我国猕猴桃资源丰富,其种植面积和产量均位于世界第一[1],猕猴桃富含多种营养物质,如维生素、糖类、蛋白质、氨基酸、酚类物质、膳食纤维和多种矿质[2-3],其口味酸甜适宜,风味独特,因此大受消费者欢迎,但猕猴桃在储藏过程中极易迅速变软,腐烂变质,目前多将其制成果汁,但加工过程中会产生较多的副产物,副产物往往得不到充分利用,造成二次浪费及环境污染,而将其加工成猕猴桃粉可以充分利用猕猴桃,大大提高其利用率,同时可以极大程度保留其活性成分且更易储存,从而扩大其应用范围,拥有巨大的市场潜力。
近年来,我国经济的迅猛发展改变了人们的饮食习惯及生活方式,营养的过量摄入和代谢的降低导致了脂肪在体内堆积,促使高血脂症人群不断增加,造成脂质代谢紊乱,是人类心脑血管疾病、二型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病的主要诱因[4-5],严重威胁人体健康。现在可用于降脂的药物均存在一定的副作用,如他汀类药物对肌肉及消化系统造成损害[6],烟酸可能导致高血糖症和肝脏损伤[7],贝特类药物可能损伤骨骼肌、肾脏或肝脏[8]。因此,仍急需开发安全无副作用的天然降脂健康食品。
目前,对猕猴桃的生物活性研究多集中在其营养成分的抗氧化[9]、抗肿瘤[10]、增强人体免疫力[11]等方面,降脂方面的研究多集中在猕猴桃汁[12-13]及其提取物的降脂作用[14-15],未见关于猕猴桃果粉降血脂的相关报道。因此,本文将通过建立高脂饮食动物模型,探究猕猴桃果粉对实验性高血脂症小鼠降脂作用及其作用机制,以期为猕猴桃果粉作为治疗高血脂辅助健康食品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苏木精、伊红,武汉塞维尔生物科技有限公司;总甘油三酯试剂盒、总胆固醇试剂盒、天冬氨酸转氨酶试剂盒、丙氨酸转氨酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒,南京建成生物工程研究所;TNF-α炎症因子试剂盒、瘦素试剂盒、IL-1β炎症因子试剂盒,上海科艾博生物有限公司。
1.2 仪器与设备
RM2016转轮式切片机,德国徕卡公司;JT-12S全自动脱水机,武汉俊杰电子有限公司;BMJ-A包埋机,常州郊区中威电子仪器厂;RS36全自动染色机,常州派斯杰医疗设备有限公司;BA210Digital数码三目摄像显微镜,麦克奥迪实业集团有限公司;动物手术器械,上海医疗器械批发部。
1.3 实验方法
1.3.1 动物实验设计
40只小鼠,随机分为5组,每组8只,试验周期为13周,探究猕猴桃果粉对实验性高血脂症小鼠的降脂作用。猕猴桃果粉的灌胃剂量参考文献[16-18]的方法进行设计。
高脂饲料组(MD):高脂饲料喂养。低剂量猕猴桃果粉灌胃组(LFP):高脂饲料喂养,同时每天灌胃低剂量猕猴桃果粉溶液(100 mg/kg体重)。高剂量猕猴桃果粉灌胃组(HFP):高脂饲料喂养,同时每天灌胃高剂量猕猴桃果粉溶液(500 mg/kg体重)。辛伐他汀阳性对照组(BK):高脂饲料喂养,同时每天灌胃辛伐他汀溶液(4 mg/kg体重)。空白组(PC):正常饲料喂养。
1.3.2 小鼠体重、饮食、饮水变化
在实验周期13周内,观察小鼠饮食和饮水的变化,记录小鼠体重。
1.3.3 葡萄糖耐受量测定
13周灌胃处理结束后,对实验小鼠禁食12 h,禁食期间不禁水,之后按照2 g/kg体重的葡萄糖溶液用量对实验小鼠进行灌胃。分别在0、30、60、90、120 min对实验小鼠尾部减尾巴处理,进行静脉取血,采用血糖仪测量各个时间点所采血样的血糖值,绘制血糖曲线。
1.3.4 样品采集与处理
葡萄糖耐受实验结束后,对实验小鼠进行48 h恢复期培养,晚上对实验小鼠进行禁食不禁水处理。之后对实验小鼠进行摘除眼球取血,取得的血液样本进行自然凝血,4 ℃、3 000 r/min离心30 min;取各组上清液,保存于-80 ℃冰箱中。取血完毕后,采用颈椎脱臼方式处死小鼠,解剖处死小鼠,完整提取小鼠肝脏、脾脏、肾脏、盲肠等组织,按照实验小鼠组别分别称质量并记录,再分割后按照不同实验分别保存,染色于常温下保存于染色所用固定液中,理化及生化指标检测样本保存于-80 ℃冰箱中。
1.3.5 血清生化指标测定
血清样品保存于-80 ℃冰箱中,测定前先在4 ℃下自然解冻,避免反复冻融,然后采用试剂盒对小鼠血清样品的生化指标进行测定。
1.3.6 肝脏组织生化指标测定
去除小鼠肝脏表面脂肪,取100 g肝脏组织,加入900 mL冰生理盐水,用组织研磨机研磨、离心后,取上清液,即得10 g/mL肝脏组织溶液。
