切达奶酪作为世界上消费量最大的奶酪品种,由原料奶灭菌、发酵、排乳清、加盐和固形、成熟等加工工艺制成[1],风味是区分不同成熟度切达奶酪最重要的特征之一[2-3]。研究表明,美国消费者更偏好具有奶香味、奶油味、乳清味等风味特征的切达奶酪,而中国消费者更偏好于奶香味和坚果味[4]。因此开发奶香味浓郁的切达奶酪对于中国消费者具有重要意义。
奶酪中奶香味和奶油味的主要贡献者为双乙酰,随着奶酪成熟时间的延长,产品中的双乙酰含量呈递减趋势,在成熟时间长(>6个月)的切达奶酪中双乙酰含量显著降低。基于双乙酰合成与代谢途径,有多重因素会影响奶酪中双乙酰的含量。α-乙酰乳酸通过无酶氧化脱羧反应生成双乙酰,但是α-乙酰乳酸易在α-乙酰乳酸脱羧酶及双乙酰还原酶的作用下生成风味强度较弱的乙偶姻[5-6]。因此本研究以产双乙酰能力、乙偶姻还原酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和双乙酰还原酶活力等筛选指标评价乳酸菌的合成双乙酰能力,以自溶度、产酸水平为切达奶酪附属发酵剂的筛选指标,构建具有合成双乙酰能力的切达奶酪附属发酵剂筛选模型;采用加速成熟模型评价相关菌株对切达奶酪基本理化指标、蛋白水解程度、质构变化以及挥发性风味物质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
作为奶酪发酵剂的乳酸乳球菌RA 21 LYO购自上海Danisco公司,其余22株乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和乳酸杆菌来自江南大学食品学院生物技术中心菌种保藏库。
1.1.2 试剂
新鲜牛乳,无锡天资乳业;脱脂乳粉,Fonterra公司;2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯、乙偶姻、庚酸甲酯、双乙酰、NADH,上海生物工程技术服务有限公司;发酵剂RA 21 LYO、凝乳酶,上海Danisco公司;琼脂粉、氨水、牛肉膏、胰蛋白胨、冰醋酸、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钠、吐温80、硫酸亚铁、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、硫酸锰、磷酸氢二钾、乙醇、铬酸钾、酚酞、硝酸银、石油醚、浓硫酸、磷酸二氢钾、考马斯亮蓝G-250、硫酸钾、硼酸、三氯乙酸,乙酸锌、乙醚、亚铁氰化钾、硫酸铜,分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司;β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、无水乙酸钠,上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基、LBS培养基用于乳杆菌的活化及计数;GM 17培养基用于乳酸乳球菌的活化及计数。
1.2 仪器与设备
HWS-150恒温恒湿奶酪培养箱、电热恒温鼓风干燥箱,上海森信实验仪器有限公司;pH计、自动电位滴定仪,瑞士METTLER公司;半自动凯氏定氮仪,丹麦福斯公司;物性测试分析仪TA-XT2i,英国Stable Micro Systems公司;气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2100、紫外可见分光光度计,日本岛津分析仪器公司;超声波细胞破碎仪,美国Sonics公司;高速离心机,上海实维实验仪器技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 切达奶酪附属发酵剂筛选
1.3.1.1 菌株活化及无细胞提取液制备
乳杆菌按2%(体积分数)比例接种量接种于MRS培养基中,置于37 ℃恒温培养3代。乳酸乳球菌按2%(体积分数)比例接种量接种于GM 17培养基中,置于30 ℃恒温培养3代。
无细胞提取液制备:将活化3代后的菌液于5 000×g、4 ℃下离心15 min,倒掉上清液后菌泥用0.05 mol/L的pH 7.0磷酸钠缓冲液清洗2次后重悬细胞,初始OD600值为0.5。超声破碎细胞后收集上清液(cell free extract,CFE)并测定蛋白质浓度。
1.3.1.2 双乙酰浓度测定
将菌株活化3代后的菌液接种量接入100 g/L脱脂乳,37 ℃培养并每隔4 h取样测定。样品与等体积80 g/L三氯乙酸混合后4 ℃,4 500 r/min离心10 min,上清过滤纸后取10 mL清液加入0.5 mL 1%(体积分数)的邻苯二胺,测定OD350值。
1.3.1.3 α-乙酰乳酸脱羧酶活力测定
使用pH 6.0的磷酸钠缓冲液(200 mmol/L)与2.5 mg CFE配制反应体系,加入α-乙酰乳酸(300 mmol/L)后测定第0 min和第15 min反应体系的乙偶姻浓度。1个α-乙酰乳酸脱羧酶活力记为1 μmol乙偶姻/min。
1.3.1.4 双乙酰还原酶活力测定
使用双乙酰(3.9 mmol/L)、NADH(0.039 mmol/L)、CFE(100 μL)和pH 6.0的磷酸钠缓冲液(27 mmol/L)配制体积为300 μL的反应体系,于37 ℃下反应30 min 后测定OD340,1个双乙酰还原酶活力记为1 μmol NADH/min。
