随着全球人口老龄化加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发病率在逐年升高[1]。轻度认知障碍(mild cognitive impairment, MCI)是介于认知正常和AD痴呆的中间阶段,主要表现为明显的记忆功能损伤,和其他认知功能如注意力、语言、视觉空间功能或执行功能损伤[2]。流行病学调查指出80%的认知障碍患者会在6年内发展为AD[3]。临床上,多奈哌齐、加兰他敏等胆碱酯酶抑制剂药物常被用作治疗轻中度AD的一线药物,用于改善认知功能、延缓AD源性MCI向AD的进展[4],但是它们的长期疗效和安全性尚不明确。因此,从日常饮食或者膳食模式方面探寻预防或改善AD高危老年人认知功能的干预方式可能是延缓AD发生更为有效的策略。
核桃自古以来就是我国传统药食两用的佳品,根据《中国食物成分表》数据显示,每100 g核桃(干)可食部含有58.8 g脂肪,43.2 mg维生素E,其中多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的76.2%,主要为亚油酸(C18:2,64.0%)和亚麻酸(C18:3,12.2%)。核桃油是从核桃仁中提取的植物油产品,具有n-3多不饱和脂肪酸含量丰富的营养和健康优势。研究发现,经常补充富含n-3多不饱和脂肪酸的食物可以通过减轻神经元细胞的炎症和稳定记忆相关突触标记物(NMDA、AMPA和mGlu)而起到改善认知的效果[5]。LIAO等[6]研究也表明核桃油可以减轻大鼠脑组织的氧化应激损伤并降低乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)活性,但是尚未见核桃油通过增强突触可塑性相关通路蛋白来改善记忆的相关报道。
本研究旨在评价核桃油对东莨菪碱致认知障碍实验动物的干预效果,并通过测定脑组织乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)水平、AChE活性等胆碱能指标,和突触素(synaptophysin, SYN)、突触后致密蛋白-95(postsynaptic density-95, PSD-95)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、原肌球蛋白相关激酶B(tropomyosin-related kinase B, TrkB)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)等反映突触可塑性相关蛋白的水平,探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃油(河北桃木疙瘩农业科技股份有限公司,生产许可证号:SC10213012900025),购自超市。产品配料:核桃;工艺:压榨;营养成分表(每100 g):能量(3 698 kJ)、蛋白质(0 g)、脂肪(99.9 g)、碳水化合物(0 g)、钠(0 mg)。
东莨菪碱氢溴酸盐(纯度≥99%),上海麦克林生化科技股份有限公司;ACh酶联免疫测定试剂盒,上海威奥生物科技公司;AChE试剂盒,南京建成生物工程研究所;苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染液、组织固定液,武汉赛维尔生物有限公司;二甲苯(纯度≥99%)、无水乙醇(纯度≥99%),国药集团化学试剂有限公司;甲醇,天津市科密欧化学试剂公司;兔抗大鼠PSD-95、兔抗大鼠SYN,武汉赛维尔生物有限公司;兔抗大鼠TrkB、兔抗大鼠CREB,武汉三鹰生物有限公司;兔抗大鼠BDNF,杭州华安生物有限公司。
1.2 仪器与设备
SpectraMaxM2多功能酶标仪,美国美谷分子仪器有限公司;5810R低温离心机,德国Eppendorf公司;SpectraMaxM2隔水式培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;Vortex-2 Genie涡旋混合器,美国Scientific Industries公司;Tanon 5200系列全自动化学发光仪,中国上海天能生命科学有限公司;SCIENT-48高通量组织研磨器,中国宁波新芝生物有限公司;JB-P5包埋机,武汉俊杰电子有限公司;RM2016病理切片机,上海徕卡仪器有限公司;Eclipse E100正置光学显微镜,日本尼康有限公司;Morris水迷宫,北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物
24只6周龄雄性(sprague-dawley, SD)大鼠(200±20) g,购自于北京斯贝福生物技术有限公司,实验动物许可证号为SCXK(京)2019-0010。饲养于河北医科大学实验动物公共服务平台(SPF级别屏障环境),饲养期间所有大鼠均12 h明暗循环光照,自由饮水进食。饲养环境温度为22～25 ℃,相对湿度为40%～60%。本实验通过河北医科大学伦理动物实验委员会(IACUC-Hebmu-2023022)批准,所有操作均按照相关动物管理规章[SYXK(冀)-020∶002]进行。
1.3.2 分组与干预
