嗜热链球菌和瑞士乳杆菌复配发酵牛乳中挥发性风味物质的研究

发酵乳是新鲜牛乳经乳酸菌发酵乳糖而制成的乳制品[1]。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是常见的基础发酵剂组合[2]。相较于保加利亚乳杆菌,瑞士乳杆菌在乳制品发酵过程中的应用能有效减少苦味并赋予乳制品独特的风味[3-4]。根据现有的文献报道,嗜热链球菌和瑞士乳杆菌复配发酵可以加速酸化并使发酵乳的风味更突出[5]。

牛奶在发酵过程中会产生挥发性和非挥发性的风味化合物[6]。这些化合物可以分为羰基化合物、醇类、酸类、酯类、烃类、芳香化合物和含硫化合物等不同的类别[7]。尽管这些化合物的含量较少,但它们在发酵乳中起到了重要的感官作用。为了检测和分析乳酸菌发酵乳中的挥发性化合物,常常使用GC-MS法。此外,固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技术可以快速提取固体和液体样品中的挥发性化合物,特别适用于少量样品的检测[8]。然而,实际应用中发现,SPME萃取头的吸附量不足,限制了分析效果[9]。SPME-Arrow技术提高了萃取涂层的厚度,再结合GC-MS技术,可以更全面地定量和定性分析微量挥发性成分[10]。

目前,相关研究中缺少嗜热链球菌和瑞士乳杆菌单菌及复配发酵比例对发酵乳风味影响的研究。基于此,本实验利用嗜热链球菌CICC 6063和瑞士乳杆菌CICC 6064单菌和复配发酵制备发酵乳,采用顶空固相微萃取结合气相色谱-串联质谱法(head space-solid-phase microextraction-Arrow-GC-MS/MS, HS-SPME-Arrow-GC-MS/MS)方法测定样品中的挥发性化合物,并通过香气活度值(odor activity value,OAV)分析确定关键的风味化合物。这项研究将为这两株菌在工业应用发酵乳品质评价体系的建立中提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

冻干菌粉:嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CICC 6063、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CICC 6064,中国工业微生物菌种保藏中心(China Center Of Industrial Culture Collection,CICC)提供。基质:全脂牛奶,内蒙古蒙牛乳业有限公司。试剂:2-甲基-3-庚酮,Sigma 公司;NaCl,现代东方科技公司。10 μL微量取样器,瑞士Hamilton公司。

1.1.2 主要仪器设备

GCMS-TQ8050 NX气相色谱-质谱联用仪(含Smart Aroma Database数据库)、三相Smart SPME Arrow萃取头(DVB/CAR/PDMS,110 μm),日本岛津公司;电子天平,上海衡平仪器仪表厂;二级生物安全柜,ESCO公司;恒温培养箱,日本Pansonic公司;压力蒸汽灭菌锅,日本Yamato公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵乳的制备

取单菌株冻干菌粉恢复至室温,冻干菌粉活菌数如表1所示,全脂牛奶升温至60 ℃并在20 MPa的条件下进行均质处理。将牛奶灭菌,加热至95 ℃并保持10 min,然后迅速降温至42 ℃。使用嗜热链球菌CICC 6063和瑞士乳杆菌CICC 6064单菌株以及不同比例的组合(1∶1、5∶1、10∶1、100∶1、1 000∶1,嗜热链球菌:瑞士乳杆菌)进行接种,单菌株发酵接种量为5×106 CFU/mL,复配发酵总接种量为5×106 CFU/mL,即嗜热链球菌CICC 6063各组接种量分别为:2.5×106、4.17×106、4.55×106、4.95×106和4.995×106 CFU/mL,瑞士乳杆菌CICC 6064各组接种量分别为:2.5×106、8.3×105、4.5×105、5×104和5×103 CFU/mL。在接种完成后,将样品置于42 ℃恒温培养箱中,监测发酵乳的pH值,当样品的pH值达到发酵终点(pH 4.6)时停止发酵。将其冷藏于4 ℃下后熟12 h后,-20 ℃保存。等待后续对样品中的挥发性风味化合物进行测定。

