水产品中水分含量高、营养成分丰富,增加了其腐败变质的可能性。其中,微生物是导致水产品腐败变质的主要原因之一[1]。水产品在腐败过程中微生物群组成持续变化,随着时间的延长,只有少数微生物占主导地位,导致水产品品质下降,这些细菌被称为特定腐败菌[2](specific spoilage organism,SSO)。腐生葡萄球菌是水产品特定腐败菌之一[3]。
鳜鱼广泛分布于我国各主要江河湖泊,是重要的名优淡水鱼之一。近年来,随着饲料鳜鱼养殖规模扩大,其价格大幅度下降[4]。鱼蛋白水解一直是蛋白质高质化利用的有效途径之一,蛋白质水解物还能够与金属离子螯合制备具有重要功能特性的多肽-金属螯合物,如鲢鱼多肽-锌[5],鲈鱼多肽-钙[6]和罗非鱼多肽-锌[7]等。
多肽-金属螯合物是指肽与金属离子之间通过多个配位体的螯合作用而形成的环状化合物,具有促进人体对矿物质的吸收[8]、抗氧化[9]和抑菌保鲜[10]作用。多肽-锌螯合物是其中重要的一类,它的常规制备方法为醇沉-离心法[11-13],为许多研究者所采用,但是,WANG等[14]采用离心-醇沉法和醇沉-离心法分别制备出P2和P3两种多肽-锌螯合物,一方面建立了一种新的制备方法,另一方面,也比较了2种螯合物性质的差异,拓展了多肽与锌螯合制备新技术。另外,针对其抑菌保鲜作用来说,有研究报道,多肽-锌螯合物具有抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色假丝酵母的能力[7]。本团队前期研究初步表明鳜鱼蛋白源多肽-锌螯合物具有水产保鲜效果[15],但是,针对其多肽-锌螯合物抑制腐生葡萄球菌的机理尚不明确。
本实验以鳜鱼蛋白为底物,采用风味蛋白酶水解制备鳜鱼蛋白水解物,将水解物与锌离子螯合,再分别经过离心-醇沉法和醇沉-离心法制备多肽-锌螯合物(P1、P2和P3)。重点研究P2和P3对腐生葡萄球菌抑菌圈、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活力、生长曲线的影响,通过检测细胞膜通透性、细胞膜完整性、细胞微观结构以及细菌体内最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)来揭示鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌机制,以期为多肽-金属螯合物的抑菌机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鳜鱼(秋浦花鳜),安徽省池州市东至县大联圩有限公司,质量规格为0.5～0.6 kg;腐生葡萄球菌B8,作者所在课题组前期从腐败鳜鱼中分离、鉴定并保存的菌株;超氧化物歧化酶试剂盒、过氧化氢酶试剂盒,南京建成生物工程研究所;风味蛋白酶(500 LAPU/g),诺维信生物公司;酵母粉、胰蛋白胨和琼脂,生工生物工程(上海)股份有限公司;乙醚、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇等(分析纯),国药集团化学试剂有限公司。
UV-5500紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;ZWY-240恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;FD-1 CE冷冻干燥机,北京德天佑科技发展有限公司;HH-6数显恒温水浴锅,上海力辰邦西仪器科技有限公司;H 1750R离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;MJ-30D超声波清洗机,长沙明杰仪器有限公司;DDS-307A电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;FEI Nova Nano 450生物扫描电镜,美国FEI公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鳜鱼蛋白水解物的制备
取新鲜鳜鱼肉搅成鱼糜,与石油醚按1∶1(g∶mL)的料液比混合,并于40 ℃慢摇脱脂16 h。收集沉淀鱼糜进行真空干燥后,加去离子水制成底物浓度为10%的混合物,按0.2%的比例加入风味蛋白酶,调节pH为7.0,于50 ℃水浴恒温振荡3 h后,90 ℃水浴灭酶10 min。酶解物经离心(8 000 r/min,15 min,4 ℃)后取上清液进行冷冻干燥,-20 ℃保存,备用。
1.2.2 鳜鱼多肽-锌螯合物的制备