将24只大鼠适应性喂养7 d后,以随机数字表法分为空白对照组(Control)、模型对照组(Scopolamine)、核桃油干预组(Scopolamine+WO),每组8只。其中核桃油干预组以每天2.25 g/kg的剂量进行灌胃,持续30 d。灌胃剂量依据《中国居民膳食指南(2022)》推荐成年人每天烹调油25～30 g,以大鼠与人体表面积等效比按70 kg体重换算,等效剂量比值为6.3计算得到。空白对照组和模型对照组给予相同体积的生理盐水。于第31天停止灌胃,每组随机选取6只实验动物,模型对照组和核桃油组给予腹腔注射3 mg/(kg·d)东莨菪碱,空白对照组腹腔注射相同体积0.9%生理盐水,30 min后分别相继进行新物体识别实验和Morris水迷宫实验进行认知行为学检测,持续5 d。第36天,经1%(10 g/L)戊巴比妥钠溶液麻醉后,断头处死,在冰上剥离脑组织,分离海马体,用于病理学检查、生化指标测定,以及相关蛋白水平的评价。
1.3.3 新物体识别实验
新物体识别实验参考杜艳芳等[7]的方法并进行了适当修改,共包括2个阶段,第一阶段(熟悉期)在100 cm×100 cm的开放旷场区域中放置2个完全相同的物体A1、A2,将大鼠放入旷场中自由探索5 min,探索定义为大鼠面朝物体鼻子与该物体的距离≤2 cm。第二阶段(测试期间),间隔5 h后将A2更换为B,再将大鼠放入旷场中探索5 min,采用动物运动轨迹跟踪系统记录分析2个阶段分别探索2个物体的时间,其中探索A1的时间记为F,探索A2或B的时间记为N。大鼠对A1和B的分辨指数DR的计算方法如公式(1)所示。
(1)
1.3.4 Morris水迷宫实验
水迷宫实验包括空间探索实验和定位航行实验[8]。训练期间在水池西北象限的水面下1 cm处放置并固定一个平台,轻抚大鼠后,将其面朝池壁放入,若在90 s内成功找到平台,则让其在平台上并停留15 s,若大鼠90 s内无法找到平台,则用木勺引导大鼠上台停留15 s,并按90 s记录潜伏期。每只大鼠每天训练4次,连续训练4 d。于第5天撤去平台,选择原平台所在象限对侧象限中心位置面向池壁放入大鼠,摄像设备记录每只大鼠的逃避潜伏期、以及2 min内穿越平台的次数和在目标象限停留时间的比值评估大鼠的学习记忆能力。
1.3.5 HE染色观察脑组织病理学改变
大鼠脑组织用4%(40 g/L)多聚甲醛固定后,石蜡包埋,二甲苯脱蜡后用75%(体积分数)乙醇溶液浸泡5 min,在超纯水中浸泡3 min,采用苏木素、伊红进行染色,染色3 min后在梯度乙醇下脱水。二甲苯透明,中性树脂封片。在光学显微镜下观察大鼠海马组织结构。
1.3.6 ELISA和试剂盒测定脑组织中ACh含量和AChE活性
根据说明书测定大鼠脑组织中ACh的含量和AChE的活性。
1.3.7 Western Blot检测海马组织中SYN、PSD-95、TrkB、CREB、BDNF蛋白的表达水平
将蛋白酶抑制剂以1∶100的体积比加入到放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)组织裂解缓冲液中,在高通量组织研磨仪中裂解海马组织。制备好的组织匀浆在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min,取上清液经BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白与上样缓冲液混合,100 ℃变性5 min,置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移到聚偏二氟乙烯膜上,在无蛋白封闭液中封闭10 min。3次洗膜后于4 ℃下孵育一抗过夜,其中抗体体积浓度分别为SYN(1∶2 000)、PSD-95(1∶2 000)、BDNF(1∶500)、TrkB(1∶1 000)、CREB(1∶1 000)、山羊抗兔IgG(1∶20 000),TBST洗膜3次,37 ℃恒温箱中孵育二抗1 h后发光,以β-actin为内参蛋白,采用Image J软件对目的蛋白条带和内参条带进行灰度分析,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值进行统计学分析。
1.4 数据处理
数据采用SPSS 23.0软件系统分析,数据以均数±标准差来表示。多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义,结果用GraphPad Prism 8作图表示。
2 结果与分析
2.1 核桃油改善东莨菪碱致认知障碍大鼠学习和记忆能力
图1为新物体识别实验示意图,研究结果如图2所示。在熟悉期阶段各组大鼠对两物体探索时间和探索总时间均没有明显的差别(图2-A和图2-B)。但是,将A2替换为新物体B后,模型对照组大鼠的辨别指数较空白对照组显著下降(P<0.05);与模型对照组比较,核桃油干预组能显著提高东莨菪碱致认知障碍大鼠的辨别指数(P<0.05)(图2-C)。
图1 新物体识别实验示意图
Fig.1 Schematic diagram of the new object recognition experiment
A-左右位置偏好结果;B-探索总时间;C-辨别指数
图2 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠新物体识别实验中左右位置偏好、探索总时间、辨别指数的影响(n=6)
