牡蛎是中国著名而常见的贝类,属于软体动物门(Mollusca),瓣鳃纲住,异柱目,牡蛎科。牡蛎广泛分布于热带、亚热带和温带海区。我国是海产养殖大国,牡蛎因其具有养殖成本低、售价高等特点,是我国海产养殖者的主要养殖品种和经济来源[1],在海水养殖中占有重要地位。2022年,我国牡蛎年养殖量高达619万t,同比增长6.54%[2],其中福建、广东产量分别占31.31%和18.57%,位居前列,是我国牡蛎的主要产区。

牡蛎肉质鲜美,富含蛋白质(45%～47%)、脂肪酸(7%～11%)、牛磺酸(50.6 mg/g)、总糖(20%～40%)和微量元素(硒、锌、钙)等,有极高的营养价值,被誉为“海中牛奶”,是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一[3]。此外,牡蛎富含呈味氨基酸(天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸)[4]、呈味核苷酸(GMP、IMP和AMP)和糖原[5],汁液味道十分鲜美,独具特色,深受大众喜爱,是制造佐料的上好原料。但牡蛎肉体内和生长环境固有的以及加工过程产生的腥味,使牡蛎的应用领域受到限制,难以实现高值化利用。已有的研究表明[6],牡蛎肉中挥发性化合物包含醛类物质[如(E)-2-壬烯醛]、醇类物质(如1-辛烯-3-醇)、酮类物质(如2,3-辛二酮)、呋喃类物质(如2-戊基呋喃)等,这些化合物是牡蛎肉呈现果香味以及青草香味等悦人气味的主要风味物质。与酶解前相比,酶解后的牡蛎腥味及苦涩味明显,主要风味物质变为呈现腥味的醛类及硫醚类化合物,这些物质的存在使得牡蛎肉酶解液风味变差,整体表现为腥味、臭味及哈喇味等不易被人接受的气味。因此,寻找安全有效的脱腥方式是制备高品质牡蛎产品亟待解决的关键技术难题。

水产品腥味物质成分复杂,其主要由脂质的氧化降解、芳香前体物质的分解、酶的催化分解、带有土腥味的藻类和微生物的代谢产物积累产生[7]。牡蛎除了自身固有的腥味之外,制备产品时进行的加热、酶解处理产生腥味严重影响其风味。目前脱腥的方法主要有物理脱腥法(真空、活性炭吸附、包埋)、化学脱腥法(姜汁、茶多酚、美拉德反应)和生物脱腥法(酵母发酵)[8]。任世英等[9]采用蛋白质回收率和感官评价法比较活性炭吸附法对河蚬肉酶解液脱腥脱苦效果,发现活性炭能消除酶解液的腥味,但同时会损失部分营养成分;张梅超[6]、刘琳琳[7]采用添加姜汁、茶多酚等物质进行酶解液脱腥,尽管具有一定的效果,但引入额外的风味成分,不利于牡蛎肉酶解液的应用;此外,与单因素脱腥法相比,联合脱腥法[10](酵母发酵法结合活性炭处理)既能提高蛋白回收率,又能有效去除腥味成分。上述传统的脱腥方法虽能吸附、掩盖或抑制腥味成分,但是对牡蛎肉酶解液的生物活性可能有不利影响。牡蛎中含有丰富的糖原,酶解液经美拉德反应能产生许多醛类、酮类和杂环类挥发性化合物,在改善酶解液原有风味和色泽的基础上,具有安全、脱腥效果好的功效,还能强化其生理活性。

