制动物肠道对矿物质的吸收,对动物生长和健康有负面影响[19],发酵过程中微生物分泌的植酸酶分解了植酸,使其含量显著降低;饲料清除DPPH自由基的能力越强,其抗氧化能力越强,发酵后的产物更有助于动物肠道健康[20]。发酵后,粗蛋白质、水解氨基酸和游离氨基酸的含量会增加。这种现象一方面是由于总体干重的减少,另一方面则是因为乳杆菌和枯草芽孢杆菌分泌的相关酶作用的结果。综合来看,双菌发酵比单菌发酵的效果更好,二者与未发酵的糖渣相比,营养物质增加、功能性增强和抗营养因子减少。

2.3.2 电子鼻风味特征性分析

使用Heracles Ⅱ电子鼻,对糖渣、乳杆菌的单菌发酵物以及双菌的发酵物进行了风味性物质分析(图3)。每个保留时间对应着相应的化合物和相关风味。如表5所示,在保留时间为18.18、24.71 min的潜在可能性组成中,主要成分为二甲硫醚,该物质具有不愉快气味和毒性,另一成分乙硫醇则具有刺激性蒜臭味和微毒性。经过发酵后,这些气味显著减少。在保留时间为52.48、62.70、66.74 min的潜在可能性组成中,主要成分为环己醇、辛酮、庚酸甲酯等具有芳香气味的物质。发酵后,这类物质的含量明显增加。而在保留时间为36.24 min的潜在可能性组成中,主要成分为丁二醇,该物质只在混菌发酵中存在,具有类水果味和奶油味。此外,在保留时间为64.13 min的潜在主要成分中,单菌发酵新增正葵烷等芳香类物质,而混菌发酵则主要新增2-乙基-3-甲基吡嗪,该物质具有强烈的坚果香味。

综上所述,经过发酵后,3种糖渣的气味出现了明显的差异。未发酵的糖渣多为酸臭味等不愉快气味,乳杆菌的单菌发酵物减少了臭味,同时增加了醇和脂类的香味。乳杆菌和枯草芽孢杆菌双菌的发酵物则在减少臭味的基础上,增加了强烈的类坚果香味。单菌发酵和双菌协同发酵都可以改善糖渣的风味,但双菌协同发酵的香味更为浓烈。

2.3.3 电子舌味道分析

电子舌能感知液体环境中的不同味感,将待测样品的化学信号转化为电信号,电信号通过信号采集单元和模式识别系统转化为电势差,其输出值为电子舌评分[21]。由表6可知,发酵减少了苦味,增加了涩味、苦味回味和涩味回味,分析原因为发酵降解了苦味物质,而又增加了可导致涩味的多酚类物质,使得味道变化;又由于发酵后鲜味氨基酸含量的增加,鲜味也有显著增加,发酵消耗了部分培养基中的糖导致甜味减少,而分泌的乳酸等酸性物质导致酸味也显著增加。王玉[22]对21日龄断奶仔猪进行添加风味剂的研究中,发现联合添加鲜味剂和复合有机酸具有提高采食量的作用。发酵使糖渣味道更偏向于鲜味和酸味,与研究中风味剂相似。

3 结论

单乳杆菌发酵玉米淀粉糖渣,乳杆菌活菌数为5.24×108 CFU/g。采用枯草芽孢杆菌与乳杆菌协同发酵,乳杆菌活菌数提升到1.50×109 CFU/g,是单菌发酵的2.86倍。并通过工艺优化,将乳杆菌活菌数提高至5.05×109 CFU/g,比相同条件下单菌发酵的活菌数高出2.42倍。

对糖渣、单菌发酵和双菌发酵的产物进行分析,结果表明,发酵可降低植酸含量、增加总酚含量、提升抗氧化能力,同时蛋白质和氨基酸含量也有所增加。在气味方面,发酵可减少异味,增加醇和酯类香气,双菌发酵还兼具浓烈的类坚果香味。此外,口味上也有所改善,减少了苦味,增加了酸味和鲜味,双菌发酵的效果优于单菌发酵。

本研究方法可用于糖渣的资源化利用,提升糖渣的价值,在工业生产中的应用还需进一步研究。

参考文献

[1] 姚宇晨, 徐光辉, 杨钊, 等.淀粉糖行业发展趋势分析及展望[J].农产品加工, 2021(21)77-82.

