生物高分子材料代替合成塑料包装材料生产环保无毒的食品包装材料对食品安全和环境保护有重要的意义[1]。明胶因其优异的成膜性、安全性、低熔点、生物相容性、可生物降解性和气体阻隔性,在可食用包装中应用最为广泛[2]。可食用包装中所采用的明胶主要来源于哺乳动物,如猪、牛等的皮和骨等组织,但由于哺乳动物传染性疾病和政策差异等原因限制了此类明胶在食品中的应用[3]。因此,非哺乳动物来源的鱼明胶替代哺乳动物来源明胶成为一种趋势。我国是淡水鱼的饲养和消费大国,淡水鱼加工过程中产生的大量副产物(如鱼鳞、鱼骨和鱼皮)是制作明胶的良好原料。纯鱼明胶膜多用于水产品和肉制品包装,可通过阻隔气体(O2和CO2)来保持产品色泽,防止脂质氧化和细菌滋生[4]。然而,研究发现鱼明胶的亚氨基酸含量较哺乳动物明胶低,这使纯鱼明胶膜的机械强度、热稳定性、水蒸气阻隔效果较差,湿度敏感性较高且抗氧化活性较差,在一定程度上限制了其应用[5]。近年来,为改善可食鱼明胶膜的产品包装效果,扩大其应用范围,研究人员通过添加具有疏水、抗菌或抗氧化性能的天然大分子物质对鱼明胶膜进行改性[6]。如通过添加天然提取物(如茶提取物[7]、果蔬提取物[8]等)来提高鱼明胶可食膜的抗氧化性。陈宁[9]利用鱼明胶、高酯果胶与姜黄素制备了一种可食性复合膜,通过研究其控释行为,为鱼明胶基复合可食性膜在食品保鲜中的应用提供理论依据。
海藻酸钠作为安全无毒的高分子化合物,亦具有良好的生物相容性、生物降解性、成膜性和持水性,是提升鱼明胶膜性能的理想材料[10]。研究人员将海藻酸钠与鱼明胶混合,制备的复合膜结构致密且均匀、透光性良好,与明胶膜相比,其机械性能和延展性得到了改善[11-12]。为提高明胶基食品包装材料的抗菌性,研究人员通常将抗菌材料与鱼明胶混合制膜。KANMANI等[13]用溶液浇铸法将银纳米粒子添加到明胶基质中,研究结果表明银纳米粒子的添加显著的降低了食源性细菌的细胞活力。虽然,添加金属纳米粒子可有效地提高明胶膜的抗菌性,但由于金属纳米粒子的不可食性,无法应用于可食性抗菌膜中[14]。李鑫等[15]以天然的生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油和百里香精油为改性剂制备具有抗菌性的鱼明胶复合膜,结果表明添加生姜精油、大蒜精油和肉桂精油可有效地提高明胶膜的抗菌性。然而,精油类疏水性物质的添加会导致明胶膜机械性能降低。壳聚糖是一种可吸收降解的环境友好型生物高分子,被认为是最有效的抗菌生物聚合物之一,在生物医学材料和食品等领域具有潜在的应用价值[16]。在中性或碱性条件下,壳聚糖分子中的氨基和羟基官能团被负离子化,导致分子之间的相互作用增强,因此壳聚糖难以溶解在中性或碱性溶液中,只能溶解在酸性溶液中,这大大限制了其应用[17]。通过羧基化反应得到的羧化壳聚糖是一种具有线性大分子结构的水溶性壳聚糖衍生物,室温下即具有较好的溶解能力、高黏度、良好的生物相容性和生物降解性[18]。PAN等[19]利用银纳米粒子和羧化壳聚糖制备纳米复合膜,该复合膜具有良好的抑菌活性。ZHANG等[20]将羧化壳聚糖(carboxylated chitosan,CCTS)包覆在膜表面,制备了具有长效抗菌和抗蛋白质污染性能的纳米铜修饰聚酰胺薄膜复合膜。以羧化壳聚糖为原料制成的羧化壳聚糖-纳米金属粒子膜被应用在生物器件、功能涂层和储能材料中。然而,将其制成可食包装膜的相关研究未见报道。
本研究以鱼明胶、海藻酸钠、羧化壳聚糖为原料,制备三元共混膜,获得一种力学性能良好、具有抑菌性能的可食食品包装膜,并对混合膜机械性能、光学性能及抑菌性能进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼明胶(50目),吉利鼎海洋生物科技有限公司;海藻酸钠(食品级),上海鑫泰食品配料商城;羧化壳聚糖(分析纯)、甘油(分析纯)、PBS,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soya broth,TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soya agar,TSA),北京陆桥技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