本研究利用牡蛎中丰富的糖原物质,通过淀粉酶水解将糖原分解为小分子单糖,利用美拉德反应改良酶解液的风味,同时解析牡蛎肉及其酶解液的关键风味化合物及主要腥味成分,为制备高品质牡蛎产品提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰鲜牡蛎肉(洗净后于4 ℃保存)、木薯淀粉,厦门市集美区朴朴电商平台;碱性蛋白酶(80万 U/g)、淀粉酶(2万 U/g)、胰蛋白酶(25万 U/g),南宁庞博生物有限公司;氢氧化钠,国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Avanti J-25大型冷冻离心机,美国Beckman公司;PMK223ZH/E电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;PT-2500 E组织捣碎机,瑞士Kinematica公司;HDK-8D恒温水浴锅,中国上海跃进医疗器械有限公司;QP-2010 Plus GC-MS联用仪、Rtx-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱,日本岛津公司;57330-U手动固相微萃取进样器,美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

牡蛎肉样品:牡蛎去壳后洗净,加入2倍体积的去离子水进行组织捣碎,100 ℃水浴加热10 min,5 000×g离心10 min,取上清液,置于4 ℃保存备用。牡蛎肉酶解液的制备参考LIANG等[11]的方法,并做适当修改。牡蛎去壳洗净后打浆,料液比为1∶2(g∶mL),用1 mol/L NaOH溶液调节反应体系至pH 7.0,分别加入不同的添加剂(表1),在50 ℃下酶解3 h,100 ℃水浴灭酶10 min,冷却至室温后,5 000×g离心10 min,收集上清部分,即为牡蛎肉酶解液,4 ℃贮存备用。

1.3.2 感官评定

将样品置于50 mL样品瓶中,选择10名感官评定员(5男5女),年龄为20～25岁,均系统学习过感官评定课程,拥有丰富的感官评定经验。采用0～5分制对样品反映出的鱼腥味、金属味、青草味、果香味、哈喇味强度进行评分,其中1～2分表示气味强度较低,3～4分表示气味强度中等,5分表示气味强度较高,取平均值作为气味最后得分。感官环境为室温(25±2) ℃,室内无其他干扰物质。

1.3.3 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取(head-space solid-phase micro-extraction, HS-SPME)的操作参考LI等[12]的方法,并做适当修改。分别吸取3 mL牡蛎肉及其酶解液于顶空瓶中,置于80 ℃水浴中平衡20 min,将预老化的65 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)微萃取头插入顶空瓶中,继续放入80 ℃水浴中吸附30 min。

1.3.4 GC-MS

GC-MS的测定参考FRATINI等[13]的方法,并做适当修改。HS-SPME处理后,取下微萃取头并快速插入GC注射器中,在250 ℃下分析3 min。采用HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分离挥发性化合物。样品在250 ℃下以1 mL/min的速率以99.99%纯氦为载气注入气相色谱。GC加热程序如下:柱子最初在50 ℃下加热2 min,然后以5 ℃/min的速度加热到180 ℃保持5 min,最后以10 ℃/min的速度加热到250 ℃保持5 min。

在传输线终温为250 ℃,离子源温度为230 ℃,电离电压为70 eV时,以电子冲击(EI)模式获得化合物的质谱。MS扫描在40～600 m/z范围内进行,溶剂延迟1.5 min。

1.3.5 挥发性化合物的定性和定量分析

使用MS数据库(NIST11、NIST11 s和FFNSC1.3)对挥发性化合物进行定性分析。结合保留指数、特征离子峰,保留匹配度>80%且碱峰一致的物质。采用差值法测定挥发性化合物的相对含量,采用峰面积归一化法定量。

1.3.6 关键风味化合物分析

采用相对气味活性值(relative odor activity value, ROAV)法评估单个挥发性化合物对样品整体风味的影响,确定样品中的关键风味化合物[14]。根据挥发性化合物的气味活性值(odor activity value, OAV)与最高气味活性值(OAVmax)的比值计算ROAV,范围为0～100。本研究将对样品总体风味贡献最大的组分的ROAV定义为100,记为ROAVmax,其他挥发性化合物的ROAV计算如公式(1)所示:

(1)

式中:Ci为待测化合物的相对含量,%;Ti为待测化合物感觉阈值,μg/kg;Cmax为对整体风味贡献最大的化合物相对含量,%;Tmax为对整体风味贡献最大的化合物感觉阈值,μg/kg。