1.2.2 HS-SPME-Arrow-GC-MS/MS测定条件

采用HS-SPME-Arrow对样品的挥发性气味化合物进行提取和富集,通过GC-MS/MS进行挥发性气味化合物的全鉴定,检测参数如下:

样品前处理:称取制备的发酵乳5 g,加入0.5 g NaCl,1 μL 0.816 mg/mL的内标物2-甲基-3-庚酮。使用ADC-6000公司多功能自动进样系统(日本岛津公司)进行顶空固相微萃取。45 ℃加热平衡30 min后,将SPME-Arrow萃取头插入顶空吸附30 min后,250 ℃解析5 min,后由GC-MS/MS分析。

GC条件:采用SH-PolarWax色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm)。程序升温方式,初始温度40 ℃,升温5 min,然后以3 ℃/min的速度升温至250 ℃,保持15 min。载气He,流速1.0 mL/min,分流模式,分流比5∶1。

MS条件:电子轰击电离源(electron ionization, EI),电子能量70 eV;进样口温度为250 ℃,离子源温度200 ℃,质谱传输接口温度250 ℃,质谱监测模式为全扫描,质量采集范围m/z 35～400。

1.2.3 定性与定量分析

利用岛津香味物质数据库,并通过将质谱、保留指数(retention index,RI)和纯标准品进行比较,从而鉴定出挥发性化合物的结构式。RI是根据在相同色谱条件下正构烷烃(C3～C30)的线性保留时间计算的。每个样品进行了3次测量,以保证结果的准确性。采用2-甲基-3庚酮作为内标半定量计算每种化合物的浓度,按公式(1)计算:

式中:ci,每种化合物的质量浓度,μg/L;cs,内标的质量浓度,μg/L;Ai,每种化合物的色谱峰面积;As,内标的色谱峰面积。

1.2.4 关键挥发性风味物质的评价

OAV是指样品中各挥发性成分的质量浓度与该成分在水中的感觉阈值之间的比值。用来评估挥发性风味化合物在塑造发酵乳整体风味特性方面的个体重要性[11]。

利用Microsoft Excel 2021、Origin 2022等软件对数据进行处理及作图。采用Metabo Analyst 5.0网站对数据进行多维统计分析。

2 结果与分析

2.1 发酵乳中挥发性风味化合物鉴定分析

本研究基于HS-SPME-Arrow-GC-MS/MS技术检测分析发酵乳中的风味物质,利用岛津香味数据库结合RI值进行定性分析,挥发性风味化合物检测结果如表2所示,共检测到66种挥发性化合物,包括9种醛类、13种酮类、12种酸类、14种酯类和18种醇类化合物。不同菌株及复配比例发酵样品中挥发性化合物种类及含量存在明显差异,现对表2中各类物质分别讨论如下:

醛类化合物在发酵乳中具有较低的阈值,对风味产生显著影响[12]。乙醛是发酵乳中最重要的风味化合物之一,具有水果香气,类似于青苹果或坚果的味道[6]。在实验中,适当增加嗜热链球菌接种比例可提高乙醛含量,但过高接种比例会导致乙醛含量降低,复配样品中检测到的含量在4 713.93～20 182.7 μg/L。其中5∶1和10∶1组乙醛含量最高,分别为20 182.77、19 164.75 μg/L。此外,复配样品中增加瑞士乳杆菌接种量会提高戊醛含量,1∶1组戊醛含量最高为141.54 μg/L,表明瑞士乳杆菌对戊醛的产生具有促进作用,这与此前的研究结果一致[13]。在10∶1组中还检测到了辛醛4.15 μg/L。酮类化合物是通过氨基酸热降解、不饱和脂肪酸氧化和美拉德反应形成的。由于其低阈值,它们对乳制品香气有显著影响[11]。在本研究中,本实验在单菌及复配样品中均检测到了3-甲基-2-丁酮、2-戊酮、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、乙偶姻、2-壬酮和甲基壬基甲酮。2,3-丁二酮和乙偶姻是柠檬酸盐代谢的常见代谢产物,对乳制品中黄油和奶油味有积极作用。在复配样品中检测到的2,3-丁二酮和乙偶姻含量分别为12 695.84～18 565.17 μg/L和22 985.56～24 946.11 μg/L,这两种化合物是酮类化合物中含量最高的组分。乙偶姻、2,3-丁二酮和2,3-戊二酮被认为是发酵乳中重要的气味化合物,在样品中呈现出高水平[14],这与我们的研究结果一致。