外径千分尺(0～25 mm),上海恒兴量具有限公司;MF-1518水平尺,沐丰五金有限公司;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;SHJ-6A磁力搅拌水浴锅,常州金坛良友仪器有限公司;KH-500DE数控超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;TA.XT Plus物性测试仪,英国Stable Micro Systems公司;CR-10色差仪,日本Konica Minolta Optics公司;U-2910双光束分光光度计,日本日立公司;Nicolet 6700傅里叶红外光谱分析仪,美国Thermo Fishe公司;BXM-60VE立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合膜的制备
采用流延成膜制备膜样品,取4.5 g鱼明胶和0.5 g海藻酸钠于100 mL水中,添加(0、0.5、1、1.5、2、2.5 g)羧化壳聚糖,另设置鱼明胶溶液(4.5 g/100 mL)作为对照组,具体配比如表1所示。将混合液置于30 ℃水浴锅中,磁力搅拌4 h。加入质量分数为3%的甘油作为增塑剂,磁力搅拌3 min混匀。再将混合液于70 ℃水浴锅中磁力搅拌40 min后,超声消泡30 min,取10 g经超声脱气的成膜溶液倒入90 mm×90 mm的塑料培养皿中,置于50 ℃干燥箱中干燥10 h,制得复合膜样品,在倒膜和干燥过程中用水平尺辅助确保膜液水平放置,可以均匀成膜。烘干后所有复合膜样品均放置在相对湿度为50%的干燥皿中平衡48 h后揭膜。
表1 复合膜各组分配比 单位:g/L
Table 1 The ratio of each component of the composite films
样品组别鱼明胶质量浓度海藻酸钠质量浓度羧化壳聚糖质量浓度145002455034555445510545515645520745525
1.3.2 复合膜厚度的测定
参照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度测定 机械测量法》,使用千分尺测膜的厚度,每个膜样选取10个不同的测量点,计算复合膜厚度的平均值。
1.3.3 复合膜含水率和溶解率的测定
参照KCHAOU等[21]的方法测定膜的含水率(moisture content, MC)。称取50 mg的样品,置于干燥至恒重的称量瓶中称重后,放在105 ℃烘箱中干燥至恒重,再次称重。膜MC的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:m1,膜样品质量,g;m2,样品干燥前称量瓶与样品的总质量,g;m3,干燥后称量瓶和膜的总质量,g。
参照RUBILAR等[22]的方法测定膜的溶解率(water solubility, WS)。取1 cm×1 cm膜样品置于105 ℃烘箱中干燥至恒定质量后,将膜浸没在足量的去离子水中,室温浸泡,磁力搅拌24 h后过150目筛,收集未溶解样品,在105 ℃条件下再次干燥至恒重。WS的计算如公式(2)所示:
(2)
式中:m0,膜初始干燥至恒重后质量,g;m,膜剩余未溶解部分干燥至恒重后质量,g。
1.3.4 复合膜水蒸气透过性的测定
参照GB/T 1037—2021《塑料薄膜与薄片水蒸气透过性能测定 杯式增重与减重法》测量膜的水蒸气透过性(water vapor permeability, WVP)。将无水CaCl2颗粒研磨成粉末,取适量CaCl2放入小称量瓶(25 mm×25 mm,直径×高度)中,在105 ℃条件下干燥至恒重。取略大于瓶口直径的无损膜样品附着于瓶口,用石蜡密封膜样品边缘,使得称量瓶内部相对湿度为0%,迅速称量初始称量瓶的质量,将其放入底部盛有蒸馏水的密闭玻璃容器中,环境温度保持26 ℃。每隔一段时间测量一次称量瓶的质量,直至玻璃杯的质量增加率在5%以内,停止测量,记录质量。样品WVP的计算如公式(3)所示:
(3)
式中:Δm,质量增加量,g;d,膜的厚度,mm;A,封口膜的面积,m2;t,称量杯杯质量变化的时间,h;ΔP,膜两侧的饱和水蒸气压力差,实验温度为26 ℃,经过查表,ΔP取值为3.364 kPa。
1.3.5 复合膜抗拉强度和断裂伸长率的测定