1.3.1.5 乙偶姻还原酶活力测定
反应体系使用3.9 mmol/L的乙偶姻,其余操作同1.3.1.4节。
1.3.1.6 自溶度测定
菌株培养3代后离心并用0.05 mol/L的pH 7.0的磷酸钠缓冲液重悬菌体,用磷酸钠缓冲液调整初始OD600值为1.0左右。30 ℃下测定悬浮液的OD600值,分别记作OD0(0 h)和OD24(24 h)。菌体自溶度计算如公式(1)所示:
菌体自溶度
(1)
1.3.1.7 产酸能力测定
测定菌株在脱脂乳中培养0 h及18 h的pH,分别记作pH0和pH1,ΔpH计算如公式(2)所示:
ΔpH=pH0-pH1
(2)
1.3.2 切达奶酪的制备及附属发酵剂验证
1.3.2.1 切达奶酪的制作
参考GANESAN等[7]的方法制作切达奶酪。巴氏杀菌乳冷却至32 ℃后接入发酵剂和附属发酵剂,加入凝乳酶(0.002%)静置30 min,切割后愈合5 min,缓慢搅拌并升温至39 ℃后保温30 min并排乳清,凝块切割并每隔15 min翻面再次排乳清直至乳清酸度达到45～55 °T结束堆酿。分3次加入3%牛乳质量的盐,混匀后在模具中静置18 h成型,真空包装。于12 ℃、湿度为85%的成熟箱中加速成熟。
1.3.2.2 奶酪基本成分测定
切达奶酪中水分含量采用GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》烘箱常压干燥法测定;脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中罗兹-哥特里法测定;蛋白含量参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中凯式定氮法测定;盐分含量采用GB 5009.42—2016《食盐指标的测定》中硝酸银-铬酸钾法测定;pH用pH计参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》中方法测定。
1.3.2.3 蛋白水解能力测定
参考HOU等[8]方法测定蛋白水解能力。将0.75 g研磨后的奶酪加入25 mL pH 4.6的醋酸盐缓冲溶液混匀后离心(4 000 r/min,20 min),取5 mL上清液凯氏定氮可得pH 4.6可溶性氮含量;取10 mL上清液加入5%(体积分数)的钨磷酸溶液1 mL后混匀离心,取5 mL上清凯氏定氮可得5%钨磷酸可溶性氮。将1.50 g研磨后的奶酪加入120 g/L三氯乙酸溶液25 mL,相同条件离心并测定氮含量可得12%三氯乙酸可溶性氮含量。
1.3.2.4 质构测定
将边长为1 cm的立方体切达奶酪,按其纤维垂直于压缩盘的方向放置,压缩探头选用圆柱型探头P/35。设定探头下降速率5 mm/s,回程速率和测试速率均为1 mm/s,压缩2次,下压距离10 mm。设置触发力0.2 N,形变量50%。每个样品重复5次。
1.3.2.5 挥发性物质测定
利用气相色谱-质谱联用仪测定切达奶酪中挥发性风味物质。称取3 g提前粉碎好的切达奶酪颗粒于进样瓶中,内标选择1 μL质量浓度为0.27 mg/mL的庚酸甲酯,固相萃取条件为60 ℃、40 min。气相条件选择HP Innowax毛细管柱,质谱条件设置离子化方式为EI,其余条件与参考文献相同。
1.3.2.6 切达奶酪感官分析
感官评定小组由来自江南大学食品学院的11人组成,按照GB/T 162912—2012《感官分析选拔》对评价员进行每周2次的一致性训练,每次持续2 h,共计40 h。结合参考文献[1]制定的描述词,参考GB/T 10221—2012《感官分析术语》制定感官而分析术语。感官评价时,于无色无味透明含盖塑料杯中称取20 g切达奶酪样品,评价员通过嗅闻评价奶酪气味;通过品尝进行滋味评价。实验中每次随机为评价员呈递3～4个样品,每个样品传递2次,以15点标度打分。
1.4 统计分析及数据处理
使用SPSS 22.0进行单因素方差分析;用GraphPad Prism 9.0.0、Origin 2023绘图。
2 结果与分析
2.1 筛选具有双乙酰合成能力的切达奶酪附属发酵剂
2.1.1 筛选具有双乙酰合成能力的乳酸菌
2.1.1.1 产双乙酰能力测定
对23株乳酸菌进行产双乙酰能力测定,结果见表1。不同菌株在产双乙酰方面存在显著差异,双乙酰产量为4.34～11.24 mg/L,与文献报道相近[9-11],其中菌株CCFM 609、CCFM 44、CCFM 607、CCFM 601产双乙酰能力较高,双乙酰产量为10.69～11.24 mg/L,显著高于市售发酵剂菌株RA 21 LYO产生的6.82 mg/L。
表1 乳酸菌产双乙酰能力测定结果
Table 1 Results of diacetyl production of selected lactic acid bacteria