发酵乳中的脂肪水解、蛋白水解或乳糖发酵会产生羧酸化合物,这些化合物能够增强口味并产生酸味[15]。羧酸化合物包括甲基酮、醇、酯和醛类化合物,但由于阈值较高,对整体风味的影响相对较小[16]。乙酸是乳酸菌发酵的主要副产物,随着瑞士乳杆菌接种量的降低,乙酸含量逐渐降低,1∶1组乙酸含量最高为24 931.49 μg/L。除乙酸外,丁酸、辛酸、癸酸和苯甲酸也在单菌及复配样品中检测到。1 000∶1组和10∶1组丁酸含量最高分别为10 903.61 μg/L和10 301.27 μg/L,辛酸在1 000∶1组含量最高为12 397.33 μg/L。丁酸能赋予发酵乳芝士风味,辛酸可能带来一种肥皂味[17]。

在发酵乳中,醇与游离酸反应形成酯[6]。乳酸菌含有多种酯,可用于醇解过程,从甘油酯和醇中生成风味酯[18]。尤其是乙酸酯,对乳制品果香特性的发展至关重要[19]。它们为发酵乳中的果香和花香提供贡献,同时减少脂肪酸和胺类物质的强烈气味[15]。本实验检测到5种乙酸酯类化合物,其中10∶1组样品中乙酯类物质总含量最高,为1 641.59 μg/L,且乙酸乙酯含量最高为1 559.43 μg/L,可赋予发酵乳花香和果香。乙酸乙酯具有奶油、甜味等特点,与2,3-丁二酮结合,可为发酵乳带来令人愉悦的奶油味[20]。

醇类化合物是发酵乳中氨基酸代谢和葡萄糖降解的最终产物,与乳糖代谢、甲基酮还原和氨基酸代谢等过程密切相关[21]。除1∶1组外,单菌及复配发酵样品中均检测到了2-庚醇,且CICC 6063单菌发酵样品中含量最高为68.65 μg/L。硬脂醇只在单菌发酵的两组样品中检出。1-辛烯-3-醇在复配样品中除1∶1组外,随着嗜热链球菌接种比例的增加而逐渐降低。本实验在10∶1组样品中,检测到了香茅醇,其含量为150.86 μg/L。香茅醇是一种常见的单萜醇,是多种发酵食品的重要香气成分,例如啤酒,红酒,荔枝发酵饮料等。风味描述其具有玫瑰香气,阈值为40 μg/L[22],但目前,尚未有相关文献报道其在发酵乳中有检出。

2.2 挥发性化合物的主成分分析及聚类分析

本研究采用主成分分析研究了嗜热链球菌CICC 6063和瑞士乳杆菌CICC 6064单菌及复配发酵牛乳中挥发性成分的差异。载荷图上,样品距离越近,表明其香气组成及含量的相似度越高。主成分得分图1-a显示,单菌和复配分别在图左右区域,且1∶1组和5∶1组样品风味相近,100∶1组与1 000∶1组风味相似。第1、2主成分的贡献率分别为68%和26.9%,总贡献率>75%,表明这两个主成分能表征样品的大部分特征。

热图是根据挥发性风味化合物的种类及其含量绘制,并通过层次聚类进行分析。如图1-b所示,10∶1、100∶1、1 000∶1组聚为一类,1∶1与5∶1组较近。红色深度代表风味物质含量,复配样品与单菌发酵样品风味差异显著。差异代谢物分析结果表明(1-c),乙偶姻、乙酸、丁酸、2,3-丁二酮、辛酸和己酸能够区分单菌发酵和复配发酵的7组样品,这些物质的变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)值>1。

