蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)为菊科多年生草本植物,在我国大部分地区均有分布,干燥全草入药,为一种药食同源药材。蒲公英含有黄酮、酚酸、多糖等多种活性成分,具有清热解毒、消肿散结等作用[1-2]。蒲公英既具有药物属性,又有食用价值,适合开发保健食品,目前其已开发的产品形式有胶囊、口服液、茶、口香糖及饲料添加剂等[3-4]。《中药大辞典》、《中华本草》均指出其味苦,苦味会影响人们的感官体验及产品的深度开发利用。随着人们生活水平的提高,对食品的感官体验要求越来越高,如何改善蒲公英水提液的不适口感显得尤为重要。

微生物发酵具有改善口感,降低苦味,增加活性成分含量等作用[5]。发酵能改善苦荞米营养品质,降低其苦味和酸味,增加咸味[6]。党参黄酒经微生物发酵后,甜味、鲜味氨基酸增加,苦味氨基酸减少,抗氧化能力提升[7]。因此,发酵对改善食品不适口感,增加抗氧化活性有重要作用。目前尚无发酵改善蒲公英水提液感官的相关研究报道。

本研究拟采用单菌、混菌发酵技术,筛选改善蒲公英水提液感官的最佳微生物及其组合,通过单因素及响应面试验确定最佳发酵工艺,利用代谢组学技术解析发酵改善蒲公英水提液感官的分子机制,可为今后蒲公英资源的深度开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英药材,安徽庆春堂药业有限公司,贵州中医药大学药学院生药学实验室王波实验师鉴定为菊科植物蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)的干燥全草;10种食品发酵常用菌:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) CICC 22162、戊糖乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus) CICC 21798、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus) CICC 22171、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) CICC 21809、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) CICC 25079、米曲霉(Aspergillus oryzae) CICC 40786、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CICC 20522、黑曲霉(Aspergillus niger) CICC 41594、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus) CICC 20247、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC 1793,均为冻干菌种,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;Al(NO3)3·9H2O,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaNO2,重庆江川化工(集团)有限公司;NaOH,汕头市西陇化工厂有限公司;芦丁,成都埃法生物科技有限公司;羟自由基(·OH)清除能力检测试剂盒、DPPH自由基清除能力检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Q ExactiveTM HF 质谱仪、Vanquish UHPLC 色谱仪、Sorvall ST 40R离心机,美国赛默飞世尔科技公司;UV2501PC紫外分光光度计,日本岛津公司;SW-CJ-2FD 超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;LDZM-80L-Ⅱ 高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂;LRH-250 生物培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;Aynergy2 酶标仪,成都百乐科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蒲公英水提液制备

称取适量蒲公英,分别用10倍水和8倍水煮沸提取,每次30 min,合并2次滤液浓缩至料液比为1∶10(g∶mL),得蒲公英的水提液。121 ℃灭菌30 min,得蒲公英灭菌水提液。

1.3.2 单菌发酵

10种食品发酵常用菌经活化处理,得到嗜酸乳杆菌(1.0×107CFU/mL)、戊糖乳杆菌(1.6×107CFU/mL)、瑞士乳杆菌(1.7×107CFU/mL)、植物乳杆菌(1.9×107CFU/mL)、嗜热链球菌(1.8×107CFU/mL)、米曲霉(1.5×107个/mL)、枯草芽孢杆菌(2.3×107CFU/mL)、黑曲霉(4.5×107个/mL)、保加利亚乳杆菌(1.6×107CFU/mL)、酿酒酵母(2.7×107CFU/mL)菌液,按2%(体积分数)接菌量分别接入灭菌的蒲公英水提液,摇床培养箱,转速200 r/min、发酵温度25 ℃,培养12 h。离心,取上清液进行感官评价(表1),以口感评价分值及感官评价总分为评价指标。

1.3.3 蒲公英水提液感官评价

参照GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》感官评价要求略有改动,制定蒲公英水提液感官评价标准(表1)。感官评价小组由贵州中医药大学食品质量与安全专业12名师生组成(6男6女),感官评价前进行感官理论、风味、口感、色泽、质地评价培训,要求在感官评价前禁食刺激性食物、避免吸烟等行为,以减少评价误差。