编号菌株号菌名测定时间/h最大双乙酰产量/(mg/L)1RA 21 LYO乳酸乳球菌乳脂亚种245.06±0.07d2CCFM 12短乳杆菌369.73±0.05n3CCFM 43乳酸乳球菌3611.12±0.04r4CCFM 44乳酸乳球菌206.41±0.01h5CCFM 135短乳杆菌369.35±0.06m6CCFM 139乳酸乳球菌乳亚种367.72±0.03k7CCFM 191植物乳杆菌3610.11±0.02o8CCFM 223乳酸乳球菌乳脂亚种365.33±0.04e9CCFM 224乳酸乳球菌乳脂亚种244.34±0.04a10CCFM 234植物乳杆菌245.78±0.07f11CCFM 241植物乳杆菌247.42±0.04j12CCFM 259植物乳杆菌366.81±0.02i13CCFM 309植物乳杆菌204.43±0.04a14CCFM 410植物乳杆菌246.25±0.03g15CCFM 412植物乳杆菌244.93±0.03c16CCFM 601植物乳杆菌2410.69±0.07p17CCFM 602植物乳杆菌247.62±0.04k18CCFM 603植物乳杆菌204.73±0.01b19CCFM 604植物乳杆菌245.88±0.04f20CCFM 605植物乳杆菌247.71±0.01k21CCFM 607发酵乳杆菌2011.05±0.21q22CCFM 608乳酸杆菌248.50±0.01l23CCFM 609乳酸杆菌2011.24±0.06r
注：不同字母表示同一列数据之间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.1.1.2 酶活力的测定
α-乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶和乙偶姻还原酶活力越低,切达奶酪发酵过程中积累的双乙酰越多。对于23株菌3种酶活力的测定结果见图1。与市售发酵剂RA 21 LYO相比,菌株CCFM 44、CCFM 223、CCFM 309 3种酶的活力较高,而菌株CCFM 601的3种酶活力均相对较低。
a-双乙酰还原酶活力;b-乙偶姻还原酶活力;c-α-乙酰乳酸脱羧酶活力
图1 不同菌株的酶活力测定结果
Fig.1 Results of enzyme activity of selected strains
注:不同字母表示一组数据之间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.1.2 切达奶酪附属发酵剂的筛选
2.1.2.1 自溶度测定
细菌自溶指菌体在一些特定条件下自身释放自溶酶溶解胞壁质进而使细胞内物质释放到环境中。自溶过程会向环境中释放蛋白酶、脂肪酶等酶类,促进乳体系中蛋白质、脂肪和乳糖等物质的降解代谢并生成多种风味物质[12],在切达奶酪成熟过程中产生更少的苦味。根据AYAD等[13]对于菌株自溶度强弱的划分,自溶度为25%～35%则自溶能力强;15%～24%表明自溶能力中等;自溶度<14%则示为自溶能力弱。实验所用23株菌株自溶度见图2-a。可以看出菌株间自溶度为9.39%～26.77%,存在显著差异。除菌株CCFM 223、CCFM 602、CCFM 43、CCFM 608、CCFM 605自溶能力较弱外,其他菌株自溶能力均在15.00%以上,其中菌株CCFM 259表现出最强的自溶能力,达到26.77%。
a-菌株自溶度;b-菌株产酸能力
图2 不同菌株的自溶度和产酸能力测定结果
Fig.2 The results of autolysis degree and acid production of selected strains
2.1.2.2 产酸能力测定
对23株菌产酸能力的测定情况见图2-b。可以看出不同菌株的产酸能力差异显著,市售发酵剂RA 21 LYO的产酸能力最强,pH降至2.37仅用时18 h;而菌株CCFM 191产酸能力最弱,18 h后pH仅能降至0.66。因为附属发酵剂菌株不能具有强产酸能力以防奶酪酸化过度,CCFM 601、CCFM 191、CCFM 259、CCFM 234、CCFM 12、CCFM 135、CCFM 309、CCFM 410、CCFM 241、CCFM 412产酸水平ΔpH≤1.1,比较符合奶酪附属发酵剂产酸能力要求。
2.2 验证具有双乙酰合成能力的切达奶酪附属发酵剂筛选模型
由于奶酪成熟时间较长,本研究采用加速成熟模型,可快速验证所筛选的菌株对切达奶酪品质的影响。令自制切达奶酪在12 ℃下成熟6周,并在成熟第0天、第1、2、3、4、5、6周测定各项指标,以评价菌株对切达奶酪风味的影响。
2.2.1 筛选菌株对切达奶酪基本成分的影响
以不添加附属发酵剂切达奶酪作为对照组,分别添加4株附属发酵剂切达奶酪作为实验组,在成熟前利用1.3.2.2节方法测定5组奶酪的基本理化指标,结果见表2。切达奶酪pH值为5.19～5.29,蛋白质含量为34.57%～35.97%,盐含量为1.36%～1.44%,脂肪含量为16.83%～18.24%,水分含量为39.75%～40.16%。上述指标在不同组别间无显著性差异,故待筛选菌株对切达奶酪的pH和基本成分无明显影响。
表2 切达奶酪基本成分结果
Table 2 The basic composition of cheddar cheese