采用试剂盒测定肝脏组织溶液生化指标。
1.3.7 肝脏组织病理学观察
观察方法:苏木精-伊红染色、油红O染色。
1.3.8 数据分析
数据表示为平均值±标准差表示,相关图形采用Origin 2018软件绘制,使用SPSS 19进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠体重的影响
如图1所示,经过13周的小鼠高脂模型塑造, MD组小鼠体重达(47.77±0.723 2) g,显著高于其他组小鼠体重(P<0.05),说明高脂模型塑造成功;LFP组、HFP组和PC组小鼠体重分别为(31.098±1.309 1)、(30.276±0.729 3)、(28.08±0.588 1) g,LFP和HFP组与PC小鼠体重有显著差异但最为接近,且灌胃猕猴桃果粉组小鼠体重显著低于BK组,体重是评估功能性食品是否具有降脂减肥功效的最关键指标[19],说明猕猴桃果粉具有一定的降脂减肥功效。
图1 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠体重的影响
Fig.1 Effects of kiwi fruit powder on body weight of high-fat reared mice
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠脏器指数的影响
高脂模型塑造结束后,将小鼠处死,对其肝脏、肾脏、脾脏等进行称重。由图2-a肝脏指数图可知,MD组肝脏指数显著高于其他各组(P<0.05),说明MD组实验小鼠可能存在一定程度的脂肪肝。LFP、HFP、BK和PC组之间肝脏指数无显著差异(P>0.05),这可能是由于猕猴桃果粉和辛伐他汀类药物有效控制了高脂饮食条件下小鼠肝脏中的脂肪堆积。
a-肝脏指数;b-肾脏指数;c-脾脏指数
图2 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠脏器指数的影响
Fig.2 Effect of kiwifruit fruit powder on organ index of high-fat reared mice
由图2-b可知,5个处理组的肾脏指数无显著差异。由图2-c可知,HFP组和PC组脾脏指数无显著差异(P>0.05),但显著高于其余3组(P<0.05),这可能是由于脾脏质量占小鼠总重较少,而MD组小鼠体重较大,反而扩大了分母,导致PC组和HFP组脾脏指数较高。
综上所述,长期摄入过量脂肪,会导致脂肪堆积在小鼠肝脏处,提高小鼠患高血脂症的风险,但灌胃猕猴桃果粉能够减轻脂肪在肝脏处的堆积,从而对健康起到一定的积极作用。
2.3 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠葡萄糖耐受量的影响
对小鼠进行灌胃葡萄糖实验,旨在探明在经过长期高脂饮食后,小鼠机体对血糖的代谢能力。由图3可知,口服葡萄糖溶液后,各组小鼠的血糖值均快速上升,且15 min时,血糖值达到最大;MD组小鼠血糖上升最快,血糖最大值为(21.8±1.005) mmol/L,高于其他组;HFP组小鼠血糖上升最慢,血糖最大值最低。随着时间的增加,各组小鼠血糖值均出现下降,待血糖稳定后,MD组血糖值最高,HFP组血糖值最低,说明长时间的高脂饮食造成MD组小鼠肥胖,体内脂肪细胞增生、肥大,代谢产物增多,降低了骨骼肌对胰岛素的敏感性,从而导致机体产生胰岛素抵抗[8],进一步将会诱导糖基化,引发多种代谢类疾病;而灌胃高剂量猕猴桃果粉的HFP组血糖调节能力最好,说明猕猴桃果粉能够改善胰岛素抵抗的状态,降低血糖峰值及血糖稳定值,从而降低多种代谢疾病发生的可能性。
图3 口服葡萄糖后血糖变化情况
Fig.3 Changes in blood glucose after oral glucose
2.4 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠血清生化指标的影响
血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)含量和甘油三酯(triacylglycerol,TG)含量是判断高血脂症的重要指标,高血脂症患者由于体内脂肪代谢和转运障碍,体内的TC和TG含量明显增高,且与心血管疾病的发生有密切关系。如图4-a、图4-b可知,MD组的TC、TG含量显著高于其他各组(P<0.05),说明高脂建模成功。在TG水平上,LFP组和HFP组的TG含量均显著高于PC组(P<0.05),但HFP与BK组无显著性差异(P>0.05);在TC水平上,HFP组与PC组无显著性差异(P>0.05)。综上所述,在灌胃猕猴桃果粉后,实验小鼠体内TC、TG含量均有一定程度的降低,且呈量效关系,说明猕猴桃果粉能够降低血清胆固醇水平,在一定程度上降低高脂血症的患病风险。