Fig.2 Effect of walnut oil on left-right position preference, total exploration time, and discrimination index in new object recognition experiments in rats with scopolamine induced cognitive deficits (n=6)
注:与空白对照组相比,*P<0.05;与模型对照组相比,#P<0.05(下同)。
Morris水迷宫训练期间典型运动轨迹(图3)显示,训练第1天各组大鼠均呈现边缘式、漫无目的运动路线,其中模型对照组大鼠未能找到平台;训练至第4天,与空白对照组相比,模型对照组仍需要更长的时间才能寻找到隐蔽的平台,运动路线也明显增多,核桃油组则表现出游至平台更短的路程。由表1可知,第1天各组大鼠的逃避潜伏期没有明显差异;从第2天开始,与空白对照组相比,模型对照组的潜伏期显著增加(P<0.05);训练到第4天,与模型对照组相比,核桃油组的逃避潜伏期显著降低了(P<0.05)。
表1 各组大鼠的逃避潜伏期
Table 1 Avoidance latency in each group of rats
组别逃避潜伏期/s第1天第2天第3天第4天空白对照组87.88±12.5116.05±3.7415.52±11.5315.09±10.66模型对照组88.67±1.6664.93±8.26∗42.37±8.74∗36.94±13.50∗核桃油组82.30±18.8655.95±2.46∗38.60±17.12∗23.21±5.99#
注：与空白对照组相比,*P<0.05;与模型对照组相比,#P<0.05(下同)。
图3 各组大鼠不同训练时间水迷宫实验典型运动轨迹
Fig.3 Typical trajectory of Morris water maze test in each group in different training time
第5天撤去平台后,与空白对照组相比,模型对照组大鼠在120 s内穿越平台的次数显著减少(P<0.05),在平台对应象限停留时间的比值也显著下降(P<0.05)。与模型对照组相比,核桃油组穿越平台的次数和在目标象限中停留时间的比值均显著增加(P<0.05)(图4)。
A-穿越平台次数;B-目标象限停留时间比值
图4 各组大鼠水迷宫实验穿越平台次数和在目标象限停留时间比值(n=6)
Fig.4 The number of platform crossings and the percentage of the time spent in SW quadrant of the maze in each group of rats(n=6)
A-空白对照组;B-模型对照组;C-核桃油组
图5 核桃油对大鼠海马体CA3区神经元细胞的影响(200×)
Fig.5 Effect of walnut oil on neuronal cells in the CA3 region of rat hippocampus(200×)
2.2 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠海马组织神经元形态的影响
各组大鼠海马体CA3区神经元细胞的HE染色结果如图5所示。空白对照组海马神经元细胞形态规则,排列整齐,核仁明显,模型对照组则表现为细胞排列分散凌乱,细胞核固缩,细胞间排列不连续。与模型对照组相比,核桃油组神经元细胞结构较完整,形态较清晰,排列较为规整,锥体细胞固缩有一定的缓解。
2.3 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠脑组织ACh含量和AChE活性的影响
如图6所示,与空白对照组相比,东莨菪碱处理后可以引起大鼠脑组织ACh水平显著降低(P<0.01)和AChE活性显著增高(P<0.05)。与模型对照组相比,核桃油组的ACh含量明显增加,AChE活性明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。
A-脑组织ACh含量;B-脑组织AChE活性
图6 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠脑组织ACh含量和AChE活性影响(n=6)
Fig.6 Effect of walnut oil on ACh content and AChE activity in brain tissue of rats with cognitive impairment caused by scopolamine(n=6)
2.4 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠海马组织SYN和PSD95蛋白表达水平的影响
各组大鼠海马组织SYN和PSD-95的蛋白表达水平结果见图7。与空白对照组比较,模型对照组大鼠海马组织SYN(P<0.01)和PSD-95(P<0.05)蛋白表达均显著降低;而给予核桃油干预后,大鼠海马组织SYN和PSD-95蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。