编号pH蛋白质/%盐含量/%脂肪/%水分/%对照组5.29±0.08a34.57±1.70a1.43±0.14a16.83±0.88a40.98±1.02aCCFM 6015.23±0.06a35.86±1.50a1.41±0.16a17.26±1.58a40.16±1.27aCCFM 3095.25±0.11a34.98±1.10a1.44±0.10a16.95±1.23a39.75±0.96aCCFM 4125.27±0.17a35.39±0.98a1.35±0.13a18.24±0.16a39.89±1.17aCCFM 445.19±0.16a35.97±1.34a1.36±0.08a16.87±0.99a40.47±1.48a
2.2.2 筛选菌株对切达奶酪成熟过程中蛋白水解的影响
切达奶酪成熟过程中主要经历蛋白质水解、糖酵解和脂质代谢等变化,其中蛋白质水解是在各种蛋白酶和肽酶的作用下将酪蛋白水解成一系列多肽和氨基酸,对奶酪的风味和质构有重要影响[14]。水溶性氮(pH 4.6)可以测定奶酪中的小肽和中肽,12%三氯乙酸可溶性氮可测定小分子肽和游离氨基酸,5%磷钨酸可溶性氮主要测定氨基酸氮。菌株对奶酪不同成熟时期蛋白水解的影响见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037809,下同)。可以看出5组切达奶酪在成熟过程中的可溶性氮、12%三氯乙酸可溶性氮和5%磷钨酸可溶性氮含量都呈现增加趋势,这说明奶酪成熟的6周内在凝乳酶、发酵剂和附属发酵剂产生的酶的共同作用下蛋白质水解持续进行。4个实验组间的蛋白水解程度无明显差异,但与对照组相比在成熟后期实验组可溶性氮含量显著增高8.01%。这可能是由于附属发酵剂在奶酪成熟后期仍不断产生蛋白酶加速蛋白水解。
2.2.3 筛选菌株对切达奶酪成熟过程中质构的影响
利用TPA模式测定5组自制切达奶酪成熟过程中的质构特性,结果见附表2。可以看出,5组切达奶酪在成熟过程中硬度、弹性、咀嚼性、回复性不断降低,而凝聚性先降低后增大。这是由于奶酪成熟过程中蛋白的水解作用使蛋白胶束结构变得脆弱,进而降低奶酪硬度;同时酪蛋白网络结构被破坏造成奶酪体系松散,弹性和回复性降低[15]。成熟后期自由水进入蛋白胶束增大了蛋白分子间的作用力,故使凝聚性呈现先降低后增大的趋势。而咀嚼性体现了咀嚼过程中整体的能量消耗,在成熟期内总体呈下降趋势。结果显示不同组别间奶酪质构特性无显著差异,故待筛选菌株在对奶酪质构的影响方面没有明显影响。
2.2.4 筛选菌株对切达奶酪过程中挥发性风味物质的影响
对切达奶酪成熟第1天和第6周的挥发性物质组成进行测定,结果见附表3。共检出醇类、酮类、酯类、酸类、醛类、含硫化合物等35种。大部分风味物质含量在第6周都得到了显著增加,其中2,3-丁二醇、2-壬酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和乙酸、丁酸等物质含量较高,对切达奶酪风味作出重要贡献。2,3-丁二醇赋予奶酪果味,2-壬酮赋予奶酪脂肪香味[5],3-甲基丁醛和2-甲基丁醛赋予麦芽风味和坚果味[6],而酸类赋予奶酪酸味和芝士味。不同发酵时期添加附属发酵剂的奶酪挥发性物质含量均高于对照组,这说明附属发酵剂可以在切达奶酪成熟过程中赋予奶酪更丰富的风味。
表3 成熟过程中切达奶酪的气味感官分析结果 单位:分
Table 3 Results of descriptive aroma attributes of cheddar cheese during ripening
成熟/周组别坚果味奶香味酸味腐臭味蒸煮味硫味气味强度喜好度对照组0.10±0.03a4.96±0.07bc7.07±0.14cd0.00±0.00a7.41±0.07ab0.00±0.00a4.91±0.07a3.58±0.14aCCFM 6010.65±0.06bc5.24±0.07d6.23±0.10d0.00±0.00a7.36±0.20a0.00±0.00a4.72±0.31a3.76±0.28a0CCFM3090.38±0.23ab4.51±0.13a6.62±0.10b0.00±0.00a7.55±0.11ab0.00±0.00a5.00±0.08a3.85±0.06aCCFM 4120.83±0.24c4.78±0.10b6.89±0.08c0.00±0.00a7.45±0.08ab0.00±0.00a4.82±0.08a4.31±0.03bCCFM 440.15±0.04a5.18±0.06cd7.28±0.08cd0.00±0.00a7.71±0.07b0.00±0.00a4.96±0.08a3.91±0.07a对照组0.91±0.06a7.77±0.13b7.88±0.06c0.21±0.01a8.22±0.08ab0.30±0.17a5.72±0.01a7.39±0.14aCCFM 6011.43±0.18b8.32±0.27c7.01±0.06a0.18±0.04a8.78±0.07c0.27±0.21a5.50±0.30a8.54±0.16a1CCFM 3091.17±0.10ab7.30±0.18a7.41±0.11b0.19±0.20a8.34±0.06ab0.28±0.10a5.79±0.11a7.64±0.14aCCFM 4121.17±0.07ab7.30±0.16a7.41±0.08b0.19±0.03a8.34±0.11ab0.28±0.21a5.79±0.20a7.64±0.01aCCFM 