YAO Y C, XU G H, YANG Z, et al.Analysis and prospect of the development trend of starch sugar industry[J].Academic Periodical of Farm Products Processing, 2021(21)77-82.

[2] 张琪, 华惠敏.玉米淀粉渣开发利用及研究进展[J].中国酿造, 2013, 32(12):14-16.

ZHANG Q, HUA H M.Development and utilization of corn starch residue[J].China Brewing, 2013, 32(12):14-16.

[3] 高东宁, 曹磊, 许赣荣.以玉米淀粉糖渣为原料制备米曲发酵酱油[J].生物加工过程, 2011, 9(3):61-65.

GAO D N, CAO L, XU G R.Fermentation of soy sauce using corn starch cake as raw material[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2011, 9(3):61-65.

[4] 葛龙, 赵艳, 章亭洲. 固态发酵技术的特点与应用. 饲料与畜牧, 2010(8):54-56.

GE L, ZHAO Y, ZHANG T Z. Characteristics and application of solid-state fermentation technology. Animal Agriculture, 2010(8):54-56.

[5] 赵建国. 固态发酵玉米淀粉渣生产蛋白饲料的研究[J].工业微生物, 1999, 29(4):9-11.

ZHAO J.The study on using corn starch residue to produce feed protein[J].Industrial Microbiology, 1999, 29(4):9-11.

[6] 曹磊. 玉米淀粉糖渣发酵制备乳酸活菌饲料[D].无锡:江南大学.

CAO L.Preparation of lactic acid feed by fermentation of corn starch sugar residue[D].Wuxi:Jiangnan University.

[7] 张莉. 乳杆菌的有氧代谢与枯草芽孢杆菌益生作用机制研究[D].济南:山东大学,2012.

ZHANG L.Study on aerobic metabolism of Lactobacillus and probiotic mechanism of Bacillus subtilis[D].Jinan:Shandong University,2012.

[8] ZHANG Y R, XIONG H R, GUO X H.Enhanced viability of Lactobacillus reuteri for probiotics production in mixed solid-state fermentation in the presence of Bacillus subtilis[J].Folia Microbiologica, 2014, 59(1):31-36.

[9] 俞漪, 曲勤凤, 胡雪莲.食品中乳酸菌含量倾注法与涂布法结果差异性研究[J].农产品加工, 2012(8):137-139.

YU Y, QU Q F, HU X.The result differences by pouring method and coating method in detecting content of lactic acid bacteria in food[J].Farm Products Processing, 2012(8):137-139.

[10] 李宪民, 丁芳, 樊伟丽, 等. 生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响因素研究. 亚太传统医药, 2008, 4(9):5-7.LI X M, DING F, FAN W L, et al. Study on influencing factors of determining glucose and L-lactic acid by biosensor analyzer. Asia-Pacific Traditional Medicine, 2008, 4(9):5-7.

[11] 赫欣睿, 武中庸, 叶永丽, 等.高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展[J].分析测试学报, 2016, 35(7):922-928.

HE X R, WU Z Y, YE Y L, et al.Research progress on detection of amino acids by high performance liquid chromatography[J].Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(7):922-928.

[12] 史冰清. 植酸的测定及其提取工艺[J].现代食品, 2017(15):78-80.

SHI B Q.The determination of phytic acid and its extraction process[J].Modern Food, 2017(15):78-80.

[13] 胡志平, 王传明, 陆廷祥, 等.UV法测定苗药仙鹤草中总黄酮、总酚的含量[J].中国民族医药杂志, 2018, 24(8):39-41.

HU Z P, WANG C M, LU T X, et al.The content of total flavonoids and total phenol in the Miao medicine Agrimonia pilosa ledeb determined by UV method[J].Journal of Medicine and Pharmacy of Chinese Minorities, 2018, 24(8):39-41.

