马波沙星(marbofloxacin, MAR)属于第三代氟喹诺酮类药物,是一种抗菌谱广、抗菌活性高的兽用抗菌药,已被广泛用于动物疾病的预防和治疗[1-2]。然而,滥用马波沙星的情况时有发生,其残留毒性和耐药性不仅会影响动物源性食品的质量,还会对消费者的健康造成不同程度的危害,如产生耐药菌株、发生过敏反应、干扰肠道菌群等。为此,国家标准GB 31650.1—2022《食品安全国家标准 食品中41种兽药最大残留限量》规定MAR在猪、牛肌肉中的最大残留限量为150 μg/kg。目前检测MAR的分析方法有超高效液相色谱法[3-4]、超高效液相色谱-串联质谱法[5]、胶束电动毛细管色谱法[6]、酶联免疫吸附法[7-8]、金标免疫层析法[9-10]、荧光分析法[11-12]等。仪器检测法存在设备昂贵、对技术人员要求高等局限性[13];酶联免疫吸附法耗时长、容易受外界环境影响而出现假阴性或假阳性[14];金标免疫层析法的灵敏度较低,标记物不稳定,利用肉眼观察无法满足定量检测的需求[15];荧光分析法存在荧光背景干扰强、易发生光漂白、检测时间短等局限性[16]。与上述方法相比,电化学免疫传感器具有灵敏度高和检测设备可微缩化的优点[17]。
氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是石墨烯最重要的衍生物之一,具有丰富的含氧基团(环氧、羧基和羟基)和较大的表面积[18]。借助壳聚糖大分子,可增加氧化石墨烯在溶液中的分散性,增大固定抗体的表面积,提高电化学免疫传感器的灵敏度[19-20]。另外,金纳米粒子(gold nanoparticles, AuNPs)具有优良的生物相容性和导电性,故将其电沉积到氧化石墨烯上,能增强电极的导电性,进而提高传感器的灵敏度[21-22]。因此,本文利用金纳米粒子/氧化石墨烯复合膜对玻碳电极进行修饰,构建了一种灵敏检测MAR的电化学免疫传感器。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
MAR抗体,实验室自制;氧化石墨烯,上海源叶生物有限公司;氯金酸,国药集团;壳聚糖(chitosan,CS)、MAR、诺氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星、环丙沙星、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺,上海阿拉丁有限公司;牛血清白蛋白(borine serum albumin,BSA),Sigma公司;铁氰化钾、亚铁氰化钾,天津德恩化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
CHI610E电化学工作站、采用三电极体系:玻碳电极、AgCl电极、铂丝电极,上海辰华仪器有限公司;JSM-7500F扫描电子显微镜,日本日立公司;KQ-500DE数控超声清洗仪,昆山市超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 GO-CS的制备与表征
称取一定量的CS溶于0.05 mol/L HCl溶液中,制备1 mg/mL CS溶液;然后称取一定量的GO加入上述CS溶液中,使溶液中GO的质量浓度为2 mg/mL,超声分散1 h,得到混合均匀的GO-CS溶液,4 ℃保存备用。用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)对GO和GO-CS复合物进行表征。
1.3.2 电极的修饰和表征
用氧化铝抛光裸玻碳电极(glassy carbon electrode, GCE)后,放入含有
混合物(10 mmol/L,摩尔比1∶1)的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中,用循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)进行扫描,要求抛光裸玻碳电极的还原峰电位与氧化峰电位的差值小于90 mV。然后将玻碳电极依次用乙醇和蒸馏水进行超声清洗,50 ℃下干燥。先将GO-CS溶液超声5 min,以获得均匀的悬浮液。准确量取10 μL GO-CS悬浮液垂直滴在玻碳电极表面,室温孵育24 h。将电极置于含0.5 mmol/L HAuCl4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中,通过电沉积AuNPs,提高电极的导电性,得到AuNPs/GO-CS/GCE。将电极放在0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液中进行电化学还原,将GO-CS还原成rGO-CS。然后在电极表面滴加10 μL MAR抗体,37 ℃孵育1 h,继续滴加10 μL 50 g/L BSA封闭1 h,用循环伏安法在-0.2～0.6 V的电位范围内对电极的修饰过程进行表征。
1.3.3 电化学免疫传感器的构建