a-TG;b-TC;c-LDL-C;d-HDL-C;e-ALT;f-AST
图4 猕猴桃果粉对血清生化指标的影响
Fig.4 Effect of kiwifruit fruit powder on serum biochemical indexes
高血脂症患者体内除去TC、TG含量升高,还常常伴随着高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的降低和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的升高。LDL-C易透入动脉内膜细胞,使胆固醇在动脉积累,导致动脉粥样硬化;而高密度脂蛋白能够将沉积在动脉中的胆固醇转运出体外,具有清洁血管的作用[20]。如图4-c、图4-d可知,MD组LDL-C和HDL-C水平与其他组均存在显著性差异(P<0.05),LFP、HFP组与PC组LDL-C含量无显著性差异(P>0.05),HFP组LDL-C含量较低;LFP组、HFP组HDL-C含量均显著高于PC组(P<0.05),HFP组HDL-C含量略高于LFP组。综上所述,长期高脂饮食使小鼠体内加速脂肪分解,同时抑制自身脂质代谢,使体内积累大量脂肪酸,最终导致小鼠产生代谢紊乱,表现为小鼠生化血清指标的异常,灌胃猕猴桃果粉后,实验小鼠体内的HDL-C和LDL-C含量均得到改善,且呈量效关系,说明猕猴桃果粉具有改善脂质代谢的作用。
天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)和丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)是判断肝脏受损情况的2项重要指标,ALT和AST存在于细胞线粒体中,人体在正常情况下,血液中ALT和AST的含量是比较低的,当肝细胞受损后,ALT和AST就会被释放到血液中,导致二者含量升高。如图4-e、图4-f所示,MD组ALT和AST含量均显著高于其他组(P<0.05),说明长时间高脂饮食,造成了实验小鼠一定程度上的肝损伤;与PC组相比,HFP组的ALT和AST含量无显著性差异(P>0.05),说明灌胃猕猴桃果粉后,能够减轻小鼠肝损伤,因此,猕猴桃果粉对高脂饮食导致的肝损伤具有一定的改善作用。
综上所述,对于长期高脂饮食的人群,猕猴桃果粉具有降低血清胆固醇水平、改善脂质代谢、减少肝脏损伤的作用。
2.5 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠肝脏生化指标的影响
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可以作用于超氧阴离子自由基,歧化转变为H2O2和O2,进而降低超氧阴离子自由基水平;而H2O2可以进一步由过氧化氢酶(catalase,CAT)进行分解,二者均可以增强机体抗氧化水平,从而抑制机体脂质过氧化反应,降低炎症因子水平,进而改善机体脂质代谢[21]。如图5-a、图5-b所示,MD组小鼠肝脏匀浆中SOD和CAT水平显著低于其余各组(P<0.05),LFP、HFP组、和PC组小鼠肝脏匀浆中SOD和CAT含量由高到低排序为PC组>HFP组>LFP组,说明猕猴桃果粉具有抑制机体脂质过氧化,保肝护肝的作用,且呈量效关系。
丙二醛(malonaldehyde,MDA)是机体脂质过氧化反应过程中形成的产物之一,同时也是细胞氧化损伤的指标之一,有研究表明,肥胖患者体内的MDA含量较高[22]。如图5-c所示,MD组小鼠肝脏匀浆中MDA含量显著高于其余各组(P<0.05),LFP、HFP及PC组MDA含量由高到低排序为LFP组>HFP组>PC组,说明长时间高脂饮食降低体内抗氧化酶活力,同时MDA水平升高,灌胃猕猴桃果粉后,小鼠体内MDA水平下降,因此,猕猴桃果粉能够降低肝脏损伤,改善人体健康,且呈量效关系。
a-SOD;b-CAT;c-MDA;d-GSH-Px
图5 猕猴桃果粉对肝脏生化指标的影响
Fig.5 Effect of kiwifruit fruit powder on liver biochemical indexes
