浓香型白酒以其芳香浓郁、绵柔甘洌、香味协调、尾净余长的特点深受消费者喜爱,其产量和销量占白酒总量的70%以上[1]。“泥池固态发酵”是浓香型白酒生产的独特工艺,赋予浓香型白酒独特的风格特征。窖泥是浓香型白酒生产的基础,窖池提供的丰富微生物群落和厌氧环境会直接或间接地影响风味化合物的形成,对白酒风味起着至关重要的作用[2-3]。
窖泥质量的优劣与浓香型白酒的产量和品质密切相关,窖泥的质量评价方法是中国白酒行业从未停歇的探索。早在20世纪90年代李家明等[4]就提出了结合感官指标(色泽、气味和手感)、理化指标(水分、氨态氮、有效磷和腐殖质)和微生物指标(细菌和芽孢杆菌数)评定窖泥质量的好坏,而至今通过感官指标、理化指标和微生物指标判定窖泥质量的方法仍广泛应用[5-6]。然而感官评价结果受主观影响较大,需要评价人员具有丰富的实践经验,评价标准不好量化,评价经验不好传承。而随着研究的逐步深入,一些被纳入标准的理化指标也被发现并不能准确地反映窖泥质量情况,如腐殖质、氨态氮、有效磷等被认为与窖泥质量正相关的指标并不随着窖泥窖龄的增加而增加[7]。随着色谱技术的发展,窖泥风味物质研究也逐渐增多,酸、酯被确定为窖泥的主要挥发性物质类型[8-9],吴浪涛等[10]的研究结果表明10年窖泥的己醇和乳酸含量较高,而己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯等关键风味物质含量均是30年窖泥的较高,窖泥风味物质与窖泥质量的相关性也逐渐被重视,但目前哪些风味物质可以用于定量衡量窖泥质量仍未有定论。因此提高窖泥评价体系的客观性和系统化成为中国白酒行业亟待解决的技术难题。
本研究以不同等级的窖泥为例,全面解析其理化和风味指标,将所获得的信息转化为数据矩阵,采用偏最小二乘法(partial least squares,PLS)对数据进行建模分析,以期建立一种窖泥质量分级方法,为窖泥质量评价系统化科学化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究根据窖泥感官评价、窖泥窖龄及窖泥对应原酒的酒质综合分析,选取60批浓香型白酒窖泥样品,包括一级窖泥、二级窖泥及三级窖泥各20批,编号分别为YJ-1～YJ-20、EJ-1～EJ-20、SJ-1～SJ-20。所有样品均由宜宾南溪酒业有限公司提供。
无水乙醇(色谱级),美国Thermo Fisher Scientific公司;氢氧化钠、硫酸、硫酸亚铁、重铬酸钾、氯化钾、氧化镁、氯化钠、酒石酸钾、硼酸、硝酸、无水硫酸钠均为分析纯,中国国药化学试剂有限公司;超纯水,PURELAB Classic超纯水净化系统制备;挥发性化合物定量内标(2-乙基己醇),上海百灵威化学技术有限公司。
1.2 仪器与设备
ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS),美国ThermoFisher Scientific公司;Agilent 8890-5977B气质联用仪、DB-FFAP(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)毛细管色谱柱,美国Agilent公司;MPS2三合一自动进样器,德国GERSTEL公司;固相微萃取三相萃取头(1 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国SUPELCO公司;PURELAB Classic超纯水机,英国埃尔格ELGA公司;pH计,奥豪斯仪器有限公司;紫外可见分光光度计,普析通用仪器北京有限公司;全自动凯氏定氮仪,丹麦FOSS公司;DHG-9245A电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 理化指标的测定
水分的测定:采用烘干法[11];pH值的测定:参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.2—2006《土壤检测:第2部分 土壤pH的测定》方法进行测定;有机质的测定:采用消化炉加热法[12];氨态氮的测定:采用奈氏试剂比色法[13];有效磷的测定:采用钼酸铵比色法[14];矿物质元素的测定:采用ICP-MS法[15]。
1.3.2 HS-SPME-GC-MS分析不同等级窖泥挥发性化合物
参照张朝正等[16]的方法稍作修改,称取2 g窖泥样品于20 mL顶空瓶中,加入1 mL体积分数为10%的乙醇水溶液和20 μL内标(2-乙基己醇,197.90 mg/L),盖上顶空瓶盖,振摇混匀,将顶空瓶放于自动微萃取装置中50 ℃平衡15 min后萃取,萃取头插入顶空瓶深度为22 mm,萃取温度50 ℃,萃取时间45 min,萃取结束后以不分流模式在250 ℃下解吸附5 min。