所有组分均应满足ROAV≤100,且ROAV越大,说明该物质对样品总体风味的贡献程度越大。本研究认为ROAV≥1的物质为样品的关键风味化合物,0.1≤ROAV≤1的物质为样品的修饰风味化合物,ROAV<0.01的物质为样品的潜在风味化合物。

2 结果与分析

2.1 酶解前后牡蛎肉感官描述分析

感官评定人员对牡蛎肉的5种气味进行评分,结果如图1所示。对照组牡蛎肉呈现出较强的腥味、哈喇味和金属味。牡蛎以海洋中的藻类及浮游植物为食,能呈现出果香及青草香味,但牡蛎在生长过程中吸附水体中的腥味物质和金属离子,并在体内富集,故而具有腥味和金属味;在运输过程中,由于脂肪和大量水分的存在,牡蛎肉极易发生氧化反应,从而产生哈喇味[7]。

经过酶解,试验组的牡蛎肉酶解液果香味和青草味增强,腥味、哈喇味等明显降低。其中,第4组不添加外源淀粉酶的酶解液,腥味、哈喇味等略有降低,愉快风味表现得较为不明显,青草味数值仅为2;添加同样淀粉酶的第1组～第3组,脱腥效果明显,数值均降至3以下,但加入玉米淀粉的酶解液(第3组)虽然青草味增强,但腥味仍是最强烈的;添加木薯淀粉的组别,添加量大的第1组,腥味、金属味数值仅为1,果香味、青草味表现优越。研究表明,蛋白酶与淀粉酶复合反应酶解牡蛎,能够起到掩蔽苦味,降低腥味的作用[15];同时,淀粉酶能促使牡蛎中的糖原和外源淀粉转化为单糖,增加甜香味[16]。此外,酶解产生的小分子肽、氨基酸和蛋白质的氨基能与还原糖的羰基反应,生成具有独特风味的化合物,掩盖贝类原料本身的异味[16]。许庆陵等[17]比较了活性炭和美拉德反应对牡蛎蛋白酶解液的脱腥效果,其中加入3%(质量分数)葡萄糖作为美拉德反应还原糖,反应30 min后,酶解液具有最佳的脱腥效果;与此相比,本实验制备的牡蛎酶解液,充分利用牡蛎自身糖原,通过添加外源淀粉酶将糖原分解成小子单糖,并在一定条件下促使牡蛎肉蛋白酶解与美拉德反应同时发生,工艺更为简单,不仅达到脱腥效果,而且具有愉快风味。

为探究酶解前后牡蛎肉风味物质的变化,综合上述的感官评定结果,选择感官评价最优的第1组与对照组进行对比分析。

2.2 牡蛎肉及其酶解液挥发性化合物分析

采用HS-SPME与GC-MS技术对牡蛎中挥发性化合物进行分析,同时结合计算机谱库检索分析样品中挥发性化合物的组成及相对含量。经过GC-MS分析鉴定,从牡蛎肉中检测出58种挥发性化合物,酶解液中检测出66种挥发性化合物,酶解前后挥发性化合物总离子流图如图2和图3所示,各种挥发性化合物的相对含量如图4所示。

图4的分析结果显示,牡蛎肉中的挥发性化合物主要由4种酸类物质、20种醛类物质、12种醇类物质、10种酮类物质以及10种烃类物质等组成,其中,醛类、醇类和烃类物质的相对含量较高,占总量的91.26%,这些物质构成了牡蛎肉的主要风味。酶解后,酸类物质和醛类物质的含量大幅增加,分别增加了13.16%和9.16%,而醇类物质的含量降低了15.03%。除此之外,还新生成了呋喃类化合物。苏国万等[18]研究酶解前后牡蛎肉风味变化时也发现了类似的结果,使用质量分数为0.5%蛋白酶(胰蛋白酶与风味蛋白酶比例1∶3)酶解牡蛎肉,在酶解液中检测到了酸类、醛类、醇类、酯类、呋喃类等挥发性化合物,但醛类、烃类、酮类物质的含量较低,推测可能是复合酶解使用酶的种类和添加量不同造成的。