1.3.4 混菌发酵

1.3.4.1 混合菌种拮抗实验

取嗜酸乳杆菌100 μL涂布于MRS培养基表面,将2片无菌滤纸小片置于培养基上,分别吸取2.5 μL戊糖乳杆菌和保加利亚乳杆菌滴在2片滤纸上,37 ℃培养24 h,观察是否出现拮抗反应。

1.3.4.2 混菌发酵

取单菌发酵感官评价排名前3的菌种(戊糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌),按照正交实验3因素3水平试验设计,设置3菌种混合发酵(戊糖乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜酸乳杆菌)比例(体积比,下同)分别为1∶1∶1(1号)、1∶2∶2(2号)、1∶3∶3(3号)、2∶1∶2(4号)、2∶2∶3(5号)、2∶3∶1(6号)、3∶1∶3(7号)、3∶2∶1(8号)、3∶3∶2(9号),将混合菌种接种至灭菌蒲公英水提液,按1.3.2节的发酵条件培养,离心,取上清进行感官评价,以口感评价及感官评价总分为响应值。

1.3.5 单因素试验

选取发酵温度(20、25、30、35、40 ℃)、发酵时间(6、12、18、24、30、36 h)、接菌量(1%、2%、3%、4%、5%)3个因素进行单因素试验,考察其中1个因素时,其他因素以前期预实验中对口感及感官评价分值较高的值为固定值,分别固定为:发酵温度25 ℃、发酵时间12 h,接菌量4%,以水提液口感评分及感官评价总分为响应值。

1.3.6 响应面试验

根据单因素试验结果,选取发酵温度、发酵时间、接菌量3个因素,设计3因素3水平的响应面试验(表2),利用Design Expert V8.0.6 软件的Box-Behnken试验方案进行分析。

1.3.7 总黄酮含量测定

用75%(体积分数)乙醇配制0.2 mg/mL芦丁标准品溶液,参照文献[8]进行标准曲线绘制,采用亚硝酸盐-硝酸铝-氢氧化钠显色法,510 nm处测吸光度值,以标准品浓度为横坐标(C),吸光度值为纵坐标(A),绘制标准曲线,得线性回归方程:A=1.346C-0.013 8,R2=0.999 4。取蒲公英水提液1 mL,510 nm处测吸光度值,以空白试剂作对照,将样品吸光度值代入标准曲线方程得蒲公英水提液总黄酮浓度。

1.3.8 蒲公英发酵液抗氧化活性分析

取发酵前后的蒲公英水提液,参照·OH、DPPH自由基清除能力检测试剂盒操作说明,通过计算自由基清除率,分析蒲公英发酵液的抗氧化活性。

1.3.9 发酵改善蒲公英水提液感官的代谢组学分析

1.3.9.1 代谢物提取

取蒲公英水提液(PST)、发酵液(PFJ)各100 μL置于EP管中,加入400 μL 80%(体积分数)甲醇溶液,离心取上清进行LC-MS分析。

1.3.9.2 液相色谱条件

色谱柱:Hypersil Gold column(C18),柱温40 ℃,流速0.2 mL/min,流动相A,正模式为质量分数10%甲酸,负模式为5 mmol/L醋酸铵;流动相B,甲醇。色谱梯度洗脱程序:98%A,2%B,1.5 min;2%～100%B,3 min;100%B,10 min;100%～2%B,10.1 min;98%A,2%B,12 min。

1.3.9.3 质谱条件

扫描范围选择 m/z 100～1 500,ESI 源的设置如下:喷雾电压3.5 kV;鞘气流速35 psi;辅助气流速10 L/min;离子传输管温度320 ℃;离子导入射频电平60;辅助气加热器温度350 ℃;极性positive,negative;MS/MS 二级扫描为数据依赖性扫描。

1.3.9.4 数据预处理及代谢物鉴定

将数据文件导入CD 3.1软件进行处理,对代谢物进行保留时间、质荷比等参数筛选,通过峰面积分析、分子式预测,得到代谢物鉴定和相对定量结果。数据处理部分基于Linux操作系统(CentOS版本6.6)及软件R、Python展开。

1.3.9.5 代谢物分析

使用KEGG 数据库(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、HMDB数据库(https://hmdb.ca/metabolites)和 LIPIDMaps 数据库(http://www.lipidmaps.org/) 对鉴定到的代谢物进行注释。多元统计分析使用代谢组学数据处理软件 metaX对数据进行转换,进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA),进而得到每个代谢物的 VIP 值。单变量分析部分,基于t检验来计算各代谢物在两组间统计学显著性(P 值),并计算代谢物在两组间的差异倍数即FC值。差异代谢物筛选的默认标准为 VIP>1,P<0.05且FC≥1.2或FC≤0.8。

