浆水是我国西北地区的一种传统发酵蔬菜之一,通常是以芹菜、苦苣等蔬菜作为原料,并加入面汤和“引子”(老浆水)发酵而成的。发酵成熟后的浆水菜汤汁呈乳白色、酸爽可口、营养丰富[1],可直接饮用或煮沸加糖食用,或作为面食的汤底使用。

浆水是通过多种微生物共同发酵而成的酸性食品,其中的优势菌群为乳酸菌和酵母菌等,发酵过程中所产生的各种代谢产物对浆水风味、口感等影响较大[2]。目前,浆水仍以家庭、小作坊制作为主,由于传统制作工艺、蔬菜原料、以及生产环境各异使得浆水在酿造过程中微生物菌群复杂多变,产品风味品质差异较大,在发酵后期容易受到霉菌的污染[3],还会存在安全隐患,其风味上没有统一标准,销售因地域受限,不便于实现工业化、标准化生产,对我国浆水产业发展方面有很大限制。因此,采用纯种发酵的限制工艺,为缩短生产周期,开发安全、卫生的工业浆水制品,已成为当务之急[4]。

目前对浆水的研究报道聚焦在微生物组成方面。何玲等[5]研究表明自然发酵的浆水中的乳酸菌、酵母和乙酸菌占主导地位;李雪萍等[6]对传统制浆水微生物群落结构的影响进行了研究;ZHANG等[7]采用传统纯培养、现代分子生物学技术发现不同地区的浆水中优势菌群比较相似,但其菌种种类差别较大,各地区浆水的细菌多样性并不一致;WU等[8]研究了从浆水中分离得到的发酵乳酸杆菌JL-3对尿酸的降解能力;YAO等[9]通过GC-MS、电子鼻技术,对传统发酵过程中的浆水的挥发性物质进行分析,建立了一种以香气为指标来评价浆水质量的新方法;REHMAT等[10]从浆水中筛选出4株可降解胆固醇的乳酸菌,且其中两株具有良好的耐受胃液和耐受胆盐的能力。可见,分析不同来源传统浆水中微生物菌群组成,对于深度挖掘有益微生物资源具有重要现实意义。但目前有关甘肃兰州地产浆水中微生物组成研究还未见报道。

为此,本试验拟采用经典的平板分离法对兰州浆水中的微生物进行分离纯化,并对分离的乳酸菌、酵母菌进行形态学观察及生理生化鉴定,筛选出发酵性能优良的乳酸菌和酵母菌菌株,并开展模拟浆水发酵验证试验,以期从兰州传统酿造的浆水中寻找优质菌种资源,为实现优良菌株微生态的有效利用奠定良好基础,并为兰州浆水的工业化发展提供理论保障。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基

浆水:甘肃兰州桃海市场市售。培养基:MRS培养基、YPD培养基等。

1.2 乳酸菌、酵母菌的分离

参考程驰新笑等[11]的方法并稍作修改,在无菌条件下吸取适量浆水与无菌生理盐水混合,制成菌悬液后按10倍梯度稀释,将菌悬液涂布于相应的培养基中,并于培养箱中培养48 h后挑选疑似菌落分离纯化2～3次,对单菌落进行编号,并保藏备用。

1.3 优势菌株的筛选

1.3.1 产酸乳酸菌菌株的筛选

生长曲线:参考吕嘉伟等[12]的方法并稍作修改,将初筛的疑似乳酸菌菌株37 ℃培养52 h,每4 h通过酶标仪于600 nm下的吸光度进行测定并记录。

产酸实验:根据ZHENG等[13]、刘珊娜等[14]的方法稍作修改,以5%的接种量将7株菌株接入到装有10 mL MRS液体培养基的离心管中37 ℃培养48 h,每间隔4 h测定其pH值,并通过酚酞指示剂法测定乳酸菌的产酸量,每株菌平行测定3次,结果取平均值。通过酚酞指示剂法测定的产酸量和pH值选出产酸量最强的菌株。