参照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测试 第3部分:薄膜和薄片的试验条件》,用质构仪测定膜样品的抗拉强度(tensile strength, TS)和断裂伸长率(elongation at break, EAB)。取无损坏、质地均匀的膜样品,将其裁剪成20 mm×50 mm条状,使用A/MTG探头,参数设置为:探头手柄间距30 mm,测试前速度1 mm/s,测试速度1 mm/s,测试后速度5 mm/s,促发力为5 g。测试时,仅记录膜样在中间断裂的结果,膜样于夹具处断裂不计入有效结果,每个膜样品测试3次。膜的TS和EAB的计算如公式(4)和公式(5)所示:
(4)
式中:Fmax,膜样品断裂时所受到的最大负载,N;A1,膜样品的横截面面积,m2。
(5)
式中:L,膜样品断裂时的拉伸长度,mm;L0,膜样品的初始拉伸长度,L0=30 mm。
1.3.6 复合膜颜色的测定
使用色差仪测定膜样的颜色性质,通过L*(亮度),a*(红/绿),和b*(黄/蓝)3个参数来表示膜样品颜色差异。每个膜样品,以标准白板为底选取10个不同的测量点进行测量。标准白板的各项数值为:L*=88.6,a*=1.0,b*=-4.8。
1.3.7 复合膜透光率与不透明度的测定
使用紫外可见分光光度计测量膜样品的不透明度(opacity)和透光率[23]。读取膜样品在600 nm下的吸光度,以计算膜样的不透明度,其计算如公式(6)所示:
(6)
式中:A600,膜在600 nm处的吸光度;d,膜样的厚度,mm。
将膜样于紫外可见分光光度计中,进行200～800 nm全扫描,测试膜的透光率,以280 nm处透光率评估膜的抗紫外性能。
1.3.8 复合膜全反射红外光谱分析
参考郭开红等[24]的方法,使用全反射红外光谱分析仪分析复合膜中各组分间的相互作用。取出在含有硅胶的干燥器中干燥48 h的膜样品,放入样品室,红外的波数范围设置为4 000～670 cm-1,分辨率设置为4 cm-1,对平衡后的膜样品进行扫描后分析膜的傅里叶变换红外光谱图。
1.3.9 复合膜抑菌性能测定
将普通大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC25922)菌株接种至10 mL胰酪大豆胨液体培养基中,在37 ℃振荡培养8 h(180 r/min),将菌液用0.1 mol/L硝酸盐缓冲溶液稀释到104 CFU/mL。将膜样品剪裁为1 cm×1 cm大小,紫外消杀3 h,其余实验所用物品均在121 ℃灭菌20 min。取10 μL菌液于膜样品上,取另一片膜样品覆盖,将2片夹着菌液的膜样品完全贴合,确保菌液无遗漏,2 h后将其放入10 mL的0.1 mol/L的硝酸盐缓冲液中,涡旋1 min,使2片膜样完全分离,将溶液混合均匀。取100 μL的混合液,涂布于胰蛋白胨大豆胨平板上,37 ℃,培养24 h,记菌落数,复合膜抑菌活性的计算如公式(7)所示:
抑菌活性
(7)
式中:n1,对照组菌落数;n2,复合膜组的菌落数。
1.3.10 数据分析
使用SPSS软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA),并通过Duncan多重范围检验确定每个平均值的显著性,当P<0.05被视为具有统计学意义。采用Origin软件作图。
2 结果与分析
2.1 复合膜厚度、含水率和水溶解度分析
膜的厚度、含水率和水溶性如表2所示,膜厚度的均匀性影响膜的透明度、水蒸气透过性、拉伸强度等性能。随着羧化壳聚糖加入量的升高,复合膜的厚度随之增加,且膜厚度较为均匀。与纯鱼明胶膜相比,在加入海藻酸钠后,复合膜的含水率略增加,但是随着羧化壳聚糖的添加量增大,复合膜的含水率逐渐降低。同时,复合膜的水溶性较纯鱼明胶膜显著降低,尤其是在添加的羧化壳聚糖在质量浓度较低(5 g/L)的情况下,复合膜的溶解度达到最低值。随着羧化壳聚糖的添加量增大,复合膜的水溶性存在逐步提高的趋势,推测导致该现象的原因是羧化壳聚糖与鱼明胶之间形成更大的静电复合物,羧化壳聚糖随即更容易暴露出亲水基团,反而增加了复合膜的溶解度。但是复合膜的溶解度最大的组别也显著低于纯鱼明胶膜。陈善飞等[25]的研究表明,大分子物质之间共混会发生强烈的氢键结合,形成的新大分子物质溶解性下降,导致共混膜的阻水性相较于单一膜的阻水性增强,与本实验研究结果一致。
表2 不同组别复合膜厚度、含水率和溶解度
Table 2 Thickness, moisture content and solubility of composite films
