熊果酸是一种广泛存在于植物和水果中的五环三萜类化合物[1],具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗糖尿病[4]、抗肿瘤[5]等广泛的生理活性。熊果酸作为一种重要的植物次生代谢物,目前主要通过植物提取法获得[6-8]。由于其结构复杂,在植物中含量相对较低且提取困难,限制了其在食品、医药、化妆品等领域的应用。随着对三萜类化合物生物合成途径的认识深入,建立微生物细胞工厂正逐步成为生产高产量、高价值天然产物的极具潜力的平台[9]。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种模式真核微生物,遗传背景清晰,且具有丰富的基因操作工具、高效表达系统以及良好的耐受性,已被成功开发用于构建多种生物化学制品的细胞工厂和工业化生产[10-12]。在酿酒酵母中,三萜类化合物是通过糖酵解和甲羟戊酸(mevalonate pathway, MVA)途径合成的[13]。2,3-氧化角鲨烯是大多数五环三萜类化合物的共同前体。在熊果酸的合成过程中,一个关键步骤是2,3-氧化角鲨烯在氧化角鲨烯环化酶(2,3-oxidosqualene cyclase,OSC)的催化作用下,转化为三萜类化合物的核心支架——α-香树脂醇,再通过细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase, CPR)进一步转化为熊果酸[14-15]。近期研究利用微生物合成熊果酸,主要集中在代谢路径的修饰以及CYP和CPR的适配性上。HUANG等[14]通过引入CrαAS和CrAO(来源于长春花),实现了熊果酸的从头合成,产量仅有0.1 mg/L。LU等[15]通过优化CYP酶与CPR适配性以及发酵过程,在5 L发酵罐中实现熊果酸产量为123.27 mg/L。JIN等[16]通过增加乙酰辅酶A、NADPH供应、脂滴区室化和调整关键酶的拷贝数使得熊果酸产量在3 L发酵罐中达到1 132.9 mg/L。
本文构建了一株酿酒酵母菌株,用于合成熊果酸。通过引入来自于积雪草的CADDS和CaCYP716A83实现了熊果酸的从头合成,熊果酸积累量为2.95 mg/L。为了提高其产量,通过过量表达MVA途径的限速酶来增强前体供应,以及结合CYP酶和不同的CPR来优化电子转移效率。同时提高氧化还原辅因子供应、内质网改造、引入同来源的细胞色素b5优化电子传递链,进一步提高了熊果酸产量(图1)。本研究通过不同的策略提高了熊果酸产量,为熊果酸等五环三萜类化合物的生物合成拓展了研究思路。
图1 酿酒酵母中熊果酸的生物合成途径
Fig.1 Biosynthetic pathway of ursolic acid in Saccharomyces cerevisiae
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种
实验中所用菌株见表1,本实验所用的出发菌株是购于Euroscarf的CEN.PK2-1D(MATα、ura3-52、trp1-289、leu2-3-、112、his3Δ1、MAL2-8C、SUC2)。
表1 本研究所用菌株
Table 1 Strains used in this study
菌株宿主菌株描述来源CEN.PK2-1DMATα, ura3-52、trp1-289、leu2-3、112、his3Δ1、MAL2-8C、SUC2EuroscarfC800CEN.PK2-1DΔgal80::G418[17]α02C800Ty1::ADH1t-tHMG1-GAL1,10p-IDI1-TDH3t-His[18]α02-1α02Ty3::TDH1p-ERG1-TER22t-CADDS-PGK1p-Leu本研究UA-5α02-1Ty4::MET6p-CaCYP716A83-TER22t-HtCPR-TDH1p本研究UA-19UA-5Δlpp1::GAL7p-INO2-TEFt本研究UA-20UA-5Δlpp1::GAL7p-INO4-TEFt本研究UA-21UA-5Δlpp1::GAL7p-INO2-TEFt-INO4-TDH3p本研究UA-22UA-5Δlpp1::GAL7p-ICE2-TEFt本研究UA-23UA-5Δlpp1本研究UA-24UA-5Δopi1本研究UA-25UA-5Δpah1本研究UA-26UA-5Δlpp1::GAL7p-INO2-