440.94±0.06a8.27±0.20c8.07±0.04c0.15±0.08a8.50±0.08b0.42±0.03a5.75±0.03a7.70±0.30a对照组3.14±0.07c6.64±0.14a8.66±0.14b2.21±0.16b6.94±0.16a1.75±0.06a7.68±0.18c7.26±0.17abCCFM 6012.35±0.06a8.13±0.06e7.50±0.40a1.77±0.20ab8.01±0.06d1.22±0.11b7.51±0.08c8.46±0.21d2CCFM 3092.81±0.04b7.05±0.11b7.78±0.17a1.51±0.31a7.61±0.13b1.78±0.16a6.70±0.18a6.92±0.03aCCFM 4122.64±0.10b7.35±0.03c7.70±0.14a1.61±0.2ab7.71±0.21b1.97±0.07a7.08±0.06b7.66±0.00cCCFM 443.22±0.07c7.89±0.04d8.90±0.28b2.20±0.27b7.94±0.10c1.92±0.10a7.76±0.06c7.62±0.20bc对照组4.33±0.14b4.20±0.18a8.12±0.03b1.76±0.04a6.31±0.11a3.76±0.03c7.14±0.07a6.08±0.28abCCFM 6013.72±0.04a7.22±0.08d8.05±0.00a2.80±0.10c7.70±0.07c2.69±0.18a7.98±0.10b8.11±0.13d3CCFM 3094.09±0.11b4.41±0.09a8.15±0.00b2.16±0.14b6.53±0.11a3.16±0.04b8.99±0.10c5.75±0.06abCCFM 4125.06±0.20c5.01±0.16b8.66±0.01d2.57±0.06c7.13±0.21b2.48±0.01a8.77±0.14c7.16±0.03cCCFM 444.40±0.08b6.44±0.11c8.35±0.03c1.74±0.08a7.49±0.18b3.92±0.06c7.21±0.21a6.43±0.25b对照组4.44±0.10ab3.66±0.24a8.40±0.06a2.79±0.01a4.69±0.23a4.13±0.11ab8.33±0.10ab5.64±0.40aCCFM 6014.18±0.06a6.41±0.10d8.43±0.07a3.53±0.17c6.80±0.08d3.79±0.07a7.93±0.17a7.21±0.06c4CCFM 3094.79±0.10bc4.01±0.21a8.67±0.03b4.23±0.03d5.86±0.16a5.11±0.16c8.49±0.20b6.35±0.07bCCFM 4124.88±0.20c4.38±0.11b8.49±0.14ab3.23±0.00b6.04±0.13ab4.39±0.18b8.96±0.20c6.99±0.00cCCFM 444.47±0.17ab5.06±0.27c8.59±0.06ab2.73±0.04a6.35±0.08c4.25±0.25b8.36±0.11b5.95±0.08ab对照组5.99±0.21d3.31±0.03a9.69±0.07bc3.89±0.10a4.52±0.17a6.14±0.07b8.89±0.04b5.87±0.16aCCFM 6013.96±0.07a5.33±0.27c9.29±0.08ab4.05±0.06ab7.13±0.11c5.48±0.07a8.86±0.18b7.93±0.08d5CCFM 3094.52±0.14b3.30±0.17a9.08±0.20a4.41±0.14b5.41±0.18b5.49±0.13a8.14±0.10a6.17±0.01bCCFM 4124.89±0.11c3.39±0.30a9.04±0.30a3.97±0.17a5.78±0.11b5.50±0.10a8.06±0.11a6.99±0.04cCCFM 446.02±0.07d4.51±0.23b9.88±0.25c3.83±0.24a6.04±0.20b6.26±0.07b8.92±0.14b6.18±0.10b对照组5.55±0.10b3.27±0.01a9.68±0.28bc5.45±0.08c4.53±0.07a6.70±0.14a7.75±0.07a5.27±0.2abCCFM 6014.88±0.01a5.09±0.17c8.95±0.06a4.23±0.14ab6.59±0.07d6.03±0.16ab8.87±0.10c6.14±0.11c6CCFM 3095.53±0.18b3.21±0.24a10.69±0.21d4.43±0.10b4.60±0.11a6.40±0.30bc8.51±0.17b5.11±0.00abCCFM 4125.63±0.17b3.04±0.21a9.31±0.16ab3.98±0.11a4.88±0.08b5.87±0.11c8.52±0.08b5.61±0.06bCCFM 445.58±0.10b4.07±0.13b9.87±0.13c5.39±0.06c5.79±0.07c6.82±0.17c7.78±0.07a5.58±0.17b