MAR电化学免疫传感器检测原理见图1。用氧化石墨烯-壳聚糖修饰玻碳电极后,通过电沉积AuNPs和电化学还原AuNPs/GO-CS中的GO,提高玻碳电极的导电性。用活性酯法活化AuNPs/rGO-CS复合膜上的羧基,MAR抗体通过Au—N键或酰胺键偶联到AuNPs/rGO-CS复合膜上[23-24]。检测阳性样品时,则MAR抗体会捕获MAR,阻碍检测底液中电化学探针
向电极表面扩散,使电极的响应峰值电流降低[25]。根据MAR浓度与峰值电流变化量之间的相关性,建立MAR的定量检测方法。
图1 MAR/BSA/MAR抗体/AuNPs/rGO-CS/GCE免疫传感器的制备示意图
Fig.1 Fabrication of MAR/BSA/anti-MAR/AuNPs/rGO-CS/GCE immunosensor
1.3.4 电化学免疫传感器灵敏度、特异性和稳定性评价
称取一定量的MAR溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液,配成1 mg/mL MAR标准溶液,然后再稀释成不同浓度的MAR标准溶液。用移液器量取10 μL一定浓度的MAR标准溶液(或样品处理液),滴加在免疫传感器的电极上,37 ℃下孵育50 min。采用含有0.1 mol/L KCl和10 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (摩尔比1∶1)的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液作为电化学免疫传感器的测试底液,扫描速率为0.05 V/s,用差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)对不同浓度的MAR在-0.2～0.6 V的电位范围内进行测量,记录其峰值电流。以MAR浓度为横坐标,以峰值电流变化量[ΔI,计算如公式(1)所示]为纵坐标绘制标准曲线,按公式(2)计算MAR检测限(limit of detection, LOD)[26]:
ΔI=I空白-IMAR
(1)
式中:I空白,不含MAR溶液的峰值电流;IMAR,MAR指定浓度下的峰值电流。
(2)
式中:δ,空白标准偏差;S,标准曲线斜率。
为了考察MAR电化学免疫传感器的特异性,在含有50 ng/mL MAR的溶液中分别加入10倍MAR的结构类似物(培氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星)作为干扰物质进行检测,并记录峰值电流。
为了评估所制备传感器的稳定性,将制备的修饰电极保存在4 ℃冰箱中,保存20 d,每隔4 d放置在相同测试底液中测定峰值电流变化量。
1.3.5 样品预处理
将市售猪肉、鸡肉和牛肉样品分别准确称取5.0 g,绞碎,转移至试管中。每管分别加入6.5 g硫酸钠和15.0 mL甲醇,振荡混匀12 min,沉淀蛋白质。离心(10 000 r/min, 10 min),保留上清液,4 ℃保存。使用时,用pH 7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释2倍,用所制备的电化学免疫传感器对样品处理液进行检测[27]。
2 结果与分析
2.1 GO-CS复合物的表征
对上述制备的GO和GO-CS用SEM进行表征,结果如图2所示。
a-GO;b-GO-CS
图2 GO和GO-CS扫描电镜图
Fig.2 SEM diagrams of GO and GO-CS
由图2-a可知,GO是一种具有特殊褶皱的片层材料。由图2-b中可以看出,GO与CS结合后,形成一层更光滑的薄膜。因为壳聚糖拥有良好的成膜性和生物相容性,有效地分散了氧化石墨烯材料,避免其发生堆叠和团聚[28]。
2.2 电化学还原AuNPs/GO-CS复合膜
在扫速100 mV/s,0.2～-1.6 V的电位范围内,在pH 7.4 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中用电化学法还原玻碳电极上的AuNPs/GO-CS复合膜,结果见图3。
图3 GO-CS电还原CV图
Fig.3 CV curves of GO-CS electroreduction
由图3可以看出,第1圈CV扫描时在-1.4 V处出现了一个较高的还原峰,是由含氧官能团的还原过程形成的。随着电化学还原过程的发生,还原峰逐渐降低甚至消失,说明电极表面修饰的GO被还原成rGO。GO经电化学还原后,表面的含氧基团逐渐减少,使电极的电子传输能力增强。因此,复合膜中GO被电化学还原后,会增强修饰电极的导电性,提高电化学免疫传感器的灵敏度[29]。
2.3 电极修饰过程的表征
用CV法表征不同修饰过程电极的电化学行为,结果见图4。
a-GCE;b-GO-CS/GCE;c-AuNPs/GO-CS/GCE;d-AuNPs/rGO-CS/GCE;e-anti-MAR/AuNPs/rGO-CS/GCE;f-BSA/anti-MAR/AuNPs/rGO-CS/GCE;g-MAR/BSA/anti-MAR/AuNPs/rGO-CS/GCE
图4 不同修饰电极的CV图
Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodes
由图4-a可见,裸玻碳电极表面呈现一对可逆性良好的氧化还原峰。在GCE表面修饰GO-CS后,由于GO表面丰富的含氧官能团,导致电极的导电性变差,从而引起峰值电流减小(图4-b)。将金纳米粒子通过电沉积法附着在GCE表面后,加速了电子传递过程,峰值电流相对增加(图4-c)。通过电化学法还原GO-CS复合膜上的含氧官能团,使GCE的导电性增强,故峰值电流显著增大(图4-d)。当MAR抗体固定在纳米复合膜修饰的电极表面上时,由于MAR抗体分子的固定阻碍了电子的传递,从而使峰值电流降低(图4-e)。用BSA溶液封闭电极上剩余结合位点后,峰值电流进一步减小(图4-f)。在电极表面结合抗原后,峰值电流继续减小(图4-g)。上述结果表明,试验成功构建了电化学免疫传感器的电极。
2.4 扫描速率的影响
在MAR质量浓度为50 ng/mL,抗体质量浓度为50 μg/mL,测试底液中的浓度为10 mmol/L,pH值为7.4条件下,考察不同扫描速率(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130 mV/s)对AuNPs/rGO-CS/GCE的影响,结果见图5。
a-CV图;b-峰值电流与扫速平方根的线性拟合图
图5 不同扫速下AuNPs/rGO-CS/GCE的CV图和扫速平方根与峰值电流的关系图
Fig.5 CV curves of AuNPs/rGO-CS/GCE at different scan rates and the relation plots between peak current and the square roots of scan rate
如图5-a所示,AuNPs/rGO-CS/GCE的氧化还原峰电流随着扫描速率的增加而增大,与扫描速率的平方根在10～130 mV/s范围内呈现出良好的线性关系。阳极峰值电流的回归方程为:Ipa=-0.416 7-46.451 0 v1/2,相关系数r=0.983 8,阴极峰值电流的回归方程为:Ipc=0.425 7+49.527 0 v1/2,相关系数r=0.988 7,说明电极表面的反应是受扩散过程控制的可逆过程[30]。
2.5 电化学检测条件的优化
2.5.1 抗体质量浓度的确定
电极表面孵育的抗体质量浓度是影响MAR检测的重要因素,在MAR质量浓度为50 ng/mL,测试底液中的浓度为10 mmol/L,pH值为7.4条件下,研究不同质量浓度(10、20、30、40、50、60、70 μg/mL)抗体修饰电极对传感器电化学检测性能影响,结果见图6。
图6 抗体质量浓度的优化
Fig.6 Optimization of antibody concentration
由图6可以看出,随着抗体质量浓度的增加,峰值电流变化量迅速升高,表明抗体被固定在AuNPs/rGO-CS/GCE上,抗体分子的固定阻碍了电子的传递,使峰值电流变小,峰值电流变化量增大;当抗体质量浓度超过50 μg/mL时,抗体与AuNPs/rGO-CS/GCE的结合基本达到饱和,峰值电流变化量趋于平缓。因此,选择50 μg/mL为MAR抗体的最佳质量浓度。
2.5.2 测试底液
浓度的确定
在MAR质量浓度为50 ng/mL,抗体质量浓度为50 μg/mL,测试底液pH值为7.4条件下,考察测试底液中不同浓度
对传感器电化学检测性能的影响,结果见图7。
图7 测试底液中
浓度的优化
Fig.7 Optimization of concentration in test base solution
由图7可知,峰值电流变化量随着测试底液中浓度的增大而增加;当浓度达到10 mmol/L时,峰值电流变化量达到最大。当浓度继续增大时,峰值电流变化量趋于平缓。因此,选择测试底液中的最适浓度为10 mmol/L。
2.5.3 测试底液pH的确定
测试底液的pH是影响抗体活性的重要因素之一,对免疫传感器的检测性能有较大影响。在MAR质量浓度为50 ng/mL,抗体质量浓度为50 μg/mL,测试底液中的浓度为10 mmol/L条件下,研究不同测试底液pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)对传感器电化学检测性能的影响,结果见图8。
图8 测试底液pH的优化
Fig.8 Optimization of pH in test base solution
如图8所示,峰值电流变化量先随pH值的增加而增大,在pH值为7.0时达到最大值,表明此时抗体反应活性最佳。pH继续增大后,峰值电流变化量明显下降。说明pH过大,导致抗体活性下降,使其结合MAR的量减少,引起峰值电流变化量下降。因此,选择pH 7.0为测试底液的最适pH。
2.6 免疫传感器性能分析
2.6.1 线性关系及检测限
在最适条件下,用构建的电化学免疫传感器对MAR的一系列质量浓度(0.5、5、10、25、50、100、200、300、400 ng/mL)进行测定,结果见图9。
a-DPV图;b-标准曲线
图9 电化学免疫传感器对不同质量浓度MAR响应的DPV曲线和标准曲线