气相色谱条件:进样口温度为250 ℃;载气为高纯氦气(纯度 ≥ 99.999%),不分流,恒流模式,流量1 mL/min;柱温升温程序:起始温度40 ℃,保持5 min,以3.5 ℃/min速率升温至250 ℃,保持5 min。
质谱条件:离子源为电子轰击离子(EI Xtr)源,能量70 eV,温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,辅助通道加热温度280 ℃,溶剂延迟6.5 min,全离子扫描,扫描范围20～500 amu。
1.3.3 挥发性化合物分析
1.3.3.1 挥发性化合物的定性分析
采用质谱解析与数据库NIST 20谱库检索,筛选出匹配度大于80%的风味化合物并结合保留指数(retention index,RI)和标准品定性。
1.3.3.2 挥发性化合物的定量分析
根据内标2-乙基己醇的含量及其与样品中定性的挥发性物质峰面积之比进行半定量分析。
1.4 统计分析
数据采用SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)。选取样本的80%为训练集,20%为验证集,先将训练集导入软件中进行分析建模,再用训练集和验证集分别对所建模型进行验证。
2 结果与分析
2.1 不同等级窖泥理化检测结果
前期研究[17-19]表明pH值、水分、有效磷、氨态氮、有机质及微量元素等与窖泥质量密切相关,本研究对60批样品中pH值、水分、有效磷、氨态氮、有机质、钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、钡进行定量分析,结果如图1所示,氨态氮(ammonia nitrogen)和铝(Al)含量有随着窖泥质量等级的提高而提高的趋势,而钙(Ca)含量有随着窖泥质量等级的提高而降低的趋势,其余各指标未见明显规律,同时包括氨态氮、铝和钙在内的所有指标在同一等级窖泥中差异较大,因此无法简单地通过理化指标量化进行窖泥的质量分级。
图1 不同等级窖泥理化指标结果
Fig.1 Physicochemical index results of pit mud
2.2 不同等级窖泥风味物质分析
采用HS-SPME-GC-MS分析在窖泥样品中共解析出63种化合物,主要为酯类(29种)、酸类(12种)和醇类(10种),60批样品中的63种化合物半定量分析结果如图2所示。基于不同等级窖泥样品风味物质半定量结果进行分析,正己醇、己酸丁酯、乙酸、己酸异戊酯等在三级窖泥含量普遍高于一级、二级窖泥,而大部分指标在一级窖泥样品中含量差异较大,窖泥风味物质含量在不同等级窖泥间差异较大,在同一等级窖泥样品间差异也较大,且风味物质在不同等级窖泥样品中含量分布无显著规律。因此,通过风味物质量化进行窖泥质量标准化难以实现。
图2 不同等级窖泥风味物质含量
Fig.2 Flavor substance contents of pit mud with different grades
综上,窖泥理化和风味物质影响因素较多,样品间差异较大,不同等级窖泥中未见明显规律,通过具体理化和风味指标量化制定窖泥等级质量标准来实现窖泥分级难以实现。PLS是一种集主成分分析、典型相关分析和多元回归分析于一体的多元线性回归方法,通过降维的方式对多变量进行分析,预测精度高,近年来在白酒香型鉴别和质量分级中应用广泛[20-21]。本研究将所获得的信息转化为数据矩阵,采用PLS对数据进行建模分析,以期建立一种窖泥质量分级方法。
2.3 模型判别分析
2.3.1 PLS分析
采用OPLS-DA分析挖掘造成窖泥等级差异的潜在变量,如图3-a所示,通过可靠的OPLS-DA模型可以很好地区分3个等级样品。该模型的R2X、R2Y和Q2分别为0.815、0.926、0.755,其中R2和Q2大于0.5,且R2与Q2的差值小于0.3,说明该模具有较好的概括解释能力和预测能力[22]。变量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)表征了分类过程中各个变量的重要性,通常VIP值大于1的变量在不同样本组之间的区分中起着重要作用。如图3-c所示,通过VIP值筛选出27个差异标记物,包括钠、水分、氨态氮、钾、钙、己酸、己酸乙酯、4-甲基苯酚等。其中水分、氨态氮早在20世纪90年代就被认定为影响窖泥质量的重要因素;铁、钙离子与窖泥的老化具有重要联系[23];己酸、己酸乙酯是浓香型白酒品质的重要衡量指标;4-甲基苯酚被证明是浓香型白酒泥臭味的物质基础之一[24]。这些物质的种类和含量差异具有潜在鉴定窖泥质量的作用。