TEFt-ICE2-TDH3p本研究UA-27UA-19Δopi1本研究UA-28UA-22Δopi1本研究UA-29UA-26Δopi1本研究UA-30UA-5Δ911b::GAL7p-STB5-TEFt本研究UA-31UA-5Δ911b::GAL7p-ZWF1-TEFt本研究UA-32UA-5Δ911b::GAL7p-POS5-TEFt本研究UA-33UA-5Δ911b::GAL7p-GND1-TEFt本研究UA-34UA-5Δ911b::GAL7p-ALD6-TEFt本研究UA-35UA-5Δ911b本研究UA-36UA-32Δlpp1::GAL7p-INO2-TEFt本研究UA-37UA-36Δrox1::MET6p-CaCYP716A83-TER22t-HtCPR-TDH1p本研究UA-38UA-5Δrox1本研究UA-39UA-5Δmot1::TDH1p-CaCyb5-7-TER22t本研究UA-40UA-5Δmot1本研究UA-41UA-37Δmot1::TDH1p-CaCyb5-7-TER22t本研究
1.1.2 主要试剂
2×Taq PCR Master Mix、Phanta®Max Super-Fidelity DNA polymerase,南京诺唯赞生物科技有限公司;
快速质粒小提试剂盒、5 min DNA快速纯化试剂盒,北京全式金生物技术有限公司;基因、引物合成及测序,生工生物工程(上海)股份有限公司;α-香树脂醇、熊果酸标准品,上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
LB培养基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10,根据需要添加氨苄西林(100 μg/mL)或者卡那霉素(50 μg/mL);YPD液体培养基(g/L):酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20;SD培养基(g/L):葡萄糖20,体积比1∶10加入10×酵母氮源(YNB)溶液,亮氨酸、组氨酸、尿嘧啶、色氨酸根据需要添加。通过添加20 g/L琼脂制备所有固体培养基。
1.1.4 仪器与设备
Mastercycler® nexus X2-PCR基因扩增仪、Centrifuge 5804/5804 R-台式高速离心机,德国 Eppendorf 公司;HGPN-II-50隔水式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;凝胶成像仪,美国伯乐 Bio-Rad 公司;UV-1780紫外可见分光光度计、Prominence Plus高效液相色谱仪、QP2010型气相质谱联用仪,日本岛津公司;NanoDrop One 超微量分光光度计,美国赛默飞世尔科技公司;MP Fastprep-24 5G 快速样品制备仪,安倍医疗器械贸易(上海)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 目的基因的扩增
来源于积雪草的CADDS、CaCYP716A83以及菊芋的HtCPR等基因由赛索菲合成基因并进行酿酒酵母密码子优化,以质粒pUC57-Amp-CADDS-CaCYP716A83-HtCPR为模板扩增。酿酒酵母的启动子、终止子以及目的基因均由酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组为模板扩增。利用Gibson酶构建质粒,通过菌落PCR以及测序验证质粒是否构建成功。利用CRISPR/Cas9技术整合或者敲除目标基因,在酿酒酵母基因组上设计上下游同源臂,通过酵母菌落PCR验证目的基因的敲除或者整合是否成功。研究所用引物见表2。
表2 用于基因扩增的引物
Table 2 Primers used in this study