参考WANG等[14]方法,取冷冻干燥后的酶解粉用去离子水溶解(40 mg/mL),按一定比例加入80 mg/mL的ZnSO4·7H2O溶液,用NaOH和HCl调节pH为6.0,30 ℃水浴恒温振荡1 h。反应结束后,将反应液放置室温下冷却,离心(8 000×g,15 min),获得上清液(S1)和沉淀物(P1)。在S1中加入无水乙醇至体积分数为80%,在4 ℃条件下静置1 h后离心(8 000×g,15 min),得到上清液(S2)和沉淀物(P2),方法记作“离心-醇沉法”。将反应液与乙醇直接按比例混合,然后离心(8 000×g,15 min),分离上清液(S3)和沉淀(P3),方法记作“醇沉-离心法”。在蛋白质利用率方面,S1=S2+P2;P3=P1+P2。收集螯合物P1、P2和P3,冷冻干燥后-20 ℃保存,备用。
1.2.3 菌悬液的制备
挑取活化后的腐生葡萄球菌单菌落接种于LB液体培养基中,37 ℃摇床培养16 h,用灭菌生理盐水将其配制成含菌数106 CFU/mL的菌悬液,现配现用。
1.2.4 抑菌圈
参考李东昱等[16]的牛津杯法,稍作修改。测定鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌圈。吸取腐生葡萄球菌菌悬液50 μL于无菌培养皿中,取15 mL 融化的LB固体培养基至含有菌悬液的培养皿中,混合均匀,待冷却凝固,将牛津杯固定于培养基表面。取50 mg/mL的螯合物溶液200 μL于牛津杯中,以加无菌水和酶解液为对照组,做3组平行试验。37 ℃条件下培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈的直径,按照抑菌圈直径大小进行敏感性评判。
1.2.5 最小抑菌浓度
参考杨成等[17]方法,稍作修改。将多肽-锌螯合物溶解于无菌LB培养液中并进行二倍稀释,使得最终质量浓度分别为25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19 mg/mL,依次加入等体积的腐生葡萄球菌菌悬液,以不加菌悬液的为对照组,做3组平行试验。37 ℃、150 r/min摇床培养 24 h后,测量在600 nm波长处的吸光值。
1.2.6 生长曲线
参考BABII等[18]方法,将腐生葡萄球菌菌悬液按1%接种量加至LB液体培养基中,以加入MIC、0.5 MIC和0.25 MIC的鳜鱼多肽-锌螯合物为实验组,以不加螯合物的为对照,做3组平行试验。37 ℃、150 r/min摇床培养24 h。每隔2 h取样测量在600 nm波长处的吸光值,绘制腐生葡萄球菌生长曲线。
1.2.7 电导率值
参考朱亚珠等[19]方法,将鳜鱼多肽-锌螯合物分别加入到腐生葡萄球菌菌悬液中,使得终浓度为MIC和0.5 MIC,并以未加螯合物的为对照,做3组平行试验。37 ℃、150 r/min摇床培养8 h,每隔2 h取样离心(4 ℃、8 000 r/min、15 min),取上清液,适当稀释后测定培养液电导率。
1.2.8 紫外吸收值
参考MERGHNI等[20]方法,稍作修改。将鳜鱼多肽-锌螯合物分别加入到腐生葡萄球菌菌悬液中,使得终浓度为MIC和0.5 MIC,并以未加螯合物的为对照,做3组平行试验。37 ℃,150 r/min摇床培养8 h,每隔2 h取样用0.22 μm的滤膜过滤,分别检测滤液在260 nm和280 nm波长处的吸光值。
1.2.9 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力
将鳜鱼多肽-锌螯合物分别加入到腐生葡萄球菌菌悬液中,使得终浓度为MIC、0.5 MIC,以未加螯合物的为空白对照,做3组平行试验。37 ℃,180 r/min摇床培养,定时取样,低温超声2 min,离心(4 ℃、5 000 r/min、15 min)后取上清液,按试剂盒方法测定SOD和CAT活力。
1.2.10 生物扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)