a-基于所有样品所有指标所建模型的得分图;b-基于27个差异指标所建模型的得分图;c-VIP图
图3 不同等级窖泥理化及风味指标OPLS-DA分析
Fig.3 OPLS-DA analysis of physicochemical and flavor indicators of pit mud with different grades
为了建立一个快速准确的等级判别模型,以48个样本为训练集,以各个样本的27个差异标记物的含量为变量,提供各个样本的等级信息,使用SIMCA 14.0软件自动拟合OPLS-DA判别模型(图3-b),该模型基于4个主成分的R2Y=0.895、Q2Y=0.777,模型的解释变异度(R2Y)和预测能力(Q2Y)接近于1,表明该模型的适用性和可预测性较好。
2.3.2 模型验证
OPLS-DA分析可以很好地展示组间差异,但是有监督的分类模型缺点是可能会出现过拟合现象,因此需要验证模型的可靠性。置换检验是利用样本数据的全(或随机)排列,进行统计推断,从而进行模型是否过拟合的判定方法。由3个等级的200次置换验证图(图4)可以看出,左侧的R2和Q2值均低于最右边的R2和Q2值,且Q2回归线的截距均为负值,说明所构建的3个PLS-DA判别模型均没有出现过拟合的现象,且都有较好预测能力[25],模型稳定可靠,可以用于各自等级的判别分析。
a-一级样品模型验证;b-二级样品模型验证;c-三级样品模型验证
图4 PLS-DA模型置换验证图
Fig.4 PLS-DA model permutation validation diagram
以12个样本作为验证集,使用已建立的OPLS-DA模型进行判别,验证该模型的预测能力。表1为模型对不同等级12个样本进行判别分析的结果,从表2中可以看出,验证集中不同等级窖泥的分类变量预测值在其对应的等级模型都接近于1,为0.75～1.25,而在其他2个等级的分类变量的预测值基本为0,在-0.30～0.30。根据OPLS-DA法的判别准则可知,验证集中的所有酒样都被正确的识别,即样品等级识别率为100%。
表1 OPLS-DA判别模型验证集判别结果
Table 1 The classification results of PLS-DA model for samples in validation set
样品编号分类变量的预测值一级二级三级YJ-91.093 2-0.153 00.059 8YJ-100.887 70.288 9-0.076 7YJ-190.796 40.323 3-0.051 0YJ-200.904 20.055 4-0.004 5EJ-90.303 70.818 80.177 6EJ-100.048 41.091 6-0.140 1EJ-190.250 60.758 20.191 2EJ-200.220 70.814 5-0.035 3SJ-9-0.252 3-0.152 71.204 9SJ-10-0.181 4-0.264 51.146 0SJ-19-0.058 2-0.197 71.139 5SJ-20-0.099 40.149 00.950 4
3 结论
为建立一种科学的、可以量化的窖泥质量判断方法,结合理化分析、ICP-MS及GC-MS等多种检测技术对窖泥的水分、pH值、有机质、氨态氮、有效磷、矿物质及风味物质等采用OPLS-DA分析,筛选出27个窖泥等级差异标记物,包括钠、水分、氨态氮、钾、钙、己酸、己酸乙酯、4-甲基苯酚、苯酚等。选取样本的80%为训练集,基于这27种差异化合物建立了快速预测模型,由排列检验结果说明模型不存在过拟合现象。通过样品量的20%为预测集对模型预测能力进行验证,预测集样本等级正确识别率为100%,表明该模型具有较好的预测能力,预测精度较高,能够较好地判断出窖泥等级。本研究为窖泥的质量分级提供一条新的途径和思路。
[1] LIU M K, TANG Y M, GUO X J, et al. Deep sequencing reveals high bacterial diversity and phylogenetic novelty in pit mud from Luzhou Laojiao cellars for Chinese strong-flavor Baijiu[J]. Food Research International, 2017, 102:68-76.