1.3.2 产酯香酵母菌菌株的筛选

参考胡悦等[15]的方法并稍作修改,吸取质量分数5%的发酵液于豆芽汁液体培养基中,并在28 ℃培养48 h。选取健康、无嗜好、无偏食、无变态反应的10名学生组成一个评审组,每天对发酵后的酵母菌发酵液进行外观和气味的测定,并对其进行全面的评估,选出一种产香味良好、持续时间长、无异味的酵母株。

1.3.3 产酸乳酸菌及产酯香酵母菌菌株的风味测定

将筛选出的优良菌株的发酵液采用GC-MS技术进行挥发性成分测定。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学观察及生理生化鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》[16]、《伯杰细菌鉴定手册》[17]、胡此海等[18]的方法对乳酸菌进行形态学和生理生化鉴定。

根据《酵母菌特性及鉴定手册》[19]、刘晓柱等[20]的方法进行酵母菌的形态学及生理生化鉴定实验。

1.4.2 分子生物学鉴定

将所筛选出的优势菌株-乳酸菌、酵母菌菌株送往西安擎科生物科技有限公司进行测序。

1.5 模拟浆水发酵实验

参考姚博等[21]的方法并稍作修改,将125 g小香芹切成小条状,放入适量蒸馏水煮沸30 min后添加20 g玉米面粉,充分混匀过滤并装入锥形瓶中,放入灭菌锅内121 ℃灭菌30 min后,至适温后将所筛选出的优势菌株按照10%的接种量进行浆水的模拟发酵实验。

将筛选出的优势菌株-乳酸菌、酵母菌进行混合发酵时,其中总接种量为10%,将乳酸菌与酵母菌按照5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的接种比进行浆水模拟发酵实验,并对所得发酵液进行感官评价及总酸测定,从而确定发酵过程中的混合菌株接种比。

1.6 模拟浆水发酵实验发酵性能评价

1.6.1 感官评价

挑选10名经过感官培训的食品专业人员,参照姚博等[21]制定的评分标准对浆水发酵液的香味、口感、浑浊度进行评分。

1.6.2 理化指标评价

参考史梅莓等[22]的方法并做修改测定模拟浆水发酵的pH、总酸、还原糖含量。

1.6.3 挥发性风味物质的监测

参考李宏珍等[23]的方法并稍作修改,量取5 g产品发酵液与1 g NaCl放入样品瓶中在40 ℃水浴锅中振荡并充分摇匀30 min,将已经活化的萃取头插入样品瓶中吸附30 min,后将其插入气相色谱仪的进样口中10 min,并进行数据采集分析。

定性分析:GC-MS得出的不同菌种模拟浆水发酵液中的挥发性物质的质谱信息与NIST标准谱库进行比对,通过峰面积归一法进行定量分析,计算出不同菌种模拟浆水发酵液中所测出的挥发性物质的相对百分含量。

1.7 数据处理

Microsoft Excel 2019进行数据统计整理,Origin 2018软件进行绘制图表。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

将浆水样品中所分离出的乳酸菌和酵母菌分别编号,7株乳酸菌的编号为:M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7,3株酵母菌的编号为:J1、J2、J3。具体见图1。

2.2 产酸乳酸菌株的筛选

2.2.1 乳酸菌的生长曲线

如图2所示,0～4 h时,菌株均处于迟滞期,M1、M2、M7在8 h后进入对数生长期,4 h后,M3、M4、M5、M6进入对数生长期,20 h后,M2进入稳定期,其余菌株均在24 h左右进入稳定期。在相同培养时间内,M6对数期比其他菌株的对数期及稳定期更长,更适合作为优势乳酸菌菌株。

2.2.2 乳酸菌的产酸实验结果

如表1、图3所示, 7种菌株均能产酸,但产酸性能差异比较明显,M6的pH值下降最低且下降速率最快,为3.44,产酸量最高,为22.6 g/L。所以M6的产酸性能最优。菌株的产酸能力越强,加入到浆水中进行发酵,发酵时间越短。综上选择M6作为添加菌株并进行后续的乳酸发酵及混合发酵。

