不同红曲酿造白酒中挥发性风味物质的代谢差异

红曲,又名“红曲米”,是一种传统的发酵产品[1],由红曲霉接种到蒸熟的大米中自然发酵而成,红曲中含有许多由红曲霉菌产生的有益代谢物如降血脂的莫纳克林K和γ-氨基丁酸等[2],常作为着色剂、保健品及红曲酒的发酵剂[3]。红曲在东南亚和欧洲被广泛使用,但中国是红曲的发源地和最大生产国[4]。与其他传统发酵食品相似,红曲通常在开放式的自然环境中发酵制成,这就导致了不同地区发酵剂质量不尽相同,红曲酒酿制过程和质量的不可控制性。红曲常用作黄酒的发酵剂,因其丰富的功能性,在白酒酿造中的应用也逐渐增多。

本实验将不同地区的红曲与商业白酒曲进行复配作为白酒酿造的发酵剂,对酿造酒中的47种挥发性风味成分进行定性定量分析,进一步运用统计学方法比较不同种类和含量的红曲酿造白酒挥发性风味成分的代谢差异。希望本研究可为红曲在蒸馏酒中的应用提供一定的数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

异戊醇、正丁醇、异丁醇、正丙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙醛、2-甲基丙醛、丙酮、甲酸乙酯、乙缩醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙酸乙酯、乙酸丙酯、2-戊酮、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙醇、戊酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、乙酸己酯、乙偶姻、己酸丙酯、2-庚醇、正己醇、己酸丁酯、三甲基吡嗪、庚醇、己酸异戊酯、辛酸乙酯、四甲基吡嗪、糠醛、2-乙酰基呋喃、苯甲醛、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、2-乙酰基-5-甲基呋喃、糠醇、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、苯甲醇、苯丙酸乙酯、苯乙醇、对甲酚标品,美国Sigma-Aldrich公司。

红曲,我国具有代表性的不同产区;红曲L、G、J,浙江丽水、福建古田、湖北武汉的农家自制曲;安琪白酒曲、安琪麸曲、金香霸,安琪酵母股份有限公司。

五粮粉取自宜宾某酒厂的曲粉车间。

1.2 仪器与设备

GC7890B-5977B MSD GC-MS联用仪、DB-WAX UI色谱柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm),美国Agilent公司;MPS2多功能自动进样系统,德国Gerstel公司;DMA 35手持式酒精计,安东帕(上海)商贸有限公司。

1.3 实验方法

酿酒工艺条件参照李茂等[5]对苦荞酒酒曲的筛选优化及其智能化酿造的分析研究并作适当修改。以高粱、大米、玉米、糯米和小麦为原料(质量比为18∶11∶4∶9∶8),称取1.5 kg按比例混合的五粮粉于蒸锅中,添加3.0 L水浸泡1.5 h,将浸泡的五粮粉蒸煮糊化1.5 h。五粮粉蒸煮后,摊凉至35 ℃以下,加入混合曲进行糖化,得糖化醅。各酒曲的添加量参考商家建议添加量,不同种类酒曲及添加量如表1所示。糖化醅于30 ℃糖化24 h,加入3 L无菌水,于28 ℃下发酵8 d,发酵结束将醪液蒸馏得白酒样品。

1.3.2 风味物质定性定量分析

标准溶液的配制及定性定量方法参考文献[6]。标准溶液的配制,在20 ℃条件下,量取52 mL乙醇并用蒸馏水定容至100 mL,混匀;准确称取各标准品47种于10 mL容量瓶中,用52%vol乙醇溶液定容,配制成5 g/L的单标溶液于4 ℃条件下贮存备用。

色谱条件参考文献[7]。色谱条件:DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm),载气为氦气,进样口温度230 ℃;程序升温为初始温度40 ℃,保持1 min,7 ℃/min升到180 ℃,保持3 min;10 ℃/min升到230 ℃,保持1 min;载气流速1 mL/min;质谱条件:电离电压70 eV,离子源温度230 ℃,质谱扫描范围20～500 amu。

1.3.3 差异物质的筛选

气味活性值(odor active value,OAV)分析:OAV可用于判断挥发性风味成分对酒样香气的贡献程度,阈值参考文献[8～10]。样品间的挥发性风味成分的差异采用主成分分析(principal components analysis,PCA),与挥发性风味成分相关的重要性指标分析采用O2PLS(bidirectional orthogonal partial least squares)模型。