[2] HU X L, TIAN R J, WANG K L, et al. The prokaryotic community, physicochemical properties and flavors dynamics and their correlations in fermented grains for Chinese strong-flavor Baijiu production[J]. Food Research International, 2021, 148:110626.
[3] 沈怡方. 白酒生产技术全书[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1998.SHEN Y F. Complete Book of Baijiu Production Technology[M]. Beijing: China light industry press, 1998.
[4] 李家明, 李家顺, 何福金, 等. 人工窖泥质量标准的研究与应用[J]. 酿酒科技, 1994(4): 28-31.LI J M, LI J S, HE F J, et al. Research and application of quality standards for artificial cellar mud[J]. Liquor-Making Science &Technology, 1994(4): 28-31.
[5] 张东跃, 沈才洪, 敖宗华, 等. 模糊综合评价法在人工窖泥老熟感官评价中的应用[J]. 中国酿造, 2013, 32(1):120-123.ZHANG D Y, SHEN C H, AO Z H, et al. Application of fuzzy comprehensive evaluation method in mature sensory evaluation of man-made pit mud[J]. China Brewing, 2013, 32(1):120-123.
[6] 程伟, 汪焰胜, 黄训端, 等. 金种子人工窖泥及其黄土原料理化成分的检测分析[J]. 酿酒科技, 2017(12):114-118.CHENG W, WANG Y S, HUANG X D, et al. Detection and analysis of physiochemical components in jinzhongzi artificial pit mud and its raw material[J]. Liquor-Making Science &Technology, 2017(12):114-118.
[7] 李学思, 李绍亮, 曹振华, 等. 宋河酒业不同窖龄窖泥中理化指标的变化及其相关性分析[J]. 酿酒, 2018, 45(5):38-42.LI X S, LI S L, CAO Z H, et al. Study on the change of physicochemical indexes in different aged Songhe distillery pit muds and their correlation analysis[J]. Liquor Making, 2018, 45(5):38-42.
[8] 郑佳, 杨康卓, 张建敏, 等. 浓香型白酒窖泥香气成分的空间分布规律[J]. 食品与发酵工业, 2020, 46(1):11-15.ZHENG J, YANG K Z, ZHANG J M, et al. Spatial distribution of aroma compounds in pit mud of Strong-flavor Baijiu[J]. Food and Fermentation Industries, 2020, 46(1):11-15.
[9] 陈让芳, 高健, 杨燕, 等. 浓香型白酒窖泥原核微生物群落与挥发性风味物质相关性分析[J]. 食品与发酵科技, 2023, 59(3):9-15.CHEN R F, GAO J, YANG Y, et al. Correlation analysis between prokaryotic microbial community and volatile flavor compounds in pit mud of Luzhou-flavor liquor[J]. Food and Fermentation Science &Technology, 2023, 59(3):9-15.
[10] 吴浪涛, 丁文骏, 谢专, 等. 不同时期窖泥理化因子、风味物质和细菌组成的相关性[J]. 微生物学通报, 2022, 49(3):1030-1047.WU L T, DING W J, XIE Z, et al. Characterization and correlation analysis of the bacterial composition, physicochemical properties and volatiles in Baijiu fermentation pit mud of different ages[J]. Microbiology China, 2022, 49(3):1030-1047.
[11] 陶勇, 徐占成, 刘孟华, 等. 剑南春窖泥理化特性及矿质元素变化趋势研究[J]. 酿酒科技, 2011(7):51-54.TAO Y, XU Z C, LIU M H, et al. Study on the physiochemical properties of pit mud from Jiannanchuan pit &the change trend of its mineral elements[J]. Liquor-Making Science &Technology, 2011(7):51-54.
[12] 霍姮翠, 张饮江, 彭自然. 3种方法检测水体底泥有机质含量的比较[J]. 安全与环境学报, 2010, 10(5):102-106.HUO H C, ZHANG Y J, PENG Z R. Comparison of three methods measuring the sediment organic matter of water body[J]. Journal of Safety and Environment, 2010, 10(5):102-106.
[13] 王福荣. 酿酒分析与检测[M]. 2版. 北京: 化学工业出版社, 2012: 27-35.WANG F R. Brewing Analysis and Testing[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2012: 27-35.