本研究对切达奶酪成熟过程中双乙酰含量的变化进行了测定,结果见图3。可以看出双乙酰含量在不同组别中存在显著差异,且随着成熟时间的延长双乙酰含量呈递减趋势。这是因为在奶酪成熟过程中菌株代谢柠檬酸被不断消耗,进而导致双乙酰生成减少[16]。而由于菌株CCFM 44和CCFM 601产双乙酰能力较高,在成熟过程中双乙酰含量均保持较高值。
图3 成熟过程中切达奶酪的双乙酰含量
Fig.3 The concentration of diacetyl of cheddar cheese during ripening
2.2.5 筛选菌株对切达奶酪成熟过程中感官评定的影响
2.2.5.1 切达奶酪成熟过程中气味特征分析
切达奶酪气味特征感官分析结果见表3,气味强度在奶酪成熟过程中不断增强。从表3中可以看出,对于蒸煮味和奶香味,不同组别均在成熟第1～2周达到最高,而硫味、坚果味、酸味、腐臭味均随着成熟时间的延长强度不断增强。总体而言,对不同组别的奶酪,评价员均更偏向于成熟第1周的产品,且对CCFM 601组的喜好度更高,因为其有更浓郁的奶香味和更低的酸味和腐臭味。结合附属发酵剂发酵特性可以看出,对比CCFM 412与CCFM 601组,CCFM 601组有更高的双乙酰含量,2株菌均有较低的酶活力,但是后者产生双乙酰的能力更强,证明了以产双乙酰能力为筛选指标的有效性。
2.2.5.2 切达奶酪成熟过程中滋味特征分析
对切达奶酪成熟过程中的滋味感官分析结果见表4。随着奶酪成熟时间延长滋味强度显著增强。不同实验组别奶香味和奶油味在成熟第1周达到最大,而其他风味均随时间的延长不断积累。比较组别CCFM 412和CCFM 309,2组附属发酵剂产双乙酰能力均较高,而CCFM 412酶活力更低,因此奶香味得分更高。比较CCFM 44组和CCFM 601组,CCFM 601组奶酪奶香味更强,2组附属发酵剂有较低的产双乙酰能力,但CCFM 601酶活力更低。总体而言,评价员对CCFM 601组的滋味喜好度显著高于其他组。由此说明,更低的α-乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶、乙偶姻还原酶活力会使菌株产生更多的双乙酰,赋予切达奶酪更多的奶香味。
表4 成熟过程中切达奶酪的滋味感官分析结果 单位:分
Table 4 Results of descriptive attributes of cheddar cheese during ripening
成熟/周组别坚果味奶香味咸味奶油味鲜味肉汤味酸味腐臭味苦味硫味不洁味成熟度滋味强度喜好度对照组0.45±0.21a4.45±0.01c3.27±0.01a3.45±0.04a2.70±0.35a1.18±0.04b5.09±0.03c0.82±0.51a0.91±0.18a0.36±0.35a1.64±0.07a1.89±0.4a3.18±0.23a2.73±0.10aCCFM 6011.00±0.16b4.64±0.07d3.64±0.06b3.82±0.16b3.00±0.21a0.91±0.06ab4.43±0.07a0.45±0.23a0.73±0.03a0.36±0.06a1.00±0.35a1.54±0.31a3.27±0.17a3.01±0.04bc0CCFM 3090.73±0.07ab4.00±0.01a3.64±0.06b3.91±0.07b3.10±0.07a0.73±0.34ab4.73±0.13b0.91±0.45a1.13±0.31a0.64±0.24a1.36±0.23a1.64±0.33a3.36±0.41a2.91±0.01abCCFM 4120.82±0.03b4.18±0.04b3.54±0.11ab3.73±0.07b3.20±0.41a0.54±0.06a4.82±0.04b0.72±0.45a0.82±0.01a0.54±0.04a1.27±0.37a2.00±0.24a3.01±0.16a3.18±0.06cdCCFM 440.91±0.13b4.82±0.04e3.36±0.21ab3.91±0.04b3.10±0.27a0.82±0.33ab5.25±0.01c0.65±0.41a0.91±0.27a0.54±0.16a1.36±0.49a2.18±0.08a3.02±0.45a3.36±0.11d对照组2.54±0.24c5.27±0.08a3.27±0.04a6.00±0.07c3.52±0.27c2.27±0.01d5.18±0.16a1.12±0.49a1.36±0.34a1.18±0.13b1.54±0.52a4.54±1.15a5.04±0.31ab5.02±0.06aCCFM 6011.82±0.11a7.18±0.01d3.64±0.08a6.45±0.04d4.49±0.33d2.00±0.04c5.00±0.08a1.19±0.31a1.54±0.16a0.54±0.04a1.00±0.21a6.02±0.30a5.54±0.27b7.11±0.08e1CCFM 3092.36±0.08b6.00±0.04b3.64±0.07a5.00±0.27a2.51±0.45b1.45±0.12b5.00±0.07a1.28±0.35a1.54±0.30a1.27±0.23b1.54±0.31a6.11±0.35a4.54±0.17a5.45±0.04bCCFM 