Fig.9 DPV curves of the electrochemical biosensor to different concentrations of MAR and standard curve
由图9-a可见,随着MAR浓度的增加,峰值电流逐渐降低。图9-b显示了在0.5～400 ng/mL范围内,DPV峰值电流变化量与MAR浓度呈线性关系。线性回归方程为y=1.031 3+0.007 8x,相关系数r=0.999 2,检测限为0.05 ng/mL。
2.6.2 免疫传感器的特异性和稳定性
考察免疫传感器的特异性和稳定性结果,结果见图10。
a-特异性图;b-稳定性图
图10 电化学免疫传感器的特异性和稳定性
Fig.10 Specificity and stability of electrochemical immunosensors
由图10-a可知,与只加入50 ng/mL MAR的溶液对比,加入干扰物后所得电流响应值分别增加1.96%、2.35%、0.78%、3.14%,相对标准偏差都小于5%,表明上述药物基本不干扰MAR的测定,因此该免疫传感器对马波沙星具有良好的特异性。由图10-b可知,20 d后传感器的峰值电流变化量相较第1天下降约9.1%,因此,表明该传感器的稳定性良好。
2.7 鲜肉样品的分析
2.7.1 校正曲线
采用超高效液相色谱-串联质谱法测定3种鲜肉,得出3种样品均为阴性样品。按照1.3.5节方法处理猪肉、鸡肉、牛肉样品,用得到的样品处理液分别稀释MAR标准品溶液,得到一系列MAR浓度(0.5、10、25、50、100、200、300、400 μg/kg)的样品溶液。用所建立的电化学免疫传感器对上述溶液进行检测,得到校正标准曲线。结果表明,MAR浓度在0.5～400 μg/kg内,所制备的免疫传感器在含有10 mmol/L的测试底液中的氧化峰电流值变化量与MAR浓度之间具有良好的线性关系。猪肉样的线性方程为y=1.216 0+0.007 4x,相关系数r=0.999 4,检测限为0.09 μg/kg,鸡肉样的线性方程为y=1.101 6+0.007 1x,相关系数r=0.999 3,检测限为0.10 μg/kg,牛肉样的线性方程为y=1.104 2+0.007 7x,相关系数r=0.999 1,检测限为0.09 μg/kg。
2.7.2 添加回收试验
按照1.3.5节方法处理猪肉、鸡肉和牛肉样品,MAR在鲜肉中的加标量为5、100、200 μg/kg,平行处理3次,测定峰值电流,用上述校正曲线回归方程计算MAR浓度。同时,用超高效液相色谱-串联质谱法对上述加标样品进行检测,结果见表1。
表1 添加回收试验结果(N=3)
Table 1 Results of spiked experiment (N=3)
样品本方法HPLC-MSMAR标准浓度/(μg/kg)加标量回收量回收率/%相对标准偏差/%回收量回收率/%相对标准偏差/%54.61±0.1492.182.944.49±0.1789.873.69猪肉10084.53±1.2484.531.4791.97±2.0091.972.18200184.57±2.7492.291.49205.22±3.33102.611.6254.14±0.1482.813.404.77±0.1395.452.73鸡肉10096.43±1.1896.431.2291.16±2.1491.162.35200203.22±1.72101.610.85201.87±3.35100.941.6655.10±0.15101.992.944.51±0.1890.134.09牛肉10089.47±0.7289.470.8087.97±2.1387.972.42200194.67±5.4497.332.79182.08±1.9391.041.06
由表1可以看出,免疫传感器测定样品的回收率为82.81%～101.99%,相对标准偏差≤3.40%。说明该方法可用于鲜肉中MAR的检测。超高效液相色谱-串联质谱法检测回收率在87.97%～102.61%,相对标准偏差≤ 4.09%。结果表明,该电化学免疫传感器检测结果与超高效液相色谱-串联质谱法检测结果基本一致。综上可知,本方法可作为MAR常规检测的替代方法。
3 结论
利用AuNPs/rGO-CS复合膜修饰玻碳电极后,固定抗体,构建了一种检测MAR的电化学免疫传感器。该传感器检测MAR的线性范围为0.5～400 ng/mL,线性系数为0.999 2,检测限为0.05 ng/mL。所制备的免疫传感器在长期贮存中均显示出良好的稳定性。对猪肉、鸡肉和牛肉样品的检测限分别为0.09、0.10、0.09 μg/kg,添加回收率82.81%～101.99%,相对标准偏差≤3.40%。经超高效液相色谱-串联质谱法验证,表明所建立的电化学免疫传感器可用于鲜肉中MAR的定量检测。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点,故在MAR快速检测中具有巨大的应用潜力。
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