名称序列(5′-3′) CaCYP716A83-FTTATGCTTTATGTGGAAACAATCTAATTGGCAAACCaCYP716A83-RATGGAATTATTCTTTGTTCCATTATTTTCTAGTTTAG TTTTATTTGHtCPR-FTTGTTCGAAGAAGCTAAGGCTAGATATGHtCPR-RTTACCAAACATCTCTCAAGTATCTACCAGACAPMET6-FCATGAACCAGGGTCCCGCPMET6-RTTTTGATATGTACTTTGAAATTATATTGGTATTTTGT TTCTTAGAGTGTEF T-FGGTACCGGCCGCAAATTAAAGTEF T-RCTCGAGTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTER22-FATAGGTTGGCTTCCATGTTGGCTER22-RAATGTCAAAAGCCTCAAGGTGCCATGPTDH1-FGAAACCACACCGTGGGGCPTDH1-RTTTGTTTTGTGTGTAAATTTAGTGAAGTACTGTTTTT TGPGAL7-FTTTGCCAGCTTACTATCCTTCTTGAAAATATGCPGAL7-RTTTTGAGGGAATATTCAACTGTTTTTTTTTATCATGT TGINO4-FATGACGAACGATATTAAGGAGATACAAACAATACINO4-RTCACTGACCACTCTGTCCATCACINO2-FTCAGGAATCATCCAGTATGTGCTGTAGTGINO2-RATGCAACAAGCAACTGGGAACICE2-FATGACCAGTTTGTCCAAAAGCTTCATGICE2-RTCAACTACCAGAACCTATTAATTCTGTGGCGGND1-FATGTCTGCTGATTTCGGTTTGATTGGGND1-RTTAAGCTTGGTATGTAGAGGAAGAAACATTACCPOS5-FATGTTTGTCAGGGTTAAATTGAATAAACCAGPOS5-RTTAATCATTATCAGTCTGTCTCTTGGTCAGCCSTB5-FATGGATGGTCCCAATTTTGCACATCSTB5-RTCATACAAGTTTATCAACCCAAGAGACGTCAACZWF1-FATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTCZWF1-RCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGCTTAGTCACALD6-FATGACTAAGCTACACTTTGACACTGCALD6-RTTACAACTTAATTCTGACAGCTTTTACTTCAGTGTA TGCaCyb5-7-FATGGGTGGTGATGGCAAGGTCTACTCTCaCyb5-7-RTTATTGAGCTGATTTGGTATAAAAACGAATGCCAA CAGCCA
1.2.2 摇瓶发酵
将重组菌株接种到添加10 mL的YPD/YNB液体培养基中,在30 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养17 h制备种子液,检测OD600值。当OD600值达到0.8时,转接至含有25 mL YPD液体培养基中,30 ℃、220 r/min培养120 h,检测OD600值及最终产物含量。
1.2.3 检测方法
将酿酒酵母细胞沉淀用乙酸乙酯重悬,加入菌体等量体积的玻璃珠,利用FastPrep进行细胞破碎,混合均匀的样品在12 000×g下离心10 min,上清液经0.22 μm过滤器过滤后进行HPLC分析。
采用气相色谱-质谱联用仪检测α-香树脂醇。色谱柱为RTX-5毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)。以20 ℃/min升温至280 ℃,再以40 ℃/min升温至300 ℃,保持10 min。MS扫描范围为35～500 m/z,氦气流速为1.0 mL/min,进样体积为1 μL[19]。
熊果酸采用Thermo Fisher C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)通过HPLC检测样品,并在210 nm和40 ℃下进行紫外检测。然后,使用V(超纯水)∶V(乙腈)∶V(甲醇)=21∶67∶12作为流动相,进样体积为10 μL[15]。
2 结果与分析
2.1 优化CYP-CPR适配提高熊果酸产量