样品组别膜厚度/μm含水率/%溶解度/%190.50±7.25e22.13±1.87ab64.02±0.75a292.70±7.91de24.11±2.23a37.29±0.48b395.00±9.43de20.21±0.64bc30.24±2.05d499.50±7.62cd19.51±1.05c32.79±2.77cd5106.0±9.07c18.83±0.56c34.66±1.86bc6114.5±8.32b16.03±0.91d34.48±3.11bc7128.5±10.56a14.70±0.36d37.98±2.92b
注:不同上标小写字母表示同列的数据间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 复合膜水蒸气透过性分析
膜材料的水蒸气透过性可用来表征膜材料的阻水性能。水蒸气透过性越低表明水蒸气越不易透过膜,膜的阻水性越好,作为包装材料其防潮的能力越强,有利于延长食品的货架期。各组别的复合膜水蒸气透过性大小如图1所示。复合膜水蒸气透过性较单一的纯鱼明胶膜而言均有所降低。当添加的羧化壳聚糖含量为5 g/L时,水蒸气透过性达到最低值。海藻酸钠和鱼明胶在混合反应后,相互之间形成大量的氢键,复合膜呈现致密的结构,其水蒸气透过性降低[24]。但是,随着羧化壳聚糖的添加,膜的厚度增加,导致其与鱼明胶的结合较为疏松,使水蒸气透过性逐渐增大。
图1 复合膜的水蒸气透过性
Fig.1 Water vapor permeability of composite films
注:不同上标小写字母表示同列的数据间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 复合膜机械性能分析
在食品包装、运输和销售过程需要包装材料拥有较强的机械性能,本文评价了复合膜的抗拉强度和断裂伸长率,其具体变化如图2所示。其中,纯鱼明胶膜的抗拉强度最低(2.21±0.14) MPa,但是其断裂伸长率最高为(214.02±4.95)%。加入海藻酸钠共混后的复合膜抗拉强度提高,但是断裂伸长率降低,随着羧化壳聚糖的添加量增大,复合膜的抗拉强度显著提高,而断裂伸长率显著降低,当羧化壳聚糖的添加量为25 g/L时,复合膜抗拉强度达到最大(17.18±0.55) MPa,断裂伸长率达到最低(28.96±3.4)%。由图2可知,各组别复合膜的抗拉强度较纯鱼明胶膜均有显著提升。陈丽等[26]用褐藻胶和鱼皮明胶制成的复合膜的抗拉强度较纯鱼皮明胶膜也有很大提高,复合膜中的海藻酸钠、羧化壳聚糖与明胶之间发生相互作用,形成了更加致密的复合结构,进而导致复合膜的力学性能增强,更适用于作为食品包装材料。
图2 复合膜的抗拉强度和断裂伸长率
Fig.2 Tensile strength and elongation at break of composite films
2.4 复合膜颜色与不透明度分析
以标准白板为对照(L*=88.6,a*=1.0,b*=-4.8)测得的复合膜的颜色指标和不透明度如表3所示,随着海藻酸钠和羧化壳聚糖的加入,复合膜的L*值和a*值与纯鱼明胶膜相比呈现下降趋势,b*值升高,同时复合膜的不透明度上升。这归因于羧化壳聚糖、海藻酸钠和鱼明胶在高温共混时发生了美拉德反应,产生了美拉德反应产物,这类物质降低了复合膜的亮度,同时使复合膜颜色变黄,透明度下降[27]。复合膜作为包装材料时,其透明度和颜色将直接影响消费者的购买意向。本实验所有组别的复合膜L*值都在86以上,同时a*值、b*值均无太大变化,整体都呈现较为透明的状态。
表3 复合膜的颜色和不透明度
Table 3 The color and opacity of the composite films
组别L*a*b*不透明度188.72±0.13a0.67±0.05a-3.56±0.12g0.49±0.04d288.63±0.24a0.62±0.04b-3.38±0.19f0.54±0.02cd388.03±0.11b0.52±0.05c-3.09±0.12e0.57±0.02c487.74±0.10c0.48±0.04d-2.69±0.12d0.59±0.03c587.66±0.07cd0.43±0.04e-2.15±0.12c0.66±0.02b687.61±0.10d0.41±0.03e-1.69±0.07b0.71±0.02b786.88±0.08e0.31±0.03f-0.79±0.07a0.86±0.05a