[14] 朱莉莉, 罗惠波, 黄治国, 等. 浓香型白酒窖泥质量评价理化指标的筛选[J]. 中国酿造, 2018, 37(12):33-39.ZHU L L, LUO H B, HUANG Z G, et al. Screening of physicochemical indicators for pit mud quality evaluation in strong-flavor Baijiu[J]. China Brewing, 2018, 37(12):33-39.
[15] 王音, 沈勇猛, 张健. ICP-MS在土壤元素分析中的应用进展[J]. 广州化工, 2022, 50(6):40-42, 50.WANG Y, SHEN Y M, ZHANG J. Research progress on application of ICP-MS in soil elemental analysis[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2022, 50(6):40-42, 50.
[16] 张朝正, 张天爽, 董思文, 等. 窖泥中挥发性物质和微生物群落的空间分布规律及其关系[J]. 食品工业科技, 2022, 43(5):147-157.ZHANG C Z, ZHANG T S, DONG S W, et al. Spatial distribution and relationship of volatile compounds and microbial community in pit mud[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(5):147-157.
[17] 曾波, 邹永芳, 饶家权, 等. 浓香型白酒窖底泥和窖壁泥细菌群落结构差异性分析[J]. 食品科学, 2023, 44(18):223-230.ZENG B, ZOU Y F, RAO J Q, et al. Differences in bacterial community structure between bottom and wall pit mud for Nongxiangxing Baijiu[J]. Food Science, 2023, 44(18):223-230.
[18] 彭奎, 余航, 王超凯, 等. 不同质量浓香型白酒窖泥腐殖质组分的研究分析[J]. 食品与发酵科技, 2022, 58(3):124-128.PENG K, YU H, WANG C K, et al. Study on humus composition of nongxiangxing Baijiu pit mud with different quality[J]. Food and Fermentation Science &Technology, 2022, 58(3):124-128.
[19] 侯冬岩, 李铁纯, 回瑞华, 等. 不同窖龄窖泥中矿物元素的分析研究[J]. 鞍山师范学院学报, 2021, 23(4):32-35.HOU D Y, LI T C, HUI R H, et al. Analysis and study of mineral elements in pit mud of different ages[J]. Journal of Anshan Normal University, 2021, 23(4):32-35.
[20] 魏泉增, 范江涛, 刘嘉玲, 等. 偏最小二乘方法在不同白酒香型判别分析中的应用[J]. 中国酿造, 2020, 39(10):183-187. WEI Q Z, FAN J T, LIU J L, et al. Application of partial least squares in different flavor types of Baijiu discriminant analysis[J]. China Brewing, 2020, 39(10):183-187.
[21] 樊杉杉, 唐洁, 乐细选, 等. 基于HS-SPME-Arrow-GC-MS和化学计量学的小曲清香型原酒等级判别[J]. 食品与发酵工业, 2021, 47(13):254-260.FAN S S, TANG J, LE X X, et al. Grade discrimination of Xiaoqu light aroma Baijiu based on HS-SPME-Arrow-GC-MS and chemometrics[J]. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(13):254-260.
[22] 顾凡, 陶亮, 代佳和, 等. HS-GC-IMS结合化学计量学分析6种野生蜂蜜的挥发性风味成分[J]. 中国食品学报, 2023, 23(11):320-331.GU F, TAO L, DAI J H, et al. Analysis of volatile flavor components of six wild honeys based on HS-GC-IMS combined with chemometrics[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(11):320-331.
[23] 吴三多, 赖登燡, 温宽和, 等. 北方地区窖泥退化原因及管理养护的研究[J]. 酿酒科技, 2014(9):71-74.WU S D, LAI D Y, WEN K H, et al. Study on the reasons for pit mud degradation in North China and the maintenance of pit mud[J]. Liquor-Making Science &Technology, 2014(9):71-74.
[24] 倪兴婷, 孙细珍, 江莎, 等. 感官定量描述结合化学分析技术解析浓香型白酒窖泥臭味物质基础[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(10):213-224.NI X T, SUN X Z, JIANG S, et al. Sensory quantitative description combined with chemical analysis technology to analyze substance basis of pit mud odor of strong-aroma Baijiu[J]. Food and Fermentation Industries, 2024, 50(10):213-224.
[25] BORR
S E, FERRÉ J, BOQUÉ R, et al. Olive oil sensory defects classification with data fusion of instrumental techniques and multivariate analysis (PLS-DA)[J]. Food Chemistry, 2016, 203:314-322.