2.3 产酯酵母菌株的筛选

对3株酵母菌发酵液进行感官评价时,其颜色和风味特征各异,J1不发生褐变,无明显的异味以及香味不突出;J2并未发生褐变,果香味浓郁并且持久,其风味良好;J3的果香味较淡,也无明显的异味;综上选择J2作为添加菌株进行酵母发酵及混合发酵。

2.4 初筛的2株菌株挥发性成分GC- MS测定结果

研究报道表明甘肃浆水中的主要特征香气物质包括乙酸乙酯、柠檬烯、蒎烯、苯乙醇和乙酸等,发酵过程中微生物的活动及代谢作用使得这些香气物质的产生[21]。J2、M6的GC-MS结果如图4所示。

由图4-a可知,初筛的酵母菌菌株的发酵液中,其乙酸乙酯的含量较高,出峰时间为7.21 min,产量为263.77 μg/mL,并且另一种浆水的主体香气-柠檬烯的的出峰时间是21.93 min,其产量为0.387 μg/mL。由于浆水发酵过程中的主要风味物质-乙酸乙酯、柠檬烯等是对其风味有重要的贡献,故J2发酵液的风味更符合浆水传统酿造过程中所特有的风味。图4-b中,发酵产物中也发现乙酸和苯乙醇,这2种也是浆水的主体成分,其中乙酸出峰时间为29.78 min,其产量为2.93 μg/mL,苯乙醇出峰时间为39.6 min,其产量为2.49 μg/mL。

2.5 乳酸菌M6鉴定结果

2.5.1 乳酸菌M6形态学及生理生化鉴定结果

M6菌落形态学观察为:圆形、白色、光滑、较湿润、半透明、边缘整齐,染色结果为G+,其细胞呈圆形杆状,生理生化鉴定结果如表2所示。

根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》及《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》对菌株进行判断,判断菌株疑似为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

2.5.2 乳酸菌菌株M6分子生物学鉴定结果

将M6的16S rDNA序列在NCBI库当中进行Blast分析比对,并使用MEGA 11软件进行系统发育树构建,结果如图5所示,M6与植物乳杆菌(L.plantarum)在一个分支上面,且序列相似性为100%。结合对M6的菌落形态及细胞形态观察综合分析,确定M6为植物乳杆菌(L.plantarum)。

2.6 酵母菌J2菌株鉴定结果

2.6.1 酵母菌J2菌株形态学及生理生化鉴定结果

对J2进行菌落形态学观察和生理生化鉴定,其形态学观察结果为:圆形、边缘呈绒毛放射状、不透明、纯白、中间凸起、表面褶皱,其细胞呈卵圆形、出芽生殖;J2生理生化结果如表3所示。并根据《酵母菌的特征与鉴定手册》对菌株进行判断,疑似J2为毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。

2.6.2 酵母菌菌株J2分子生物学鉴定结果

将J2的ITS序列在NCBI库当中进行Blast分析比对,使用MEGA 11软件进行系统发育树构建,结果如图6所示,J2与P.kudriavzevii在一个分支上面,且序列相似性为100%;结合对J2的菌落形态及细胞形态观察综合分析,确定J2为毕赤酵母(P.kudriavzevii)。

2.7 模拟浆水发酵试验中混合菌株接种比的确定

2.7.1 感官评价

进行浆水发酵模拟试验的评价标准如表4所示。

在浆水模拟发酵试验中,将筛选出的优势菌株-乳酸菌M6、酵母菌J2进行混合发酵时,按照一定比例接种后获得其浆水发酵液,并按照表4的标准进行评价,其结果如表5所示。

由表5所知,将筛选出的优势菌株进行混合发酵时,不同菌株接种比对浆水发酵液的品质影响不同,其中,混合菌株接种量比例为8∶2时,其感官评价总分最高,接近于原浆水的口感和风味。