1.4 数据处理

每个样品设置3个平行,采用Origin绘图,SPSS进行主要酯类、醇类物质显著性分析(P<0.05),用Simca软件进行挥发性风味成分与酶活的模型构建。

标准溶液的配制、色谱条件及定性方法参考文献[6],定量方法参考文献[7]。

2 结果与分析

2.1 不同种类红曲酿制酒理化指标分析

对不同种类和不同含量的酒曲酿制酒的酒精度进行检测,其结果如图1所示。7个酒样的酒精度为51.4%vol～52.7%vol,其中G1酒样酒精度最低为51.4%vol,CK酒精度最高为52.7%vol。酒精度之间无明显差异。

2.2 不同种类的红曲酿制酒挥发性风味物质差异分析

2.2.1 红曲种类及添加量对酒样中高级醇含量的影响

醇类物质是酒体的基本组成成分,正丙醇、异丙醇、异丁醇和异戊醇等是白酒中常见的高级醇,适量的高级醇有利于酒体口感协调[11]。但高级醇含量过高会造成酒体味道苦涩,饮后易上头,对人的身体健康造成一定程度的损伤[12]。高级醇在酿酒中的产生途径主要来源于微生物的代谢,包括氨基酸分解代谢的Enrlich和糖代谢的Harris两条代谢途径[13]。

不同种类红曲和不同红曲含量的添加所酿白酒中高级醇含量如图2所示。正丙醇含量为(149.47±8.10)～(246.40±3.46) mg/L,其中G2、J1和J2中的正丙醇含量高于对照组CK,L1、L2、G2的含量相较于对照组分别降低了17.2%、8.3%、1.2%。正丁醇的含量为(4.07±0.15)～(7.7±0.17) mg/L,G1与CK之间无显著差异,其余样品与对照组的正丁醇含量有显著差异,但均表现为实验组正丁醇含量低于对照组。异丁醇的含量为(366.47±5.22)～(533.93±14.50) mg/L,添加红曲的样品其含量均低于对照组,异丁醇含量降低幅度为9.21%～31.36%。异戊醇的含量为(828.97±47.06)～(1 369.10±28.30) mg/L,添加红曲L和J样品中异戊醇的含量明显低于对照组,添加红曲G的酒样中异戊醇含量上升幅度为2.3%～4.4%。对于总高级醇含量,红曲L以及高含量红曲J的添加有明显的降低效果(25.9%～29.5%),其余红曲的添加对总高级醇含量的降低无显著效果。酒样中各醇类平均含量由高到低依次为异戊醇、异丁醇、正丙醇和正丁醇。红曲的添加对高级醇中异戊醇和异丁醇的降低效果更为显著。

总体来说,红曲L的添加有助于降低酒样中正丙醇的含量;红曲J的添加对正丁醇含量的降低无明显效果;红曲G的添加对正丙醇含量的影响还受红曲添加量的影响。红曲L、G、J的添加可有效降低酒样中异丁醇的含量,红曲L和和J的添加有助于降低酒样中异戊醇的含量,红曲G的添加对异戊醇的降低无明显效果。目前,有研究人员通过敲除酿酒酵母中参与醇类合成的重点基因BAT2而达到降低杂醇油的效果,本研究的方法可进一步为杂醇油的降低提供思路[14-15]。

2.2.2 红曲种类及添加量对酒样中主要酯类物质含量的影响

酯类化合物是酒中重要的呈香物质,酒中的酯类种类较多如乙酸异戊酯、甲酸丙酯、乙酸异丁酯、丙酸丙酯等。其中,乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯备受关注[16]。乳酸乙酯主要呈现甜香、水果香、青草香,乙酸乙酯主要呈现菠萝香、苹果等水果香,丁酸乙酯呈现菠萝香、苹果香等水果香以及花香,己酸乙酯带有甜香、窖香、青瓜香等[17]。酯类物质不仅对酒体的呈香风格有突出贡献,酯类物质在白酒的饮用中可以舒缓人体降低脑组织对高级醇的吸收[18]。

红曲种类及含量对酒样中主要酯类物质含量的影响如图3所示。酒样中共检测到酯类物质19种,其中含量较高的酯类物质包括乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、甲酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯和2-甲基丙酸乙酯。乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯检测到的含量分别为(1.2±0.1)～(9.3±0.2)、(303.66±18.77)～(514.05±4.92)、(0.56±0.02)～(0.99±0.01)、(1.73±0.06)～(4.83±0.35) mg/L。不同样品之间酯类物质含量均有显著差异,红曲J和高含量的红曲L、G的添加对乳酸乙酯的提升效果明显,J1、J2、L2、G2相比于对照组CK的乳酸乙酯含量分别提高了3.0、6.6、5.8、1.8 mg/L,提升幅度分别为111.1%、244.4%、214.8%、68.5%。红曲L、J以及高含量的G对乙酸乙酯含量提升效果明显,L1、L2、G2、J1、J2相比于对照组CK的乙酸乙酯含量分别提高了89.67、173.34、17.00、84.67、105.00 mg/L,提升幅度分别为26.32%、50.89%、4.99%、24.85%、30.82%。红曲L、G和高含量红曲J的添加对己酸乙酯含量的提升效果显著,L1、L2、G1、G2和J2相比于对照组CK的己酸乙酯含量分别提高了2.86、0.80、2.20、2.10、0.46 mg/L,提升幅度分别为145.17%、40.10%、111.67%、106.59%、23.35%。对于酒样中主要酯类物质其总含量为310.18～525.83 mg/L(主要酯类物质总量由高至低依次为:L2、J2、L1、J1、G2、CK、G1),红曲L、J和高含量的G添加对其提升比例为6.17%～52.02%。