表2为酶解反应前后挥发性化合物相对含量的变化。结果显示,在牡蛎肉中,(E,Z)-2,6-壬二烯醛含量最高,达到33.5%,具有强烈的紫罗兰和黄瓜似香气;酶解反应后,含量仅为5.54%,下降了83.46%。此外,酶解液中呈现腥味、哈喇味、金属味的己醛、庚醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、壬醇等挥发性化合物含量明显降低,其中,己醛、3,5-辛二烯-2-酮甚至降至0,减弱了酶解液中的腥味。在腥味物质含量明显减少的同时,酶解后愉快物质的相对含量增加,如下表“↑”所示,含量增加的挥发性化合物有30种,其中,呈现蜡味物质1种,其余均为愉快风味。其中,苯甲醛具有樱桃香味,是食品工业中最常用的芳香类化合物。值得关注的是,酶解液新产生了2-戊基呋喃[19]、苯乙醛和十六醛等物质。呋喃类化合物及其衍生物对肉香的形成有较大的贡献,酶解后新生成的2-戊基呋喃呈现土豆和蔬菜香气,可能是酶解过程中美拉德反应的产物[18];苯乙醛是苯丙氨酸的Strecker降解产物,使酶解液具有蜂蜜、玫瑰和巧克力香味;十六醛具有花香味,在酶解液中占比33%,促使酶解液中花香增加,掩盖了牡蛎肉中的腥味。除此之外,酶解液中3-壬烯-2-酮、2-十一酮、2-己基环戊酮和二苯甲酮的相对含量增加,其中2-十一酮的含量较高,占比2.07%,使酶解液具有一定的蜡香、果香和脂肪香。有研究表明,醛酮类物质协同作用,使贝类物质形成独特风味[20]。

苏国万等[18]使用质量分数为0.5%蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶比例为1∶3)制备的牡蛎肉酶解液具有较重的腥味和哈喇味,其中,呈现腥味的己醛、庚醛、2,3-辛二酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛和壬醛等物质含量明显增加,最为显著的是庚醛和壬醛分别增加了0.68%和1.85%。刘琳琳等[7]也观察到类似的现象,牡蛎经过复合蛋白酶酶解后气味变差,呈现不愉快腥味的己醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛等化合物含量增加,(E)-2-辛烯醛增量最大,增加了62.5%,短链的饱和脂肪醛大多具有刺鼻气味,消费者难以接受。与其相比,本研究针对牡蛎自身富含糖原的情况,添加淀粉酶分解糖原,同时外加木薯淀粉,增加酶解液中还原糖的含量,促进美拉德反应的发生,生成具有低气味阈值的醛和酮,赋予酶解液花果香,掩盖了腥味,有效改善了酶解液的风味。然而,并非所有挥发性化合物都对酶解液的整体香气有贡献,为了探究对整体香气有影响的挥发性化合物,需要对牡蛎肉及其酶解液进行关键香气成分分析。

2.3 牡蛎肉酶解前后关键风味化合物分析

表3为牡蛎肉酶解前后差异香气成分的ROAV,ROAV是挥发性化合物浓度与其香味阈值的比值,诠释了各类挥发性化合物对样品香气的贡献程度,ROAV越大,说明该物质对样品总体风味的贡献程度越大。