2.7.2 总酸含量测定

如表6所示,优势菌株—乳酸菌M6、酵母菌J2的不同接种比进行浆水模拟发酵实验时,其产酸能力不同。当接种量的比例为8∶2时,发酵液的总酸含量较高,与原浆水的酸度类似,并接近于原浆水的口感。当接种量为9∶1时,其发酵液的酸度过高,接近于纯种乳酸发酵。

综合考虑发酵液的感官评价及总酸含量,当优势菌株的接种比为8∶2时,模拟浆水发酵液接近原浆水的口感及酸度,进行模拟发酵的效果最好。因此确定优势菌株—M6、J2的接种比为8∶2,进行后续模拟浆水试验的发酵性能评价。

2.8 模拟浆水发酵实验发酵性能评价结果

2.8.1 感官评价

在浆水模拟发酵试验中,将筛选出的乳酸菌和酵母菌进行乳酸发酵、酵母发酵及其混合发酵实验获得其浆水发酵液,并按照表4的标准进行评价,其结果如表7所示。将筛选出的菌株进行浆水模拟实验时,其感官评价分数分别为8.1、6.8和9.3,其中混合菌株模拟发酵时产品的口感比较酸爽、风味比较优良、接近于原浆水的口味,可知筛出的菌株对浆水发酵时期形成独特风味有重要的贡献作用。

2.8.2 理化指标评价

如图7所示,不同菌株的加入对浆水中的pH、总酸和还原糖都有一定的影响,随发酵时间延长,pH值呈下降状态,总酸以及还原糖的含量均有所上升。

乳酸发酵时,pH是先降低后变得平稳,总酸则是先升高后稳定的,还原糖又呈现先迅速下降接着趋于平缓的趋势。然而,纯乳酸发酵虽然具有乳酸菌特有的甜味,保质期较长,但浆水风味单调,蔬菜容易发生软化。

酵母发酵时,pH总体下降较缓慢,产酸较慢,总酸呈缓慢上升的趋势,还原糖呈现先上升后下降的趋势。当酵母菌纯菌发酵时,产酸较慢,可能会有酒精味的产生,蔬菜褐变软烂,较易腐败。故选定菌株J2进行后续的混菌发酵试验。

进行乳酸菌、酵母菌的混合菌株发酵时,结果表明,随着pH值的降低,总酸的含量也在不断增加,而还原糖的含量先降低后保持不变。混合发酵时所得产品风味良好,风味饱满且醇厚,并且接近于原有浆水的风味。

2.8.3 挥发性物质变化分析

2.8.3.1 不同菌株发酵浆水中挥发性物质分析

为研究模拟浆水发酵实验过程中不同菌株接种的挥发性物质的特征变化,顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术测定模拟浆水发酵液中挥发性成分及相对含量分析,由表8所示,挥发性物质共检出87种,其中酯类(4种)、醛酮类(27种)、烃类(25种)、醇类(26种)、酸类(5种)。

乳酸菌模拟浆水发酵时共检出44种挥发性物质,包括酯类2种,醇类13种,烃类15种,醛酮类12种,酸类2种,其中相对含量较大的化合物为:乙酸乙酯(10.349 6%)、乙醇(6.001 0%)、苯乙醇(9.331 2%)、双戊烯(32.352 7%)、乙酸(20.504 1%)等。

混合菌株接种的发酵液共检出挥发性物质41种,酯类3种,醇类17种,烃类10种,醛酮类9种,酸类2种,其中相对含量较大的化合物为:乙酸乙酯(17.788 2%)、乙醇(3.014 4%)、双戊烯(35.729 6%)、罗勒烯(4.293 3%)、乙酸(19.130 8%)等。