1.4 数据处理

本研究中的实验数据均以平均数±标准差表示,采用SPSS 22、GraphPad Prism 8软件进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

2.1.1 单菌发酵实验

由图1可知,戊糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的口感及感官评价总分相对较高。前人研究中也报道这3个菌种可用于发酵改善食品风味[9-10]。因此,本研究选用这3个菌种开展混菌发酵实验。

2.1.2 混菌拮抗试验

戊糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌混合培养,培养基未出现抑菌圈,说明这3个菌种可用于蒲公英水提液的混菌发酵。

2.1.3 混菌发酵实验

由图2可知,第5组混菌发酵组合口感及感官评价总分较高。因此,确定第5组的混菌比例即戊糖乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=2∶2∶3为最佳混菌发酵组合。

2.2 单因素试验

由图3-a可知,25 ℃时口感及感官评价总分较高,当温度低于25 ℃时,较低温度抑制微生物生长代谢,导致发酵不充分;当温度高于25 ℃时,微生物生长繁殖活跃,产生的代谢副产物较多,导致发酵液色泽偏暗,口感也较差。由图3-b可知,随着发酵时间延长,口感及感官评价总分先升高后降低,前期发酵时间短,发酵不充分,感官评价分值较低;当超过12 h时后,微生物大量繁殖,导致发酵液中营养物质逐渐消耗,会出现菌体衰亡自溶,导致口感苦味增加[11-12]。由图3-c可知,当接菌量为4%时,水提液口感及感官评价分值较高,接菌量较少时,水提液中的苦味成分不能充分发酵转化为其他小分子物质,导致口感改善效果不佳;接菌量过多时,大量菌体自身代谢产物掩盖了水提液风味,导致口感评价较低。

2.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上,设计3因素3水平的响应面试验,实验结果见表3。

试验数据二次回归分析后,得到关于口感和感官评价总分的回归方程分别为:口感=38.69+3.16A+0.93B+0.73C-0.19AB+0.12AC-0.085BC-5.25A2-3.67B2-1.98C2;感官评价总分=79.07+2.47A+1.02B+1.12C-0.50AB-0.69AC-0.12BC-5.19A2-3.92B2-2.82C2。

由口感及感官评价总分的二次回归方程模型方差分析结果(表4)可知,本研究构建的模型显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),说明模型拟合度高,可靠性好。口感及感官评价总分二次回归方程模型的R2分别为98.89%和分别为97.46%和96.69%,说明得到的回归方程模型回归效果好,可对实验结果进行预测分析。发酵时间(A)、发酵温度(B)对实验结果影响极显著(P<0.01),接菌量(C)对口感及感官评价总分的影响分别为显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。由F值可知,不同因素对口感评价的影响顺序为:发酵时间>发酵温度>接菌量,不同因素对感官评价总分的影响顺序为:发酵时间>接菌量>发酵温度。

经回归方程模型预测,蒲公英水提液发酵最佳工艺参数:发酵时间13.56 h,发酵温度25.57 ℃,接菌量4%,此条件下预测得到的发酵液口感评分39.27分,感官评价总分79.49分。在此最佳发酵条件下,重复3次实验,得到蒲公英发酵液的口感评分39.97分,感官评价总分80.35分,与预测值相比,相对误差分别为1.78%和1.08%,说明该响应面优化试验得到的蒲公英水提液发酵工艺参数准确可靠。

2.4 蒲公英发酵液总黄酮含量分析

按照优化出的最佳工艺参数发酵蒲公英水提液,检测发酵前后总黄酮含量。蒲公英中化学成分较多,黄酮类成分是其主要有效成分之一[13],蒲公英水提液总黄酮含量发酵前后均为1.99 mg/mL,发酵后总黄酮含量未发生显著性变化,说明发酵过程对蒲公英总黄酮含量影响不大。

2.5 蒲公英发酵液抗氧化能力分析

由图4可知,蒲公英水提液对·OH的清除率由发酵前的20.84%增加至发酵后的63.22%,说明蒲公英水提液发酵后对·OH清除能力大幅度提升。DPPH自由基清除率由发酵前的88.12%下降至82.50%,蒲公英水提液发酵后对DPPH自由基清除率虽有一定程度下降,但仍保持较高的抗氧化活性。