4122.18±0.01b6.18±0.01c3.54±0.21a5.54±0.16b1.48±0.42a1.18±0.07a5.09±0.01a1.06±0.21a1.54±0.06a1.27±0.06b1.45±0.52a5.03±0.55a5.00±0.44ab6.04±0.07cCCFM 442.18±0.07b7.36±0.01e3.36±0.24a6.54±0.07d3.36±0.10c1.54±0.03b5.45±0.04b1.54±0.55a1.45±0.23a0.82±0.31ab1.05±0.37a4.5±0.16a4.54±0.41a5.54±0.06d对照组3.54±0.13b4.54±0.10a3.54±0.06a4.00±0.08a2.51±0.24a3.54±0.06a5.36±0.17a1.20±0.47a1.72±0.38a2.45±0.11c2.54±0.33b5.00±0.41a5.11±0.57a4.54±0.04bCCFM 6013.00±0.10a6.54±0.21d4.82±0.03c5.18±0.07e4.50±0.06bc3.73±0.16a5.45±0.03a1.32±0.24a2.00±0.30a2.18±0.07bc1.54±0.23a6.21±0.21a6.03±0.18ab6.64±0.10e2CCFM 3093.54±0.03b5.00±0.03c4.04±0.27b4.54±0.10c3.03±0.37a3.54±0.30a5.45±0.14a1.64±0.17a1.64±0.21a2.64±0.13c1.45±0.23a6.06±0.49a6.54±0.21b4.00±0.03aCCFM 4123.64±0.04b5.73±0.06b3.64±0.14ab4.27±0.04b5.02±0.45c3.45±0.16a5.36±0.06a1.45±0.52a2.09±0.07a1.82±0.21ab1.54±0.34a5.52±0.06a6.02±0.47ab5.36±0.16cCCFM 443.54±0.17b6.00±0.06b3.45±0.13a4.82±0.08d4.00±0.11b3.64±0.11a5.64±0.06a1.54±0.21a1.72±0.13a1.64±0.03a1.00±0.44a5.50±0.51a5.54±0.41ab5.73±0.17d对照组4.00±0.17cd3.27±0.06a3.54±0.16a3.91±0.03a2.63±0.45a4.18±0.07b5.54±0.04a1.18±0.41a2.00±0.27a3.54±0.13b1.36±0.25a5.82±0.13a6.18±0.24a4.09±0.03aCCFM 6013.36±0.10a5.91±0.24d4.91±0.11c4.73±0.08d6.01±0.41c4.54±0.13c5.64±0.01a1.54±0.44a2.18±0.18bc3.00±0.08a1.64±0.44a6.73±0.18b6.82±0.17b5.58±0.16d3CCFM 3093.73±0.01b3.82±0.01b4.00±0.10b4.25±0.11b6.29±0.55c4.00±0.10a5.73±0.03a1.82±0.23a2.54±0.18bc4.54±0.04c1.36±0.57a6.73±0.44b6.36±0.33ab3.91±0.01aCCFM 4124.18±0.06d4.36±0.07c3.73±0.11ab3.88±0.07a3.88±0.49b4.27±0.10bc5.64±0.27a1.45±0.33a2.82±0.16b3.54±0.07b1.27±0.21a6.36±0.30ab6.18±0.30a5.18±0.10cCCFM 443.82±0.04bc5.18±0.07e3.45±0.13a4.54±0.03c4.63±0.18b3.82±0.21a6.27±0.21b1.73±0.30a2.00±0.38b3.00±0.21a1.18±0.47a6.27±0.17ab5.73±0.01a4.27±0.08b对照组4.54±0.14d3.00±0.03a4.54±0.31a3.54±0.01a3.33±0.38ab6.64±0.16d6.36±0.07a2.27±0.42a2.64±0.11a5.45±0.25c1.64±0.06a6.82±0.41a6.01±0.39a4.02±0.08bCCFM 6013.54±0.24a5.64±0.13d4.36±0.21a4.54±0.03c4.17±0.40b5.00±0.33bc6.45±0.04a2.36±0.01a2.82±0.30ab4.54±0.03a2.54±0.47ab7.36±0.27a6.18±0.16a5.67±0.11d4CCFM 3093.82±0.04ab3.00±0.04a4.45±0.11a3.73±0.18a3.50±0.34ab4.82±0.24b6.50±0.01a2.54±0.27a3.27±0.27bc5.00±0.21bc3.18±0.55b7.64±0.54a5.82±0.28a3.54±0.04aCCFM 