参考冷雨佳[21]的方法,稍作修改。将鳜鱼多肽-锌螯合物分别加入到腐生葡萄球菌菌悬液中,使得终浓度为MIC和0.5 MIC,并以未加螯合物的为空白对照,37 ℃,150 r/min摇床培养15 h。培养物经离心(4 ℃、4 000 r/min、10 min)后收集沉淀,用磷酸缓冲液(0.2 mol/L pH 7.0)清洗2次,去上清液,用2.5%(体积分数)戊二醛固定液固定样本,4 ℃过夜放置。倒出戊二醛溶液,用磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.0)漂洗菌体样品3次,每次15 min;用1%(体积分数)的锇酸溶液固定样品1～2 h;倒出锇酸废液,用磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.0)漂洗菌体样品3次,每次15 min;再分别用30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液对菌体样品逐级脱水,每种浓度均处理15 min,以上操作均在4 ℃条件下进行。在常温下,再用100%的乙醇继续脱水2次,每次20 min。接着用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(体积比1∶1)处理样品30 min,再用纯醋酸异戊酯处理样品。临界点干燥,镀膜后使用扫描电镜观察拍照。
1.3 数据统计与分析
实验数据均采用平均值±标准偏差表示,采用SPSS 16.0软件进行数据统计与分析,多组间数据使用单因素方差分析,Duncan’s检验与LSD法均值多重比较;P<0.05表示存在统计学显著差异;使用Origin 2018作图。
2 结果与分析
2.1 抑菌圈
通过牛津杯法分别测试了P1、P2和P3对腐生葡萄球菌的抑菌圈及直径,如图1和表1所示。由图1 可知,鳜鱼肉酶解液对腐生葡萄球菌无抑菌效果;3种多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌均有一定的抑菌活性,推测鳜鱼多肽-锌螯合物的抑菌活性可能与锌离子有关。其中P3的抑菌效果最好,抑菌圈直径达到(21.39±2.46) mm,其次是P2,抑菌圈直径大小为(17.89±3.06) mm,P1抑菌圈直径<10 mm,对腐生葡萄球菌有低敏感度。张钰源[22]采用滤纸片法测定大鲵肽与大鲵肽-锌螯合物对金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌和变形杆菌的抑菌效果,发现大鲵肽对6种菌没有抑菌活性,而大鲵肽-锌螯合物对6种菌均有抑菌活性,研究结果与本实验结论相似。由于P1的抑菌敏感度较低,后续将重点研究P2和P3的抑菌机制。
表1 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌圈直径
Table 1 Inhibitory zone diameter of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish against Staphylococcus saprophyticus
供试菌株腐生葡萄球菌B8种类P1P2P3酶解液无菌水抑菌圈直径/mm9.34±2.8517.89±3.0621.39±2.4600敏感度-+++++--
注：抑菌圈直径<10 mm:低敏感或无效,用-代表;10 mm≤抑菌圈直径<15 mm:中敏感,用+代表;15 mm≤抑菌圈直径<20 mm:高敏感,用++代表;抑菌圈直径≥20 mm:极敏感,用+++代表。
A-P1实验组;B-P2实验组;C-P3实验组
图1 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌圈
Fig.1 Inhibitory zone of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish against Staphylococcus saprophyticus
注:1、2、3分别表示螯合物、酶解液、无菌水。
2.2 最小抑菌浓度
MIC是衡量抑菌物质抑菌能力的重要指标之一。不同浓度的P2和P3对腐生葡萄球菌的抑菌效果如图2所示。当P2和P3质量浓度≥0.78 mg/mL时,同一浓度下与对照组相比,实验组吸光值变化不大,说明腐生葡萄球菌生长受到抑制;当P2和P3质量浓度<0.78 mg/mL时,同一浓度下与对照组相比,实验组吸光值增加,说明在该浓度范围P2和P3不能抑制或不能完全抑制腐生葡萄球菌的生长。实验结果表明P2、P3的最小抑菌浓度均为0.78 mg/mL。
A-P2实验组;B-P3实验组
图2 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌效果
Fig.2 Bacteriostatic effect of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish on Staphylococcus saprophyticus