表3结果显示,牡蛎肉中存在9种关键风味化合物,具有强烈的紫罗兰和黄瓜似香气的(E,Z)-2,6-壬二烯醛对风味贡献最大,酶解后其ROAV明显下降,仅为38.48。1-辛烯-3-醇为不饱和长链醇,牡蛎肉中的腥味来源之一,是花生四烯酸氧化产生的,经过酶解后ROAV下降41.59%,脱腥效果明显;酶解液具有10种关键风味化合物,其中贡献最大的挥发性化合物为(E,E)-2,4-癸二烯醛,具有强烈鸡香和鸡油味。此外,酶解液增加了3种具有愉快风味的关键化合物,包括癸醛、十二醛、2-十一酮,具有生青菜或柠檬酸气味的辛醛ROAV也提高到23.81,使酶解液更具宜人的气味,从而提高品质。醛类物质和酮类物质在酶解前后的变化表明,美拉德反应改善了酶解液的整体风味,酶解液在具有鸡香和鸡油味的同时,还表现出一定的青菜味和花果香,具有层次感。

整体而言,酶解反应改变了牡蛎肉中的关键风味化合物的组成及贡献值,愉快风味的关键风味化合物显著增加。这些关键风味化合物大部分为醛类化合物,研究表明,醛类化合物主要是通过多不饱和脂肪酸氧化降解,阈值较低,微量存在时即可影响总体风味[21]。在酶解过程中,一些醛类物质含量减少,推测可能是酶解过程中不饱和脂肪酸氧化受到抑制,减少具有明显腥味的醛、烯醛的产生,从而降低腥味[22],达到改善酶解液风味的效果。此外,本研究利用淀粉酶酶解牡蛎自身富含的糖原和外源木薯淀粉,产生小分子单糖,并在一定温度下促使美拉德反应发生,生成具有花香、甜脂香特征的醛类、酮类等挥发性化合物,对鱼腥味等不良气味起到掩蔽作用,改善了牡蛎肉酶解液的整体气味[23];此外,牡蛎氨基酸成分中赖氨酸和精氨酸含量丰富,本实验采用胰蛋白酶和碱性蛋白酶双酶解,胰蛋白酶能高效作用于羧基端的肽键,酶解效率高[24],促使蛋白质水解产生牡蛎多肽,其与还原糖反应,形成了吡咯、吡嗪、呋喃类等杂环化合物,丰富酶解液的香气和滋味。已有的研究[6-7]主要采用复合动物蛋白酶、菠萝蛋白酶等制备的牡蛎肉酶解液腥味与哈喇味增强、青草味减少,呈现腥味的(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-辛烯醛、戊醛等挥发性化合物贡献较大,整体风味更差。

另一方面,如修饰风味化合物中“↑”所示,ROAV增加的风味化合物有10种,均呈现愉快风味;而己醛、6-甲基-2-庚酮、壬醇等具有腥味的物质ROAV降低,转变为潜在风味化合物,对酶解液造成的腥味可忽略。袁林等[25]也得到了类似的结果,将牡蛎肉酶解产物冻干,加入还原糖(木糖-葡萄糖,质量比1∶1)在pH 6.97、反应温度114.62 ℃条件下反应29.43 min,美拉德反应产物中生成了二甲基三硫醚、二甲基二硫醚等挥发性化合物,它们共同作用,赋予样品贝香味、肉香味和海鲜味,同时产生了一些吡嗪类物质,赋予了坚果-肉香味,改善了牡蛎的风味。

3 结论

本研究利用感官评价和HS-SPME-GC-MS法分析牡蛎肉酶解前后挥发性化合物的变化,感官评价结果表明,牡蛎肉主要呈现鱼腥味、哈喇味和金属味;采用不同酶解方案对牡蛎肉的腥味进行脱除试验,发现采用蛋白酶与淀粉酶复合反应的组别(碱性蛋白酶1%、胰蛋白酶0.5%、淀粉酶0.5%、木薯淀粉1%,质量分数)风味最佳。通过HS-SPME-GC-MS从牡蛎肉和酶解液中分别检测出59种和66种包括酸类、醛类、醇类、酮类等挥发性化合物,酶解后酸类物质和醛类物质含量增加,生成了呋喃类化合物,新增加的醛类和呋喃类化合物多为具有愉快风味的化合物。酶解后,呈现腥味、哈喇味、金属味的已醛、庚醛、(E,E)-2.4庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、壬醇等挥发性化合物含量明显降低,其中,已醛、3,5-辛二烯-2-酮甚至降至0,减弱了酶解液中的腥味。酶解液中产生了呈现土豆和蔬菜香气的2-戊基呋喃和风信子香气的苯乙醛及花香味的十六醛等物质也起到调节香气、掩盖腥味的作用。