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)是机体内能够分解过氧化物的重要酶物质,可以起到保护肝细胞、改善肝功能的作用。如图5-d所示,MD组小鼠肝脏匀浆中的GSH-Px含量显著低于HFP与PC组(P<0.05),且在5组中为最低,HFP组小鼠肝脏匀浆中GSH-Px含量与PC组存在显著性差异(P<0.05),但高于BK组和LFP组,说明猕猴桃果粉能够促进机体过氧化物发分解,减少肝脏损伤,且呈量效关系。以上结果与2.4节血清生化指标结论相符。
2.6 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠体内瘦素和炎症因子含量的影响
瘦素由脂肪组织分泌,血清中瘦素的含量与脂肪组织的大小成正比,大多数肥胖症患者体内瘦素水平较高,并伴有瘦素抵抗。由图6-a可知,MD组小鼠肝脏匀浆中瘦素含量显著高于其余各组(P<0.05),LFP组小鼠肝脏匀浆中瘦素含量显著高于PC组(P<0.05),但HFP和PC组无显著性差异(P>0.05),结合2.1节体重试验结果,说明高脂喂养小鼠会造成小鼠肥胖,灌胃猕猴桃果粉后,瘦素水平得到了有效的降低,改善了小鼠肥胖,且具有明显的量效关系。
a-瘦素;b-1L-1β;c-TNF-α
图6 猕猴桃果粉对小鼠体内瘦素和炎症因子含量的影响
Fig.6 Effects of kiwifruit fruit powder on leptin and inflammatory factor content in mice
炎症反应与高血脂症关系密不可分,目前研究认为动脉粥样硬化也是一种慢性炎症疾病[23],可以用标志性的细胞炎症因子1L-1β和TNF-α来判断脏器受损情况。由图6-b、图6-c所示,MD组小鼠肝脏匀浆中1L-1β和TNF-α含量显著高于其余组(P<0.05),HFP组炎症因子含量仅高于PC组,与BK组无显著性差异(P>0.05),说明长期高脂饮食的小鼠体内出现炎症反应,但灌胃猕猴桃果粉后,炎症因子水平得到了一定程度的改善,因此,猕猴桃果粉具有减缓机体炎症反应,保护脏器的作用。
2.7 猕猴桃果粉对高脂饲养小鼠肝脏组织形态学的影响
由图7可知,PC组肝脏细胞圆润饱满,可以看到肝索的清晰结构,肝窦无明显扩张,组织正常;MD组肝脏细胞形态出现明显的变形,胞质空泡化严重,出现了很多大小不一的圆形脂肪空泡,将细胞核挤向一侧,出现了不同程度的细胞肿胀和脂肪变形,肝窦扩张明显,说明长期高脂饮食的小鼠体内肝脏已形成了损伤;LFP组小鼠肝脏细胞形态较为正常,有少量的脂肪空泡,细胞肿胀和脂肪变形情况较轻;与PC组相比,HFP组小鼠肝脏细胞结构清晰,没有明显的变形,无明显的肝窦扩张,但细胞质疏松淡染。
a-MD;b-PC;c-LFP;d-HFP;e-BK
图7 各处理组的苏木精-伊红染色代表性显微照片
Fig.7 Representative micrograph of HE staining in each group
由图8可知,MD组小鼠由于长期高脂饮食,肝脏细胞形态变形明显,图中大量大小不一的红点说明了肝细胞中脂滴积累明显;LFP组小鼠肝脏细胞中脂肪积累减轻,有少量红点;与PC组相比,HFP组油红O染色图无明显区别,图中红点基本消失,小鼠肝脏细胞中脂肪积累得到了极大的改善。
a-MD;b-PC;c-LFP;d-HFP;e-BK
图8 各处理组的油红O染色代表性显微照片
Fig.8 Representative micrograph of oil red O staining in each group
综上所述,长期的高脂饮食使小鼠肝脏组织发生明显的脂肪变性,引发小鼠高血脂症,但猕猴桃果粉能够保护肝脏组织的良好形态,防止脂滴积累,对高血脂症有一定程度的缓解作用。
3 结论
经过13周的高脂饲料喂养,MD组小鼠体重指数显著高于其他组(P<0.05),说明高脂模型塑造成功,且在各个指标上均出现异常。而用高、低剂量的猕猴桃果粉灌胃小鼠后,小鼠体重、脏器指数、血清及肝脏生化指标、组织形态学等指标均得到了改善,且HFP组效果更佳。对比MD、PC、BK组,HFP组小鼠肝脏指数显著降低(P<0.05),葡萄糖峰值及稳定后的血糖值均为最低;TC、LDL-C、ALT、AST、瘦素指标与PC组相比,均无显著差异(P>0.05);各项肝脏生化指标(SOD、CAT、MDA、GSH-Px)均得到了有效改善;炎症因子含量降低,有效减轻了炎症反应;HFP组小鼠肝脏细胞结构清晰、无明显肝窦扩张、脂滴基本消失不见。综上所述,猕猴桃果粉具有调节脂质代谢、减肥降脂、抑制炎症反应、保护肝脏的作用,是一种潜在的辅助治疗高血脂症的健康食品。
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