2.6 发酵改善蒲公英水提液感官的代谢组学分析

2.6.1 发酵前后代谢物分析

通过对代谢组数据的定性定量分析,共鉴定出1 596种代谢物,其中正离子模式下鉴定出943种,负离子模式下鉴定出653种。

由正离子(图5-a)、负离子(图5-b)模式下的OPLS-DA散点得分图可知,PST与PFJ可明显分为两类,OPLS-DA模型的R2Y和Q2Y数值均大于0.5,且接近1,表明该模型具有可靠的稳定性和预测能力,可以较好的解释两组样本之间的差异。由OPLS-DA排列实验分析,正离子(图5-c)、负离子(图5-d)模式下Q2所在回归线与Y轴截距均小于零(正负离子模式下分别为-0.63、-0.65),表明模型不存在过拟合现象。

2.6.2 发酵前后差异代谢物筛选与分析

通过对发酵前后差异代谢物筛选(默认筛选标准为VIP>1,P<0.05且FC≥1.2或FC≤0.8),共找到616种差异代谢物。

正离子模式下471种(发酵后上调118种,下调353种),负离子模式下145种(发酵后上调76种,下调69种)。差异代谢物主要为有机杂环化合物、苯丙烷类和聚酮类化合物、有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、苯环型化合物等(表5)。

为寻找发酵后引起蒲公英发酵液风味改善的化合物,对发酵前后与甜味、芳香味、苦味相关的代谢物进行了分析(表6)。发酵后,丙氨酸、甜菊双糖甙等甜味成分显著上调,香豆素、2-羟基肉桂酸、6-甲基喹啉、γ-己内酯等香味物质显著上调,儿茶素、牛磺胆酸、表没食子儿茶素等苦涩味物质显著下调。丙氨酸作为一种甜味氨基酸,在发酵酿造玫瑰醋[14]、黄酒[15]过程中显著上调表达,对改善食品风味起到重要作用。本研究中,蒲公英水提液发酵后丙氨酸表达量上调12.4倍,推测其对增加发酵液甜味,改善水提液感官具有一定作用。香豆素、2-羟基肉桂酸均为具有芳香味的天然化合物[16],蒲公英水提液发酵后其表达量分别上调18.03倍和15.46倍,对增加发酵液香味有重要作用。儿茶素被认为是食物中涩味和苦味的重要来源,CHENG等[17]指出在青砖茶发酵过程中,儿茶素含量显著降低,转化为酚酸及儿茶素衍生物,使茶的风味得以显著改善。因此,蒲公英水提液发酵后,苦涩味物质含量的下调,香味及甜味成分的上调,对改善水提液感官具有重要作用。

2.6.3 差异代谢物参与代谢通路分析

通过对差异代谢物参与代谢通路分析(图6),发现负离子模式下,差异代谢物主要参与了嘌呤代谢、酪氨酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸及谷氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、丙酮酸代谢、氧化磷酸化、丁酸代谢等通路。本研究中蒲公英水提液发酵后,嘌呤代谢通路中涉及的鸟苷酸、腺苷酸表达量上调。发酵过程中,微生物会分泌核苷酸酶,导致发酵产物中核苷酸含量增加[18-19],核苷酸是一种重要的鲜味成分[20],因此微生物发酵可增加发酵液鲜味。氨基酸作为一种重要呈味物质,蒲公英水提液发酵后甜味(丙氨酸)及鲜味(天冬氨酸、谷氨酸)氨基酸相关的代谢通路也被富集。酪氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、丁酸代谢通路涉及马来酸、富马酸和琥珀酸的上调表达,这3种有机酸可增强发酵液果香味及酸味。沙棘酵素发酵过程中,也发现马来酸、富马酸和琥珀酸显著上调表达,它们对改善发酵液风味及生物学活性具有重要作用,有机酸还可促进发酵液中黄酮苷转化为易于被机体吸收利用的黄酮苷元[21-22]。