为了构建高水平生产熊果酸的底盘菌株,选用实验室前期过量表达MVA途径关键限速酶[tHMG1(一种截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶)、IDI1(异戊烯基二磷酸δ-异构酶)]用于过量生产角鲨烯的菌株α02为底盘菌株[18]。将角鲨烯环氧化酶ERG1和积雪草来源的香树脂醇合酶αAS(CADDS)整合至酿酒酵母基因组,以产生α-香树脂醇(图2-A)。在所得菌株α02-1中,检测到51.7 mg/L的α-香树脂醇(图2-B)。进一步将积雪草来源的CaCYP716A83和拟南芥来源AtCPR1质粒游离表达,检测发现熊果酸积累量为2.95 mg/L(图2-C)。对比不同来源的CPR与CaCYP716A83共表达,包括来自拟南芥的AtCPR2[20]、大豆来源的GmCPR[21]、菊芋HtCPR[22]、水飞蓟来源的SmCPR[23]、灯盏花来源的EbCPR[24],以选择最佳的CYP-CPR对(图2-C)。将构建的酿酒酵母菌株发酵120 h,熊果酸积累量如图2-C所示,按照6个CPR辅助CaCYP716A83催化合成熊果酸能力,最适CPR为:HtCPR>EbCPR>AtCPR2>SmCPR>AtCPR1>GmCPR。其中HtCPR与CaCYP716A83适配时,熊果酸积累量为5.4 mg/L。将筛选好的CaCYP716A83与HtCPR多拷贝整合至菌株α02-1基因组上,筛选到一株熊果酸产量为32.7 mg/L的菌株UA-5(图2-D)。
A-表达α-香树脂醇合酶的酵母细胞提取物GC分析;B-Ty3位点多拷贝整合ERG1和来源于积雪草的α-香树脂醇合酶CADDS的α-香树脂醇产量;C-不同来源CPR与CaCYP716A83的适配性;D-Ty4位点多拷贝整合积雪草来源CaCYP716A83和菊芋来源的HtCPR的熊果酸产量
图2 熊果酸的生物合成
Fig.2 Biosynthesis of ursolic acid
2.2 内质网改造优化P450酶表达
在酿酒酵母中,许多膜蛋白酶需要锚定在内质网才能发挥作用。萜类化合物的合成路径涉及多个CYP且需要附着在内质网膜上才能正确折叠表达。通过内质网扩张的形态学改变为CYP增加更多可附着的锚点,以提高萜类化合物的产量。研究表明,用于脂质生物合成的转录因子复合物INO2和INO4激活参与磷脂、脂肪酸和甾醇生物合成过程众多基因的表达[25-26]。OPI1通过抑制INO2/INO4复合物来抑制参与磷脂生物合成的基因的表达[27]。ICE2p是一种定位于皮层和核周的内质网蛋白,ICE2的过度表达有助于提高P450酶的稳定性[28]。PAH1是脂质代谢中调节最强的酶之一,是膜成分重要组成部分磷脂合成的重要调控基因[29]。
在菌株UA-5的基础上,分别对INO2、INO4、INO2-INO4、ICE2增加1个拷贝数,获得重组菌株UA-19、UA-20、UA-21、UA-22。OPI1、PAH1的缺失可有效增大内质网膜面积,在菌株UA-5的基础上,敲除OPI1、PAH1,获得菌株UA-24、UA-25。敲除编码磷脂酸磷酸酶LPP1[30-31],生成菌株UA-23。考察不同菌株中熊果酸的积累情况,结果如图3-A所示,敲除编码磷脂酸磷酸酶LPP1(菌株UA-23)对熊果酸的产量并无明显影响。OPI1的敲除、强化INO2和ICE2可有效提高熊果酸的产量,分别为39.9、40.3、35.4 mg/L,较菌株UA-5提高了22%、23.2%、8.3%。推测OPI1的敲除以及INO2的过表达可有效扩大内质网的表面积,为通路中的膜蛋白酶以及CYP提供了更大的附着面积,以提高熊果酸产量。对上述筛选到的有效改造策略进行组合改造,然而不论是哪2种组合均未有单点的改造提升效果明显(图3-B)。
A-内质网调控基因的单基因过度表达或缺失;B-内质网调控基因的组合过表达或者缺失
图3 内质网改造优化CYP的表达以提高熊果酸产量
Fig.3 Improving ursolic acid production by optimizing CYP expression based on endoplasmic reticulum modification
2.3 优化氧化还原辅因子供应模块
酵母合成熊果酸的路径中涉及氧化还原酶(tHMG1、ERG9、CaCYP716A83)的催化反应,NADPH是反应中必要的辅因子[32-33]。通过操纵多个参与NADPH生物合成或利用的基因,重新分配胞质的NADPH,可以增强熊果酸的合成。氧化还原途径中需要探索的关键基因有乙酸途径中的ALD2、ALD6和磷酸戊糖途径中的ZWF1、GND1、STB5,它们能够直接消耗或产生辅因子,或者作为转录因子间接影响其他直接编码合成NADPH基因的表达。ALD6基因编码细胞质的醛脱氢酶,该酶利用NADP作为其辅因子,生成NADPH[34]。NADH激酶(POS5)是酵母中有效的NADPH供应源[34-35]。GND1和ZWF1基因分别编码磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,是酵母中还原反应所需的NADPH的主要来源[35-37]。STB5基因编码一种转录因子,该转录因子参与氧化应激反应相关的多个基因调控[38]。