2.3 生长曲线
细菌生长曲线能够反映菌株生长状况。由图3可知,对照组腐生葡萄球菌生长曲线呈“S”型趋势,在0～2 h是生长潜伏期,2～12 h为指数生长期,12 h 后进入生长平稳期。P2和P3以0.25 MIC作用于腐生葡萄球菌时,细菌难以进入指数生长期;在MIC的P2和P3作用下,腐生葡萄球菌生长可完全被抑制。生长曲线实验结果表明,P2和P3对腐生葡萄球菌的生长具有较强的抑制作用。陈梦玲等[23]研究发现,牛至精油可延缓腐生葡萄球菌进入指数生长期,与本实验结果相似。
A-P2实验组;B-P3实验组
图3 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌生长曲线影响
Fig.3 Effect of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus
2.4 电导率值
当菌体细胞受到外界不良影响时,细胞膜渗透性会改变,胞内电解质外渗,此时可通过菌悬液电导率的变化判断菌体的受损情况。由图4可知,添加MIC和0.5 MIC的P2和P3实验组与对照组的电导率变化趋势相似,都呈现先快速上升后缓慢增长的趋势;添加不同浓度P2和P3的实验组2～4 h内电导率显著高于对照组(P<0.05),说明P2和P3均可破坏腐生葡萄球菌细胞膜的通透性,使细胞内电解质外泄;随着时间的延长,对照组电导率与添加不同浓度P2和P3的实验组电导率相近,推测是菌体出现自溶现象所致。由此可推测,P2和P3可通过增强腐生葡萄球菌细胞膜通透性,抑制细菌正常生长代谢,从而造成菌体死亡。徐小烽等[24]采用同样的方法研究鲢鱼重组Cystatin C对腐生葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理,结果表明鲢鱼重组Cystatin C能够破坏铜绿假单胞菌和腐生葡萄球菌细胞膜完整性,使细胞膜通透性增强,结论与本实验相似。
A-P2实验组;B-P3实验组
图4 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌细胞外电导率影响
Fig.4 Effect of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish on extracellular conductivity of Staphylococcus saprophyticus
注:同一时间点下不同处理组之间字母不同代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.5 紫外吸收值
细菌培养液内蛋白质和核酸含量是评价细菌细胞膜破环程度的重要指标。由图5可知,随着培养时间的延长,对照组培养液在260 nm和280 nm处吸光值变化不大,说明对照组培养液中核酸和蛋白质含量相对稳定;添加MIC和0.5 MIC的P2和P3实验组在260 nm和280 nm处吸光值整体上升,且吸光值在2～8 h内均显著高于对照组(P<0.05),说明P2和P3均可破坏细菌细胞膜完整性,导致胞内核酸、蛋白质等物质流出;P3在260 nm和280 nm处的吸光值始终高于P2,说明P3对腐生葡萄球菌细胞膜破环程度大于P2,与前文抑菌圈实验结果相符合。由此可以推断,P2和P3可破坏腐生葡萄球菌的细胞膜,从而抑制细菌生长繁殖,YE等[25]研究曲酸对腐生葡萄球菌细胞膜的破坏性,也得到相似的结论。
A-P2实验组(OD260nm);B-P3实验组(OD260nm);C-P2实验组(OD280nm);D-P3实验组(OD280nm)
图5 鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌细胞膜完整性影响
Fig.5 Effect of polypeptid-zinc chelate of mandarin fish on membrane integrity of Staphylococcus saprophyticus
2.6 SOD和CAT活力
SOD和CAT对细菌细胞内抗氧化系统起着重要的防御作用。由表2可以看出,0～8 h内加入MIC和0.5 MIC的P2和P3后SOD活力显著高于对照组(P<0.05),说明P2和P3能够大幅度提高腐生葡萄球菌胞内SOD活力,从而影响菌体正常生长代谢;添加MIC的P2和P3比添加0.5 MIC的P2和P3的SOD活力提升得更高,说明P2和P3对腐生葡萄球菌SOD活力影响具有浓度依赖性;2～8 h添加MIC的P2处理组CAT活力显著低于对照组(P<0.05),添加MIC的P3在2～6 h内CAT活力也低于对照组。由此可推测,P2和P3可通过提升腐生葡萄球菌SOD活力和降低CAT活力来影响菌体正常生长。黄伟英等[26]采用试剂盒方法测定乳酸链球菌素对腐生葡萄球菌的抑菌机制,结果表面乳酸链球菌素可通过降低腐生葡萄球菌SOD和CAT活力使菌体抗氧化动态失衡,导致菌体生长受到抑制。