2.2.3 不同酒样中挥发性风味成分差异分析

对7个酒样中的挥发性风味成分进行定性定量分析,共检测了47种挥发性成分,包括醇类11种、酯类19种、醛类7种、吡嗪类2种及呋喃等其他类8种。不同酒样中各类物质含量占总含量的比例如图4所示,其中,醇类物质占比最高,其次为醛类和酯类。红曲的添加有助于提升醛类和酯类的占比,醇类物质含量占比下降,这与高级醇含量降低的趋势一致。

OAV指气味化合物浓度与其对应介质中嗅觉阈值的比值,它可以作为判断香气化合物的初步确认方法,进一步评价某一化合物对于样品整体风味轮廓的贡献程度。通常认为OAV>1,该物质是重要化合物,对样品的香气贡献程度较大。不同酒样中的OAV>1的成分及含量如表2所示。在这47种挥发性风味成分中,OAV>1的化合物合计16种,7个样品的2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯的OAV均大于100,2-甲基丁酸乙酯主要呈现果香[19],OAV>1的成分中占比较高的是酯类、醇类及醛类。

为找出红曲不同种类和添加量酿造酒样挥发性风味成分的关键差异化合物,分别对3种红曲及不同添加量酿造的酒样进行差异分析。其中,CK为不添加红曲的对照酒样。PCA分析结果显示,模型提取了2个主成分(PC1和PC2),拟合指数R2X=0.987,Q2=0.737,均大于0.7,表明拟合效果较好。不同酒样挥发性风味成分的PCA分析如图5,PC1与PC2分别为32.0%、26.7%,2个成分累计贡献程度达到58.7%。添加红曲的酒样与CK之间差异显著,L1、G1分别位于第一二象限,第一象限反映了异戊醇、苯丙酸乙酯、2-乙酰基呋喃、乙酸乙酯对L1的风味形成具有较大影响,第二象限反映了正己醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、异丁醇、乙缩醛、四甲基吡嗪、己酸异戊酯对G1的风味形成有较大影响。L2和J1位于第四象限,这一象限反映的主要是酯类物质对样品的影响,包括乳酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-甲基丙酸乙酯。CK、G2、J2位于第三象限,这一象限反映了醇类对其主要风味形成的影响,包括苯乙醇、2-庚醇、正丁醇、异丁醇、正丙醇。在PC1上与CK距离较远差异较大的样品为L2、G2、J2,说明在PC1上影响更大的是红曲的添加量。在PC2上与CK距离较远的是L1、G1,推测在PC1上影响更大的是红曲的种类。添加高含量的红曲G和J所酿造的酒样G2、J2其挥发性物质组成差异不明显,推测G和J含量较高时可能优势微生物菌群相似,从而代谢产生的物质差异较小。

3 结论

红曲是重要的糖化发酵剂,对所酿造白酒的挥发性风味成分有重要影响。红曲的添加,可有效提高酒中的酯类含量,其中对乳酸乙酯和己酸乙酯提升效果明显;同时,红曲的添加对样品中高级醇的产生有一定的调控作用,可有效降低样品中异丁醇、异戊醇的含量。然而,酒曲的种类和含量均会影响酯类和高级醇的调控效果,其影响机制还有待进一步研究。结合OAV和主成分的分析结果,引起不同红曲酿造白酒中挥发性风味成分代谢差异的物质基本一致。本结论中的风味成分差异多依赖统计学分析方法,后续可进一步借助生物学、多组学联用技术进一步解析红曲对白酒发酵过程的影响机制。

[1] HOU Y Q, LIU J, SHAO Y C, et al.Evaluation of the underestimation of citrinin content in Hongqu using hydrolysis treatments and UPLC-FLD[J].Food Control, 2021, 130:108245.

[2] LIU Z B, WANG Z Y, LYU X C, et al.Comparison study of the volatile profiles and microbial communities of Wuyi Qu and Gutian Qu, two major types of traditional fermentation starters of Hong Qu glutinous rice wine[J].Food Microbiology, 2018, 69:105-115.