在菌株UA-5的基础上,分别游离表达ZWF1、GND1、STB5、ALD6和POS5,结果如图4-A所示。游离表达ZWF1、GND1和POS5相较于游离表达空质粒的UA-5熊果酸产量提升明显,熊果酸积累量分别为6.25、6.09、6.08 mg/L,较空白质粒的对照分别提升了47.4%、43.3%、43.6%。但当游离表达STB5时,熊果酸产量明显下降。STB5的过表达导致上调磷酸戊糖通路中大多数基因的表达,且抑制了PGI1(磷酸葡萄糖异构酶)的表达,驱动葡萄糖6-磷酸向糖酵解通路而不是磷酸戊糖通路,从而限制乙酰辅酶A的利用,导致熊果酸产量下降。另外,在菌株UA-5基础上,分别对STB5、ZWF1、GND1、POS5和ALD6增加1个拷贝数,获得菌株UA-30、UA-31、UA-32、UA-33、UA-34(图4-B)。结果发现仅有POS5的表达,熊果酸产量有明显提升,产量为48.2 mg/L,较菌株UA-5产量提升了47.3%。而ZWF1、GND1、STB5的ALD6的单拷贝表达均使得熊果酸产量降低,可能是ZWF1、GND1仅在质粒层面的高表达水平时,才会提升熊果酸产量。
A-菌株UA-5基础上游离表达NADPH生物合成或利用的基因;B-菌株UA-5基础上整合表达NADPH生物合成或利用的基因
图4 优化氧化还原辅因子供应模块提高熊果酸产量
Fig.4 Improving ursolic acid production by optimizing the REDOX cofactor supply module
2.4 优化电子传递链模块
CYP并非自给自足的酶,需要NADPH-CPR提供电子供体。在催化过程中,CYP需要通过CPR从NADPH接收2个电子,细胞色素b5作为某些CYP的电子转移的一部分,能够参与第2个电子向P450酶转移的过程[39](图5-B)。对于某些CYP,细胞色素b5的参与为CYP表达提供了更高的活性。同时,细胞色素b5还参与甾醇的生物合成以及脂肪酸代谢,有利于促进酵母生长[40]。
A-细胞色素b5电子传递示意图;B-菌株UA-5基础上游离表达积雪草来源的细胞色素b5
图5 优化电子传递链模块提高熊果酸的产量
Fig.5 Improving ursolic acid production by optimizing the electron transport chain module
研究表明,细胞色素b5(Cyb5)可以向其相互作用的伴侣CYP提供电子,增强P450酶的活力。例如,过表达来自黄曲霉的细胞色素b5使得青蒿酸积累增加3.5倍,倍半萜总产量增加40%[41]。本文选用的CaCYP716A83来源于积雪草,从积雪草转录组数据中挖掘出7个Cyb5,用于提高CaCYP716A83的催化能力,从而进一步提高酿酒酵母重组菌株产熊果酸能力。在菌株UA-5基础上,游离表达筛选出来的7个积雪草来源的细胞色素b5、酿酒酵母自身来源的细胞色素b5以及解脂亚洛酵母自身来源的细胞色素b5,结果表明积雪草来源的细胞色素CaCyb5-7可以显著提高熊果酸的产量,熊果酸产量为7.07 mg/L,较出发菌株提高了66.7%(图5-B)。细胞色素CaCyb5-7为CYP和CPR的电子传递提供了足够的辅因子,从而优化了电子传递链和提高了电子传递效率。
2.5 增强关键基因拷贝数及迭代改造对熊果酸合成的影响
通过分别优化CYP和CPR的适配性、内质网的改造、优化氧化还原辅因子供应以及电子传递链模块,熊果酸产量虽有明显提升,但提升幅度有限。因此,进一步对熊果酸的关键基因进行过表达,以考察对熊果酸产量的影响。在强化INO2以及POS5菌株UA-36基础上,敲除转录因子ROX1,过表达CaCYP716A83和HtCPR,获得菌株UA-37,熊果酸产量得到明显提升,产量达到77.2 mg/L,较菌株UA-5产量提升了136%。将筛选出来的积雪草来源的CaCyb5-7整合至菌株UA-5的MOT3位点时,获得菌株UA-39,熊果酸产量明显提升,为74.6 mg/L,较初始UA-5菌株提高了128%。将较好的不同改造策略进行组合改造,在菌株UA-37基础上MOT3位点整合CaCyb5-7,获得菌株UA-41,熊果酸产量为84.3 mg/L,较初始UA-5菌株提升了157%(图6)。由此可见,细胞色素b5的过表达增强了CYP的电子传递,对熊果酸产物积累有明显的促进作用。同时,关键基因拷贝数的增加对于产物积累具有明显促进作用。另外,研究发现内质网的改造、辅因子的强化以及电子传递链的优化具有协同作用。