[14] MENSOR L L, MENEZES F S, LEITO G G, et al.Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method[J].Phytotherapy Research:PTR, 2001, 15(2):127-130.

[15] SEZ-PLAZA P, MICHAOWSKI T, NAVAS M J, et al.An overview of the Kjeldahl method of nitrogen determination.part I.early history, chemistry of the procedure, and titrimetric finish[J].Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2013, 43(4):178-223.

[16] FALASCONI M, CONCINA I, GOBBI E, et al.Electronic nose for microbiological quality control of food products[J].International Journal of Electrochemistry, 2012, 2012:1-12.

[17] VLASOV Y, LEGIN A, RUDNITSKAYA A.Electronic tongues and their analytical application[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2002, 373(3):136-146.

[18] LACHMAN J, HOSNEDL V, PIVEC V, et al.Polyphenols in cereals and their positive and negative role in human and animal nutrition[J].Cereals for Human Health and Preventive Nutrition, 1998,7(11):118-125.

[19] HARLAND B F.Phytic acid complex in feed ingredient[J].Phytase in Animal Nutrition &Waste Management, 1999 (3):17-19.

[20] GOI I, BRENES A, CENTENO C, et al.Effect of dietary grape pomace and vitamin E on growth performance, nutrient digestibility, and susceptibility to meat lipid oxidation in chickens[J].Poultry Science, 2007, 86(3):508-516.

[21] 刘忠英, 冉乾松, 潘科, 等.基于电子舌的3种氨基酸单体呈味特性研究[J].食品科技, 2022, 47(4):296-302.

LIU Z Y, RAN Q S, PAN K, et al.Flavor characteristics of three amino acid monomers based on electronic tongue[J].Food Science and Technology, 2022, 47(4):296-302.

[22] 王玉. 饲料风味剂和复合有机酸对断奶仔猪采食量及养分消化率的影响[D].雅安:四川农业大学,2015.

WANG Y. Effects of feed flavor agents and organic acids on feed intake and nutrient digestibility in piglets. Ya′an: Sichuan Agricultural University, 2015.

Synergistic fermentation of corn starch syrup residue by Lactobacillus acidophilus and Bacillus subtilis

LI Shaolei1,2, CHEN Xusheng1,2, ZHANG Hongjian1,2, WANG Liang1,2, ZHANG Jianhua1,2*

1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT Microbial fermentation can improve the flavor and eliminate the nutritional inhibitors, thus realizing the high value utilization of corn starch sugar residue. In this study, Lactobacillus acidophilus was used for solid-state fermentation of the syrup residue. The viable count of L. acidophilus was 5.2×108 CFU/g. Bacillus subtilis and L. acidophilus were used in a synergistic fermentation process, which increased the viable count of L. acidophilus to 1.5×109 CFU/g, 2.86 times higher than that of single strain fermentation. The double strain solid-state fermentation process was optimized, and when the inoculation volume of the seed liquid was 7.8%, the moisture content was 72%, and the initial pH was 7.26, the viable count of L. acidophilus reached 5.05×109 CFU/g, 3.37 times higher than before optimization. The components, flavor, and taste of the products from single and double strain fermentations were analyzed and tested. The results showed that fermentation could improve the nutritional value, reduce the phytic acid content, and increase the antioxidant capacity. Double strain fermentation produced a higher count of probiotics, reduced off-flavors, increased nutty and fatty aromas, and improved the mouthfeel.

Key words Lactobacillus acidophilus; Bacillus subtilis; synergistic fermentation; anti-nutritional factors; flavor analysis

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035453

引用格式：李少雷,陈旭升,张宏建,等.嗜酸乳杆菌与枯草芽孢杆菌协同发酵玉米淀粉糖渣[J].食品与发酵工业,2024,50(2):262-267.LI Shaolei,CHEN Xusheng,ZHANG Hongjian, et al.Synergistic fermentation of corn starch syrup residue by Lactobacillus acidophilus and Bacillus subtilis[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(2):262-267.

第一作者：硕士研究生(张建华研究员为通信作者,E-mail:jhzh882@163.com)

收稿日期：2023-03-12,改回日期:2023-03-28