A-蛋白免疫印迹图;B-PSD-95表达水平;C-SYN表达水平
图7 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠海马体PSD-95和SYN蛋白表达的影响(n=3)
Fig.7 Effect of walnut oil on PSD-95 and SYN protein expression in the hippocampus of scopolamine-induced cognitively impaired rats(n=3)
A-蛋白免疫印迹图;B-BDNF表达水平;C-CREB表达水平;D-TrkB表达水平
图8 核桃油对东莨菪碱致认知障碍大鼠海马体BDNF、TrkB和CREB蛋白表达的影响(n=3)
Fig.8 Effect of walnut oil on the expression of BDNF, TrkB, and CREB proteins in the hippocampus of scopolamine-induced cognitively impaired rats(n=3)
2.5 核桃油对东莨菪碱致大鼠海马组织BDNF、TrkB、和CREB蛋白表达水平的影响
如图8所示,东莨菪碱处理的大鼠海马组织BDNF、TrkB和CREB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。核桃油干预后,这3个蛋白的表达水平较模型对照组均显著升高(P<0.05)。
3 结论
现代研究发现认知功能障碍可能与胆碱能信号传递异常有关[9-11],东莨菪碱是一种抗胆碱能药物,能够诱发中枢神经系统中的胆碱能神经通路及记忆环路的功能紊乱,从而导致学习记忆的严重损伤,因此常被应用于诱导记忆障碍动物模型[12]。本实验结果显示东莨菪碱可以诱导大鼠出现学习记忆能力显著下降,脑组织神经元细胞排列紊乱、甚至凋亡,这与葛麒等[13]研究结果相一致。此外和陈阳等[14]的研究结果也相似,东莨菪碱干预后,小鼠脑组织表现出AChE活性增强和ACh含量降低。
新物体识别实验和Morris水迷宫实验是用于反映啮齿动物短期和长期空间学习和记忆最广泛使用的行为学评价方法。本研究发现,给予核桃油干预后,显著提升了认知障碍大鼠的辨别指数,缩短了其在水迷宫实验中的逃避潜伏期,并增加了穿越平台次数和在目标象限停留的时间,这可能与核桃油有效地抑制了东莨菪碱所致大鼠脑组织AChE活性,提高了ACh的含量有关,提示核桃油具有增强胆碱能系统活性、改善认知功能的可能性。
突触可塑性是导致AD患者学习记忆能力减退的重要发病基础[15],被认为是学习与记忆的细胞分子学基础[16],SYN是一种位于突触前膜囊泡上的特异性蛋白质,其表达与突触重塑、再生等功能相关[17]。PSD是突触后膜内侧胞质面一层均质的致密物质,其中PSD-95是兴奋性PSD的主要蛋白成分,在突触的功能和可塑性中也发挥着重要的生理功能[18]。大量的研究发现SYN和PSD-95的表达降低对于神经元生长和突触功能的稳定性会造成一定的损伤[19]。XIE等[20]的研究也发现东莨菪碱诱导小鼠脑组织中SYN和PSD-95蛋白表达水平会呈现下降趋势,本实验研究结果与其一致。给予核桃油干预后,SYN和PSD-95蛋白表达水平显著的增高,提示核桃油可能通过增强突触可塑性改善学习记忆和认知障碍。
BDNF是一种神经营养素家族分泌的蛋白质,可以促进神经元的生长,改善突触可塑性和认知功能。TrkB作为神经营养蛋白酪蛋白激酶受体家族的成员,是BDNF的特异性受体。研究表明BDNF/TrkB信号通路与AD发生发展密切相关[21]。AD患者额叶皮质和海马体中BDNF和TrkB的表达会下降[22],而东莨菪碱也能够诱导实验动物BDNF和TrkB蛋白表达水平的降低[23]。CREB是一种选择特异性结合cAMP反应元件的核蛋白。当BDNF和TrkB结合时,激活CREB,CREB磷酸化可以上调BDNF的表达,同时BDNF和TrkB的结合也能够激活相关的细胞内信号通路,增加海马神经元突触活性,改善空间学习和记忆[24-25]。有研究发现东莨菪碱可以诱导小鼠脑组织中P-CREB和BDNF蛋白水平降低[26],本研究结果也显示模型对照组海马组织BDNF、TrkB、CREB蛋白水平较空白对照组均显著降低。核桃油中丰富的亚麻酸进入人体会代谢为DHA,DHA是神经元质膜的重要组成部分,参与功能性突触的形成,保证了脑发育和功能的完整。ORMISTON等[27]研究发现给予小鼠n-3多不饱和脂肪酸干预,脑组织中的BDNF水平会显著增高,此外,若孕期大鼠n-3多不饱和脂肪酸缺乏会导致子代大脑区域中BDNF、TrkB和CREB的表达降低[28],提示n-3多不饱和脂肪酸在脑发育和脑保护方面起着重要的作用。本研究也表明,富含n-3多不饱和脂肪酸的核桃油[29-30]能够增强调节突触可塑性相关蛋白BDNF、TrkB和CREB的表达,这可能是核桃油改善东莨菪碱致认知障碍大鼠学习记忆认知能力的原因之一。
综上所述,核桃油可以改善东莨菪碱诱导的大鼠认知功能障碍,其机制可能与降低AChE活性和提高ACh水平,激活BDNF/TrkB/CREB信号通路,上调SYN和PSD-95蛋白表达有关。但是其他作用机制以及量效关系也有待于进一步研究。
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