2.8.3.2 不同菌株发酵浆水中挥发性物质变化

醇类作为一种主要的香味物质,它能给发酵蔬菜带来愉悦的香味[24]。模拟浆水发酵过程中,混合发酵的醇类物质多于乳酸发酵,其中检出的醇类物质含量相对较高的2种是苯乙醇、乙醇,苯乙醇具有新鲜的面包香、清甜的玫瑰香;乙醇具有酒香味,在发酵过程中相对含量逐渐升高,可能是乳酸菌的异型发酵不断积累和酵母菌代谢产生,其中以乳酸发酵组的醇类物质相对含量最高。

醛酮类化合物的阈值一般较低,对发酵蔬菜的风味有较大影响,其生成途径是通过热分解、不饱和脂肪酸氧化、氨基酸含量降低等途径[25]。模拟发酵过程中,乳酸发酵组的醛酮类物质的相对含量较少,对浆水中风味物质的形成贡献比较小;在混合发酵过程中,其相对含量较高的是异戊醛、甲基庚烯酮,异戊醛具有水果果香的香气,甲基庚烯酮具有柠檬草般的香气。

由于烷烃具有较高的味阈和较低的相对含量,因此在浆水型风味生成中的作用较小。然而,萜类化合物呈香阈值较低,对浆水风味的形成具有重要作用[26]。模拟发酵过程中,乳酸发酵和混合发酵中,双戊烯相对含量在32%～36%,其相对含量是检出的所有化合物中最高的,主要赋予产品柠檬的香味;在乳酸发酵过程中,反式石竹烯的相对含量也较高,具有淡淡的丁香气味;混合发酵过程中,罗勒烯的相对含量也比较高,具有草香、花香并伴有橙花油气息。

在微生物的作用下,酯类与醇、酸类酯化反应生成的酯类化合物,它是食物中的主要成份,可给予食物甜味和果味。模拟发酵时,乳酸、混合发酵时,检出的酯类物质比较少,其含量较高的是乙酸乙酯,具有强烈的果香、酒香香气、菠萝香和香蕉的香味,对浆水风味的形成具有很大的贡献。

酸类物质在模拟发酵过程中检出的种类较少,其中含量较高的是乙酸。在发酵食品中,酸类物质给食物带来酸味,还可以生成一些香味物质,或者是合成酯类物质的前体[27]。

综上所述,模拟浆水发酵时乳酸发酵和混合发酵的挥发性物质均提供良好呈香特点,其中醛酮类物质主要提供清香、芳香的特点;烃类物质提供柠檬香气、树脂香气;醇类物质主要提供植物香气、酯香;酯类物质主要提供水果香气、酒香香气[28]。虽模拟浆水发酵时两组挥发性物质的组分类别略低于原浆水发酵液,但浆水中的主体风味物质的含量略高于原浆水发酵液。因此,筛选出的优势菌株对浆水发酵过程中所形成的独特风味有重要的贡献作用,通过纯种发酵有望提高浆水的风味和感官品质。

3 讨论

浆水是传统自然酿造酸性调味品,其特殊风味主要来源于物料体系中微生物的菌群代谢活动及共同的发酵作用。因此,传统酿造浆水中存在着多种微生物共同作用。刘阳等[29]研究表明陕西汉中浆水中存在的菌属有9种,包括植物乳杆菌(L.plantarum)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)等。向书娅等[30]采用高通量测序技术测定3个地区的浆水,其优势细菌属均为乳酸杆菌属(Lactobacillus)。胡莹莹等[31]研究发现浆水发酵过程中优势菌群有乳酸菌和酵母菌,包括植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、假丝酵母属(Candida)。

张丽珂等[32]研究发现自然发酵浆水中其优势菌群为乳酸菌和酵母菌,然而,由于原料、地域、生产工艺的多样性,在自然发酵过程中,导致风味的差异。同时,在生产上也有很大的局限性,很难保证产品的质量和规模,也没有相应的质量标准。

李良凤等[33]进行浆水单一菌和混菌的接种发酵,研究发现28 ℃发酵的副干酪乳杆菌(L.paracasei)和皱褶假丝酵母(C.rugosa)组成的复合体系是最优组合。混合菌株发酵实验中,酸化迅速、香味浓郁,而且不容易软化,贮存期延长。