2.5 复合膜透光率分析
复合膜的紫外透射光谱如图3所示,纯鱼明胶膜在200～280 nm处即具有较低的透光率,但在可见光的波长范围内,随着波长增大,透光率逐渐增大。明胶-海藻酸钠基底膜较纯鱼明胶膜在200～800 nm范围内透光率均略有降低。而随着羧化壳聚糖的加入,复合膜的在200～280 nm范围内透光率显著降低,抗紫外性能显著增强。这种现象与海藻酸钠、羧化壳聚糖和明胶高温共混时发生了美拉德反应、生成有较强紫外吸收的产物有关[27]。此外,单一组分的膜质地均匀,表面光滑使得其透光率较高,而复合膜在成膜液共混时,形成的粒子粒度不同,成膜时粒子沉降速度不一、分布不匀,也会降低复合膜的透光性[28]。同时,膜的透光率也是判断共混高分子相容性优劣的手段之一。研究人员发现如果复合膜中的分子相容性太差,则会由于在两相界面上的光散射或反射而使膜的透光率降低[29]。本文中,在600 nm处,测得各组别复合膜的透光率均大于75%,表明复合膜透明度较高,复合膜中各组分相容性较好。
图3 复合膜的透光率
Fig.3 Transmittance of composite films
2.6 复合膜的傅里叶变换红外光谱分析
复合膜的傅里叶红外光谱图如图4所示,其中纯鱼明胶膜在3 322 cm-1处出现较宽的吸收峰是由—NH和—OH的拉伸振动引起的,即酰胺A带,2 938 cm-1和2 878 cm-1附近的峰值是由烷烃C—H拉伸振动引起[30]。1 645、1 554、1 243 cm-1处的吸收峰分别是酰胺Ⅰ带(C
O伸缩振动)、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带(N—H弯曲振动和C—N拉伸振动)引起的[31]。与纯鱼明胶膜相比,鱼明胶、海藻酸钠基底膜的—NH和—OH的拉伸振动发生在3 315 cm-1,酰胺A带的特征峰向低波数移动,即表明蛋白质-多糖的分子间的氢键作用力增强。因此,鱼明胶和海藻酸钠共混时形成了新的氢键。在鱼明胶-海藻酸钠膜基础上添加的羧化壳聚糖含量为分别为5 g/L和25 g/L时,—NH和—OH的拉伸振动发生在3 305 cm-1和3 288 cm-1,酰胺A带特征峰逐渐向低波数移动,说明随着羧化壳聚糖的添加,复合膜中各组分之间的形成了更多的氢键,各组分的相互作用力增强。这与2.1节分析结果一致。
a-组别7;b-组别3;c-组别2;d-组别1
图4 复合膜的傅里叶红外光谱图
Fig.4 FTIR spectra of a composite film
2.7 复合膜抑菌性能分析
复合膜抑菌结果如图5所示,随着添加的羧化壳聚糖含量越高,复合膜的抑菌性能越强。当羧化壳聚糖添加量为10 g/L时,复合膜就有明显有效的抑菌性能,为37.62%,当羧化壳聚糖添加量为25 g/L时,对大肠杆菌的抑制率达到最大为60.43%。即羧化壳聚糖的含量越高,复合膜的抑菌性能越好,两者呈正相关。这表明鱼明胶、海藻酸钠与羧化壳聚糖三者的生物相容性良好,可以有效的发挥羧化壳聚糖的抑菌作用。同时,研究表明能够在一段时间内将微生物浓度降低30%的材料可作为有效的抑菌包装材料[32]。由图可知,羧化壳聚糖添加量为10 g/L时,即可满足抑菌包装材料的要求。
a-组别1;b-组别2;c-组别3;d-组别4;e-组别5;f-组别6;g-组别7
图5 复合膜的抑菌性能
Fig.5 Antibacterial properties of composite films
3 结论
本文以鱼明胶、海藻酸钠为基底,添加羧化壳聚糖共混,评价鱼明胶基可食抗菌膜的各项性能。随着海藻酸钠和羧化壳聚糖的添加,复合膜的厚度增加、含水率先增大后减小,水蒸气透过性和溶解度先减小后增加,拉伸强度增加而断裂伸长率减小,透明度下降而抗紫外性能增强,抑菌性能增强。通过傅里叶红外技术对其结构进行分析,发现鱼明胶、海藻酸钠和羧化壳聚糖之间存在较强的相互作用。综上,以45 g/L鱼明胶和5 g/L海藻酸钠为基底,羧化壳聚糖添加量为10 g/L制成的三元共混膜,含水量相对较低为19.51%,同时具有较低溶解度32.79%,且具有明显的抑菌性能37.62%,复合膜较为透明,可作为食品内包装材料。
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