图6 增加关键基因拷贝数及迭代改造提高熊果酸产量
Fig.6 Improving ursolic acid production by enhancing copy number of key genes and iterative modification
3 结论
微生物生产高价值植物天然产物被认为是绿色且可持续的,近年来,受到研究人员的广泛关注[42]。本文应用酿酒酵母生产高价值萜类化合物,而酿酒酵母通常被认为为植物来源的CYP的功能表达提供了较好的细胞内环境,并允许内膜定位和翻译后修饰[43]。熊果酸是具有多种生物活性的五环三萜类化合物,在食品、化妆品等领域具有广泛的应用。本研究选择过表达MVA途径中关键限速酶用于生产角鲨烯的酿酒酵母α02为底盘菌株,首先引入α-香树脂醇合成的关键基因CADDS,获得51.7 mg/L的α-香树脂醇。通过优化合成熊果酸的CYP及CPR组合,获得最优配对组合从而优化了电子传递,研究结果与此前的报道类似[15-16]。
由于熊果酸合成路径的大多数酶需要锚定在内质网上发挥作用,具有更多空间来容纳额外蛋白质折叠负荷的细胞可以更好地应对异常的蛋白质折叠和积累。TAN等[26]通过对内质网大小控制因子INO2的过量表达,成功增加前体角鲨烯和CYP介导的2,3-氧化角鲨烯的生成,从而增加终产物蒲公英醇的产量。在本研究中,INO2的过表达对熊果酸产量提升具有明显作用,INO2参与磷脂、脂肪酸和甾醇生物合成,不仅有利于内质网膜的扩大,同时对酿酒酵母的生长具有促进作用。多种氧化还原反应的叠加,NADPH作为必需的消耗品,增强NADPH供应是十分必要的。ZHAO等[36]发现过量表达POS5时,NAD激酶活力增加5.5倍,胡萝卜素合成的关键基因转录水平明显提升,产量也显著提高。过量表达POS5也明显提升熊果酸产量,而ZWF1、GND1仅在质粒层面的高表达水平时,才提升熊果酸产量。CYP需要在CPR的作用下才能发挥功能,而细胞色素b5作为电子传递的一部分,可以参与第2个电子传递转移的过程。PADDON等[41]通过过量表达来自黄曲霉的细胞色素b5使得青蒿酸积累增加3.5倍,倍半萜总产量增加40%。由于选用的细胞色素P450酶CaCYP716A83来源于积雪草,引入同来源的细胞色素b5,增强了电子传递链,熊果酸产量得到提高。CYP与CPR的适配性改善、内质网的扩大、NADPH的增加以及电子传递链的优化等改造策略,均显示出有限的提升效果。引入CYP和CPR的额外拷贝提升了熊果酸产量,表明关键基因拷贝数的增加对产物的积累具有促进作用。将筛选出的有效策略进行组合迭代改造,最终熊果酸产量提升至84.3 mg/L,表明不同策略具有协同效应。在摇瓶发酵水平上,较LU等[15]的研究中熊果酸产量为25.85 mg/L提高了226%,但距离JIN等[16]研究中的692.3 mg/L仍有一定距离。乙酰辅酶A作为MVA途径的中心代谢产物,强化其合成途径能够有效增加角鲨烯、番茄红素和β-香树脂醇等萜类化合物的合成[44-46]。JIN等[16]通过敲除参与乙醛酸分流的胞质苹果酸合酶以及增加乙醇消耗途径,提高了细胞内乙酰辅酶A的含量。通过ADH2、ALD6、ACS1的过量表达缓解了乙酸积累对细胞生长的抑制,增加了胞内乙酰辅酶A含量,熊果酸产量提高了15.6倍。另外,JIN等[16]通过优化关键基因的拷贝数,进一步提高了熊果酸产量,较未优化关键基因拷贝数菌株提高了4.5倍。由此可见,提高乙酰辅酶A供应以及优化关键基因的拷贝数对提高熊果酸产量至关重要,这也为后续进一步提高熊果酸产量提供了思路。虽然目前熊果酸的产量距离工业化还有一定距离,但该研究所呈现的改造策略为植物天然高价值产物的微生物合成提供了一定的参考,为萜类化合物的生物合成提供了研究思路。
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