研究发现,嗜热链球菌CICC 6063和瑞士乳杆菌CICC 6064的复配发酵与单菌株发酵相比,显著改变了样品的挥发性风味物质组成和含量。乙醛、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、乙偶姻、乙酸、丁酸等物质的含量均高于单菌发酵乳;而仲丁醇、梨醇酯、丁酸异戊酯等物质在复配发酵乳中含量较高,而在单菌发酵乳中未检出。这可能是由于嗜热链球菌和瑞士乳杆菌之间发生的协同作用或拮抗作用导致的。另外,研究还发现,这两种菌的复配发酵可以降低发酵乳中谷氨酸脱羧酶的活性,从而抑制乳糖的消耗和乳酸的产生[23]。乳糖在糖降解过程中会产生影响风味的化合物,如双乙酰、乙醛和乙偶姻。此外,柠檬酸代谢也与乳糖糖酵解密切相关。这些因素可能导致复配发酵乳中某些挥发性风味物质含量升高。另一方面,复配发酵乳中十二醛、十一烷酸、2-庚醇和硬脂醇的含量下降或未检出,而在单菌发酵乳中含量较高。这可能是由于复配发酵过程中产生的某些挥发性物质作为中间产物被利用分解的结果。综上所述,混合培养的优势互补作用能够提高活菌数、缩短发酵周期并改善产品特性。

2.3 发酵乳中关键性风味物质及其OAV

发酵乳的风味是由各种挥发性化合物的阈值与其含量共同决定的,为进一步确定单菌和复配发酵牛乳的关键性风味物质,将表2中鉴定得到的风味化合物进行OAV计算,确定了各组的关键性风味物质如表3所示。

在嗜热链球菌单菌发酵牛乳中,共有5种挥发性风味物质的OAV≥1,分别为2,3-丁二酮、乙偶姻、2-庚醇、2-壬酮和十二醛,这些物质是嗜热链球菌单菌发酵样品的关键挥发性物质。共有4种物质(0.1≤OAV<1)对样品具有重要修饰作用。在瑞士乳杆菌单菌发酵牛乳中共有5种挥发性风味物质的OAV≥1,分别为乙醛、2,3-丁二酮、2-壬酮、十二醛和己酸,这些物质是瑞士乳杆菌单菌发酵样品的关键挥发性物质,共有8种风味物质(0.1≤OAV<1)对瑞士乳杆菌单菌发酵样品总体香气具有重要修饰作用。丹彤等[24]报道发酵乳中的乙醛主要由乳杆菌发酵产生,双乙酰主要由链球菌发酵产生,与本实验检测到的结果较一致。在复配发酵牛乳中共有10种挥发性风味物质的OAV≥1,分别为乙醛、乙酸乙酯、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、乙偶姻、2-壬酮、异丁酸、甲基壬基甲酮、丁酸和辛酸。10∶1组关键挥发性风味物质有22种,超过其他组的5～20种。

3 结论

本研究首次探讨了不同比例的嗜热链球菌和瑞士乳杆菌复配对发酵乳风味的影响。通过采用HS-SPME-Arrow与GC-MS/MS技术,对单菌及不同比例组合发酵的牛乳挥发性化合物进行鉴定和定量分析,共发现66种挥发性风味化合物。研究结果表明,嗜热链球菌CICC 6063和瑞士乳杆菌CICC 6064的复配发酵相比于单菌发酵,具有更多的风味化合物且含量更高。此外,比例的选择对挥发性化合物的种类和含量也有显著影响。特别是在10∶1的复配组合中,确定了22种关键风味化合物,其中乙酯类化合物含量高达1 641.59 μg/L,伴有香茅醇检出,赋予发酵乳独特的水果与花香。本研究结果为菌株的产业化应用提供了重要依据。

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