[3] ZHOU K X, WU L, CHEN G M, et al.Development of a novel restrictive medium for Monascus enrichment from Hongqu based on the synergistic stress of lactic acid and ethanol[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:702951.

[4] SONG C N, ZHU L P, SHAO Y C, et al.Enhancement of GABA content in Hongqu wine by optimisation of fermentation conditions using response surface methodology[J].Czech Journal of Food Sciences, 2021, 39(4):297-304.

[5] 李茂, 安明哲, 赵东, 等.苦荞酒酒曲的筛选优化及其智能化酿造的分析研究[J].酿酒科技, 2022(11):65-71.LI M, AN M Z, ZHAO D, et al.Screening of Jiuqu for Tartary buckwheat Baijiu and its intelligent production[J].Liquor-Making Science &Technology, 2022(11):65-71.

[6] 王金龙, 程平言, 陆伦维, 等.基于DB-WAX UI色谱柱气相色谱法检测5种香型白酒中45种挥发性风味物质[J].中国酿造, 2023, 42(4):238-243.WANG J L, CHENG P Y, LU L W, et al.Detection of 45 volatile flavor compounds in 5 flavor types Baijiu by GC based on DB-WAX UI column[J].China Brewing, 2023, 42(4):238-243.

[7] 卫春会, 郑自强, 李浩, 等.浓香型白酒酒醅发酵过程中风味物质时空差异分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(5):240-246.WEI C H, ZHENG Z Q, LI H, et al.Time and spatial distribution difference of flavor compounds during the fermentation of fermented grains of Luzhou-flavor Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(5):240-246.

[8] 范文来, 徐岩.白酒79个风味化合物嗅觉阈值测定[J].酿酒, 2011, 38(4):80-84.FAN W L, XU Y.Determination of odor thresholds of volatile aroma compounds in Baijiu by a forced-choice ascending concentration series method of limits[J].Liquor Making, 2011, 38(4):80-84.

[9] 范文来, 徐岩.白酒香气物质研究的方法学[J].食品科学技术学报, 2018, 36(3):1-10.FAN W L, XU Y.Methodology for aroma compounds in Baijiu[J].Journal of Food Science and Technology, 2018, 36(3):1-10.[10] 范文来, 聂庆庆, 徐岩.洋河绵柔型白酒关键风味成分[J].食品科学, 2013, 34(4):135-139.FAN W L, NIE Q Q, XU Y.Key aroma compounds of Yanghe supple and mellow aroma style liquors[J].Food Science, 2013, 34(4):135-139.

[11] ZEEMAN S C, KOSSMANN J, SMITH A M.Starch:Its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants[J].Annual Review of Plant Biology, 2010, 61:209-234.

[12] HU Y L, YANG Q, CHEN D, et al.Study on microbial communities and higher alcohol formations in the fermentation of Chinese Xiaoqu Baijiu produced by traditional and new mechanical technologies[J].Food Research International, 2021, 140:109876.

[13] PANG X N, CHEN C, HUANG X N, et al.Influence of indigenous lactic acid bacteria on the volatile flavor profile of light-flavor Baijiu[J].LWT, 2021, 147:111540.

[14] CHEN D, CHIA J Y, LIU S Q.Impact of addition of aromatic amino acids on non-volatile and volatile compounds in lychee wine fermented with Saccharomyces cerevisiae MERIT.ferm[J].International Journal of Food Microbiology, 2014, 170:12-20.

[15] LI W, CUI D Y, WANG J H, et al.Overexpression of different alcohol acetyltransferase genes with BAT2 deletion in Saccharomyces cerevisiae affects acetate esters and higher alcohols[J].European Food Research and Technology, 2018, 244(3):555-564.

[16] DONG J, WANG P F, FU X M, et al.Increase ethyl acetate production in Saccharomyces cerevisiae by genetic engineering of ethyl acetate metabolic pathway[J].Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, 2019, 46(6):801-808.

[17] ZHU S K, LU X, JI K L, et al.Characterization of flavor compounds in Chinese liquor Moutai by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2):340-348.

[18] LI X, ZHANG X L, WU X Z, et al.Effect of Chinese Baijiu coupled with a ternary mixed starter on the flavor component structure of Chinese Dongbei Suancai[J].Journal of Food Processing and Preservation, 2022, 46(10):e16849.

[19] 蒋洋, 张翠英, 李于, 等.酒类风味物质对人体乙醇代谢影响的研究进展[J].食品科学, 2021, 42(15):242-250.JIANG Y, ZHANG C Y, LI Y, et al.Effect of flavor substances in alcoholic beverages on ethanol metabolism in human body:A review[J].Food Science, 2021, 42(15):242-250.