4124.36±0.21cd4.00±0.03b4.45±0.16a3.64±0.08a3.00±0.40a5.54±0.17c6.36±0.06a2.36±0.20a3.64±0.10c5.00±0.01bc1.64±0.45a7.82±0.51a6.00±0.41a5.17±0.17cCCFM 444.00±0.07bc4.64±0.16c4.64±0.07a4.18±0.01b4.01±0.16b4.18±0.14a7.82±0.07b3.64±0.31b2.91±0.11ab4.91±0.18b1.82±0.30a7.64±0.06a5.54±0.08a3.91±0.07b对照组4.82±0.11c2.82±0.11a5.36±0.30a3.18±0.04a5.54±0.18a6.67±0.10b6.50±0.08a2.64±0.21a4.00±0.13a5.82±0.07c1.64±0.49a6.91±0.93a5.67±0.44a5.33±0.16bCCFM 6014.18±0.16a4.82±0.13d5.36±0.14a4.00±0.01c5.36±0.38a5.50±0.30a6.64±0.06a2.45±0.33a4.36±0.27a5.18±0.01a2.64±0.32b7.64±0.47a6.82±0.17c6.33±0.14d5CCFM 3094.27±0.06a3.00±0.01a5.83±0.01b3.36±0.16ab5.02±0.41a5.33±0.16a6.73±0.04a2.82±0.21a4.27±0.06a5.54±0.17abc2.64±0.24ab7.91±0.41a6.36±0.14bc5.83±0.01cCCFM 4124.54±0.07b3.45±0.01b5.09±0.13a3.54±0.03b5.82±0.55a6.50±0.33b6.54±0.33a2.36±0.37a5.00±0.17b5.27±0.04ab2.18±0.16ab8.09±0.33a6.54±0.17bc5.67±0.04cCCFM 444.64±0.08bc4.18±0.10c5.27±0.08a3.82±0.04c5.54±0.25a5.67±0.11a8.09±0.07b2.64±0.21a4.18±0.07a5.64±0.27bc1.82±0.41ab7.82±0.03a6.18±0.10ab3.67±0.17a对照组5.91±0.18c2.18±0.16a5.73±0.21a2.82±0.06a6.09±0.33a7.36±0.17c6.5±0.03a2.82±0.30a4.09±0.44a6.54±0.08b2.73±0.31a7.36±1.57a5.72±0.03a5.33±0.01bCCFM 6015.36±0.04ab4.36±0.07c5.64±0.04a3.54±0.04c6.45±0.44a6.18±0.24a6.73±0.01c2.54±0.13a5.00±0.17b5.64±0.04a2.45±0.41a8.09±0.31a6.82±0.27b6.67±0.10d6CCFM 3095.27±0.21a2.09±0.06a6.09±0.06b3.00±0.25a5.91±0.23a6.54±0.04ab7.09±0.01d3.09±0.41a5.09±0.33b7.82±0.24c2.09±0.44a8.09±0.45a6.82±0.01b5.83±0.00cCCFM 4125.64±0.01bc3.09±0.04b5.45±0.07a3.09±0.01ab6.54±0.17a6.82±0.10b6.64±0.03b2.54±0.31a5.64±0.33b6.82±0.01b2.82±0.24a8.45±0.35a6.64±0.21b5.67±0.20cCCFM 445.45±0.03ab3.27±0.17b5.45±0.03a3.36±0.06bc6.18±0.34a7.54±0.16c10.18±0.01e4.73±0.24b5.18±0.13b6.64±0.06d2.36±0.17a8.36±0.11a6.18±0.57ab2.33±0.13a
3 结论
本文通过分析包含市售发酵剂在内的23株乳酸菌的产双乙酰能力、α-乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶和乙偶姻还原酶活力、自溶度和产酸能力,筛选具有不同产生双乙酰能力的附属发酵剂菌株,并用加速模型验证菌株对切达奶酪品质的影响。结果表明不同产双乙酰能力和α-乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶和乙偶姻还原酶活的菌株作为附属发酵剂时对切达奶酪成熟期间的基本成分变化、微生物变化、蛋白水解情况和质构变化无显著影响,但对切达奶酪的挥发性物质、感官气味和滋味的影响较大。菌株CCFM601能产生更多的双乙酰、有更低的α-乙酰乳酸脱羧酶、乙偶姻还原酶和双乙酰还原酶活力,且具有高自溶度和低产酸水平的特点,可赋予切达奶酪更多奶香味,具有作为切达奶酪附属发酵剂的潜力。
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