正离子模式下的差异代谢物主要被富集到色氨酸代谢、苯丙烷生物合成、维生素B6代谢、异喹啉生物碱生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、类黄酮生物合成等。苯丙烷生物合成通路中涉及2-羟基肉桂酸、香豆素2种香味成分上调表达,有研究指出雪茄烟叶[23]、大豆蛋白植物饮料[24]发酵后这2种成分上调表达对增加香味及抗菌、抗氧化活性有重要作用。肉桂醛在苯丙烷生物合成通路中下调表达,主要由于发酵过程中肉桂醛降解产生香味物质肉桂酸[25]引起。苯丙氨酸代谢通路中苦味氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)下调,香味成分(2-羟基肉桂酸)上调。谷胱甘肽代谢通路中甜味氨基酸(鸟氨酸)上调,类黄酮生物合成通路中苦涩味成分(表没食子儿茶素)下调。

综上所述,通过对差异代谢物富集代谢通路分析,发现与发酵改善蒲公英水提液感官有关的代谢通路主要富集在嘌呤代谢、酪氨酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸及谷氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、类黄酮生物合成通路中。

3 结论

本研究筛选出蒲公英水提液发酵的最佳菌种组合为戊糖乳杆菌∶保加利亚乳菌杆∶嗜酸乳杆菌=2∶2∶3,最佳发酵工艺:发酵时间13.56 h,发酵温度25.57 ℃,接菌量4%。发酵液具备较高的抗氧化活性(·OH清除率63.22%,DPPH自由基清除率82.50%)。经代谢组学分析,发现发酵后一些苦涩味物质含量下调,香味及甜味成分上调,这对改善蒲公英水提液感官具有重要作用。发酵后与感官改善相关的差异代谢物主要富集在嘌呤代谢、酪氨酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸及谷氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢等通路中。本研究获得了改善蒲公英水提液感官的最佳发酵工艺,在代谢组层面解析了发酵改善水提液感官的分子机制,可为今后蒲公英资源的深度开发利用提供基础资料。

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Process optimization and mechanism study on fermentation of Taraxacum mongolicum water extract

JIN Haijun1, YANG Lingli2, LIANG Jiandong3, GONG Rongying2, XING Yizheng2, WANG Guokai2, CHEN Meijuan2, TIAN Weiyi3*

1(Resource Institute for Chinese &Ethnic Materia Medica, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025, China)2(College of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China)3(School of Basic Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China)

ABSTRACT In this study, single and mixed microbial fermentation techniques were used to screen the optimal microorganisms and their combinations to improve the sensory evaluation of Taraxacum mongolicum water extract.The optimal fermentation process was optimized by one-way and response surface tests, and metabolic pathways related to the improvement of sensory of T. mongolicum water extract were analyzed by metabolomics.The results showed that Lactobacillus pentosus∶Lactobacillus bulgaricus rod∶Lactobacillus acidophilus of 2∶2∶3 was the optimal mixed fermentation combination, and the optimal fermentation process was fermentation time of 13.56 h, fermentation temperature of 25.57 ℃, and inoculation amount of 4%.The fermentation broth has high antioxidant activity (hydroxyl radical scavenging rate of 63.22%, DPPH radical scavenging rate of 82.50%).Through metabolomics analysis, a total of 616 differential metabolites were screened after fermentation, with significant up-regulation of sweet components such as alanine, considerable up-regulation of aroma substances such as coumarin, and significant down-regulation of bitter and astringent components such as catechins, which are related to sensory.These differential metabolites associated with sensory improvement were mainly enriched in metabolic pathways of purine, tyrosine, alanine/aspartic acid, glutamic acid, nicotinic acid and nicotinamide.In this experiment, the optimal fermentation process were obtained to improve the sensory evaluation of T. mongolicum water extract.This study revealed the relevant metabolic pathways of fermentation to enhance its sensory at the metabolome level, which can provide basic information for the deep exploitation and utilization of T. mongolicum resources in the future.

Key words Taraxacum mongolicum;fermentation;process optimization;metabolomics

第一作者：博士,讲师(田维毅教授为通信作者,E-mail:743094997@qq.com)

基金项目：贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2021]131);贵州省科技计划项目(黔科合平台人才-ZDSYS[2023]004)

收稿日期：2024-05-26,改回日期:2024-07-14

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040005

引用格式：晋海军,杨灵丽,梁建东,等.蒲公英水提液的发酵工艺优化及其机制研究[J].食品与发酵工业,2024,50(21):112-120.JIN Haijun, YANG Lingli, LIANG Jiandong, et al.Process optimization and mechanism study on fermentation of Taraxacum mongolicum water extract[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(21):112-120.