而本文从自然发酵浆水中筛选出产酸能力较强、产酯能力较好的乳酸菌和酵母菌,并将筛选出的菌株进行了浆水的模拟发酵实验,在适宜的发酵条件下,优势菌株迅速成长,有利于发挥抑制杂菌生长的作用。

4 结论

本研究从自然发酵的浆水中分离出7株乳酸菌、3株酵母菌。经生长特性与产酸性能评估筛选得到1株生长特性与产酸性能最佳的M6菌株,其产酸量为22.6 g/L;分离出的3株酵母菌中,J2菌株的产酯能力最强,其乙酸乙酯的含量为263.77 μg/mL。通过形态学观察、生理生化实验及分子生物学鉴定得出,乳酸菌M6为植物乳杆菌(L.plantarum),酵母菌J2为毕赤酵母(P.kudriavzevii)。筛选菌株模拟浆水发酵样品经感官评价、理化指标以及挥发性物质分析,结果表明:M6与J2混合(8∶2)发酵浆水口感酸爽,且接近于原有浆水的风味;样品中共检出挥发性物质87种,其中,乙酸乙酯、双戊烯、乙醇、苯乙醇、乙酸等兰州浆水的主体呈味物质较原浆水均有所提高。说明筛出的M6和J2是兰州浆水中的典型优势菌株,其对浆水发酵过程形成独特风味有重要的贡献,为优良菌株微生态的有效利用奠定良好基础,并为兰州浆水的工业化发展提供理论保障。

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Isolation, identification of dominant strains in a naturally fermented Lanzhou Jiangshui and evaluation on their fermentation characteristics

XU Siya, YUN Jianmin*, GUO Weihong, QU Yuling, ZHANG Wenwei, AI Duiyuan, ZHAO Fengyun

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

ABSTRACT To fully exploit the high-quality microbial resources in naturally fermented Jiangshui, the composition of microbial flora in Lanzhou Jiangshui was analyzed by the classical plate separation culture method.The dominant strains were screened by measuring their growth characteristics and acid-producing properties, and the simulated Jiangshui fermentation was carried out.Results showed that 7 strains of lactic acid bacteria and 3 strains of yeasts were respectively isolated from natural Jiangshui, among them, M6 had the best growth characteristics and acid production capacity, and its acid production reached 22.6 g/L in MRS at 48 h, and J2 had the strongest ester production capacity, its ethyl acetate content was 263.77 μg/mL in bean sprouts extract medium. M6 and J2 were respectively identified as Lactobacillus plantarum and Pichia pastoris by physiological, biochemical identification, and ITS sequencing.The results of Jiangshui simulated fermentation tests demonstrated that the taste of the Jiangshui fermented by the mixed strains was sour and refreshing, its flavor was close to that of the original Jiangshui.A total of 87 volatile substances were detected in the samples by GC-MS.Among them, the characteristic aroma component contents of Lanzhou Jiangshui, such as, ethyl acetate, dipentene, ethanol, phenylethanol, and acetic acid were more than that of the original Jiangshui.It indicated that the two strains M6 and J2 were typical dominant strains in Lanzhou Jiangshui fermentation, which played an important role in forming flavor during Jiangshui fermentation.

Key words Jiangshui;dominant strains;screening;simulated fermentation;quality evaluation

第一作者：硕士研究生(贠建民教授为通信作者,E-mail:yunjianmin@gsau.edu.cn)

基金项目：甘肃省科技重大专项(21ZD4NA016)

收稿日期：2023-12-01,改回日期:2024-01-10

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038134

引用格式：徐斯雅,贠建民,郭伟红,等.兰州浆水优势发酵菌株鉴定及其发酵性能评价[J].食品与发酵工业,2024,50(21):102-111.XU Siya, YUN Jianmin, GUO Weihong, et al.Isolation, identification of dominant strains in a naturally fermented Lanzhou Jiangshui and evaluation on their fermentation characteristics[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(21):102-111.