表2 多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌SOD和CAT活力影响 单位:U/mL Table 2 Effects of peptide-zinc chelate on SOD and CAT activity of Staphylococcus saprophyticus
组别SOD活力CAT活力0 h2 h4 h6 h8 h0 h2 h4 h6 h8 hP20.5 MIC64.35±1.74d63.39±0.90b62.35±2.06c64.82±2.50b70.94±1.82c1.67±0.03a2.03±0.04a1.50±0.02b1.72±0.05b1.79±0.02aMIC83.34±1.46a85.77±10.8a90.05±1.60a64.82±2.50b82.53±2.39b1.31±0.03c1.40±0.05c1.04±0.03c1.31±0.04c1.40±0.01cP30.5 MIC68.44±1.63c66.65±1.57b60.25±2.40c68.38±1.68b69.47±2.46c1.67±0.02a1.54±0.02b1.44±0.01b1.22±0.03c1.81±0.03aMIC79.97±0.79b82.21±1.57a60.25±2.40c81.52±3.18a104.94±1.40a1.67±0.02a1.54±0.01b1.50±0.03b2.12±0.02a1.50±0.04b对照组13.34±1.46e12.35±2.01c7.61±1.98d9.57±1.86c8.11±1.72d1.49±0.01b1.54±0.03b1.63±0.04a2.30±0.03a1.49±0.05b
注：同一列的不同字母代表差异显著(P<0.05)。
2.7 生物扫描电镜
SEM可从细菌的菌体形态上直观反映鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌菌体结构的影响。由图6可知,添加酶解液的对照组菌体大小均匀,呈现饱满的圆球状,表面光滑平整,说明菌体细胞结构完整,生长良好。MIC和0.5 MIC的P1和P2处理组菌体形状不规则、表面粗糙褶皱、无充盈感、扭曲变形、部分菌体细胞出现破损、内容物外泄、相互黏附现象,且MIC P3处理组菌体胞膜大量剥落、破裂畸形,细胞损伤最严重。由此可推测,P2和P3可通过破坏腐生葡萄球菌的菌体结构抑制细菌生长繁殖。ZHANG等[27]采用SEM观察经复合保鲜剂处理后的腐生葡萄球菌,菌体表面出现干瘪,凹陷,相互黏附,破碎,研究结果与本实验相似。
A-酶解液处理组;B-MIC P2处理组;C-0.5MIC P2处理组;D-MIC P3处理组;E-0.5MIC P3处理组
图6 酶解液和鳜鱼多肽-锌螯合物处理后腐生葡萄球菌扫描电镜图
Fig.6 SEM image of Staphylococcus saprophyticus after treatment with enzymolytic solution and polypeptide-zinc chelate of mandarin fish
3 结论
本研究以鳜鱼肉为原料,经风味蛋白酶酶解制得水解物,之后与ZnSO4·7H2O螯合,再经“离心-醇沉法”和“醇沉-离心法”制备出鳜鱼多肽-锌螯合物P1、P2和P3。探究P1、P2和P3的抑菌活性,抑菌圈实验结果显示P2和P3对腐生葡萄球菌的抑菌效果更佳;P2和P3对腐生葡萄球菌的MIC均为0.78 mg/mL。腐生葡萄球菌的抑菌机制的解析为:P2和P3能够增加细胞膜通透性、破坏细胞膜完整性、改变细菌结构、提升细菌胞内SOD活力和降低CAT活力,从而达到抑菌作用。其中,抑菌圈、紫外吸收和生物扫描电镜实验结果显示,P3的抑菌效果优于P2,可能是P3=P1+P2的缘故,2种螯合物协同作用时能够达到更好的抑菌效果。研究结果表明,鳜鱼多肽-锌螯合物可以作为抑制腐生葡萄球菌的备选剂之一,未来本团队将继续研究鳜鱼多肽-锌螯合物促进水产品保鲜的机理。
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