结合ROAV进行评价,酶解液中呈现腥味、哈喇味的1-辛烯-3-醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛等挥发性化合物的ROAV降低,呈现果香、脂蜡香的癸醛、十二醛和2-十一酮等挥发性化合物在酶解液中对风味的贡献度增大,表明酶解后风味更好,与感官评价结果一致。本研究对酶解前后牡蛎肉中关键风味化合物及主要腥味成分进行分析,确定了酶解液中特征香气成分,为后续的风味评价提供了一定的理论依据;制备的牡蛎酶解液不仅能有效脱除腥味,而且增加了鲜味、挥发性香气和整体接受度,为工业制备高品质蚝油提供理论和方法指导。

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Study on flavor changes of oyster meat before and after enzymatic hydrolysis

HONG Linxin1, TONG Xing2, SUN Lechang1,3, WU Changzheng4, YIN Kaiping1,LIU Kang1,3, LIN Duanquan1,3, ZHANG Lingjing1,3*

1(College of Ocean Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

2(Foshan Haitian Flavoring &Food Co.Ltd., Foshan 528000, China)

3(National &Local Joint Engineering Research Center of Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China)

4(Guangdong Haitian Innovation Technology Co.Ltd., Foshan 528000, China)

ABSTRACT This study focused on the preparation and flavor properties of oyster meat hydrolysate through a composite enzymatic process involving protease and amylase, with oysters as the subject of investigation.Sensory evaluation and head-space solid-phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometer (HS-SPME-GC-MS) were employed to analyze the changes of volatile compounds in oyster meat before and after enzymatic hydrolysis.The objective was to identify the key flavor compounds and main fishy components in both oyster meat and its enzymatic hydrolysate.Furthermore, the relative odor activity value (ROAV) was utilized to quantify the contribution of each component to the flavor of oyster meat enzymatic hydrolysate.The addition of amylase could break down glycogen present in oyster meat into small molecule monosaccharides which subsequently promoted Maillard reactions within the enzymatic hydrolysate at specific temperatures.As a result, compounds with pleasant flavors were generated to mask the fishy taste associated with oysters.The findings revealed a decrease in substances such as (E, E) -2,4-heptadienal, hexanal, heptaldehyde, and nonanal, which exhibited a fishy and hala taste after enzymatic hydrolysis.Moreover, this process also resulted in the formation of substances with strong fruit and grass flavors, such as 2-pentylfuran, benzaldehyde, and hexadecaldehyde, which could also eliminate the fishy taste present in oyster meat.Finally, through synergistic interactions among various volatile compounds involved, an overall coordinated aroma profile was achieved resulting in a long-lasting flavor experience.

Key words oyster; enzymatic hydrolysis; flavor; volatile compounds; relative odor activity value

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037826

引用格式：洪林欣,童星,孙乐常,等.酶解前后牡蛎肉风味变化研究[J].食品与发酵工业,2024,50(20):120-128.HONG Linxin,TONG Xing,SUN Lechang, et al.Study on flavor changes of oyster meat before and after enzymatic hydrolysis[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(20):120-128.

第一作者：硕士研究生(张凌晶实验师为通信作者,E-mail:imzlj@jmu.edu.cn)

基金项目：福建省科技计划农业引导性项目(2023 N0014);广东省调味食品生物发酵先进技术企业重点实验室开放基金项目(2017B030302002);农业农村部现代农业产业技术体系项目(CARS-49)

收稿日期：2023-11-01,改回日期:2023-12-19