梨是蔷薇科(Rosaceae)、梨属植物(Pyrus.L)。我国是梨属植物的中心发源地之一,同时梨也是继苹果和柑橘之后的第三大果树树种,因梨树对栽培条件要求较低,而且产量较高,因此自改革开放以来我国梨果产业一直在不断发展,仅在2022年,我国梨种植面积约92万hm2,产量约1 887.59万t[1]。梨酒的酿造不仅可以消耗大量鲜果以缓解农户的贮藏压力,还能提高产品附加值。
酒类的发酵过程由复杂的微生物系统驱动,这些微生物系统由真核和原核微生物组成,它们参与发酵液和果汁的多种生化相互作用,并调节发酵饮料的感官特性。其中,酵母起着重要作用,因为它们通过酒精发酵,将糖转化为乙醇和CO2以及多种次级代谢产物,影响着酒精饮料的品质。因此酵母的特性在一定程度上影响了梨酒的品质和多样性。
1 酵母对梨酒品质的改善
1.1 对酚类化合物的影响
酚类化合物是梨酒中的重要物质,具有体外抗氧化的功能,并且为果酒提供了一定的收敛感。梨酒中包含熊果苷、绿原酸、儿茶素和表儿茶素等多种单体酚[2],其中熊果苷占比最高,主要分布在果皮中[3],但对梨酒抗氧化能力的贡献较低,而含量较低的具有邻位羟基结构的咖啡酸则影响较大[2]。
李丽梅等[4]在雪花梨酒中评价了8种葡萄酒酵母菌株酚类化合物和DPPH自由基清除率的影响,发现不同类型的酚类物质受到酵母的影响程度不同,其中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸和表儿茶素受到菌株特异性的影响较大。近年来,非酿酒酵母对梨酒中多酚的影响也一直在进行,其中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)是有潜力的一种酵母。有研究表明,德尔布有孢圆酵母与酿酒酵母的混合发酵可以提高蓝莓酒中总酚[5],类似的,陈江魁等[6]通过酿酒酵母与T. delbrueckii的混合发酵提高了梨酒中的总酚和总黄酮,增加了DPPH自由基的消除能力,并显著提高了梨酒中酯类化合物和高级醇的含量。同样,在HE等[7]的研究中,T. delbrueckii的混合发酵组产生了比梨汁更高的羟基肉桂酸,梨酒中可定量总酚含量的升高可能是因为酵母菌从多糖和甘露蛋白中释放出结合态的酚类化合物,发酵会导致游离的羟基肉桂酸和各种多糖和甘露蛋白的酯化形式的水解反应,但是相对于发酵剂的接种方式,梨的品种对于多酚成分的影响更大[8]。
1.2 对酸度的影响
合适的酸度对于果酒的品质是必要的,一般来说,大部分梨酒的有机酸含量较少,在3～6 g/L[9-10],口感单薄。梨酒中主要的有机酸是苹果酸、酒石酸、柠檬酸等,其中苹果酸含量最高且对梨酒风味强度的影响最大,苹果酸的风味较为尖锐,然而经过发酵之后梨酒的苹果酸含量一般变化不大[11]。对梨酒中乳酸的研究是改善梨酒酸感非常有潜力的思路。乳酸是一种口感更加柔和的有机酸,一般由微生物苹果酸-乳酸发酵产生,赵一凡[10]筛选了能在梨酒中生长良好的一株植物乳杆菌并探究了苹乳发酵时的工艺,改善了梨酒中的酸度,并且增加了不同的香气化合物。此外,乳酸也可以由微生物糖酵解产生的丙酮酸经过乳酸脱氢酶生成,由于苹乳发酵产生的乳酸含量有限,因此,能通过该途径产生乳酸的微生物在梨酒中有很大的研究潜力。库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)在厌氧条件下可以生成乳酸,并具有提高果酒中的果香的能力[12]。胡陆军等[13]用P. kudriavzevii、植物乳杆菌和酿酒酵母对梨汁进行混合发酵,乳酸含量有所下降,可能是因为P. kudriavzevii在高浓度酸性条件下具有消耗乳酸的能力,但总酚含量和抗氧化能力有所提升同时增加了梨酒的乙酸乙酯以及高级醇的相对含量。耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)同样具备将糖转化为乳酸的能力[14],在有些葡萄酒中L. thermotolerans的产乳酸水平甚至高于乳酸菌[15]。尽管L. thermotolerans在葡萄酒和啤酒中的增酸作用已经广泛应用,但是其在梨酒和其他低酸度果酒中的潜力还有待开发。
1.3 对香气的影响
发酵饮料中的香气含量和组成是重要的品质指标,但是梨汁酿造成酒后香气与风味不足是影响消费者对梨酒喜好的原因之一[16]。白酒中的酵母由于其产香能力和发酵能力[17],在梨酒中具有应用潜力。闫玮华等[18]探究了白酒酵母在砀山梨汁中的最佳发酵温度、发酵时间、装液量、加糖量和pH值等发酵参数。扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)可以分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶,常用于白酒的酿造中,其产酯能力受到人们的重视。车路萍等[19]在鸭梨酒中使用S. fibuligera与酿酒酵母进行混菌发酵,通过单因素试验和正交试验确定了两种酵母的接种时间、接种量、发酵温度和发酵时间,优化后的发酵工艺与纯菌发酵的鸭梨酒相比,总酯和总醇均有显著的提升,S. fibuligera提高了乙酸乙酯的含量,这是在清香型白酒中的主体香气。
不同的酵母会产生不同的香气物质,进而会对梨酒的香气风格产生影响。在许多品种的梨酿造的梨酒中,癸酸乙酯、辛酸乙酯等酯类以及3-甲基1-丁醇是主要的香气成分[20]。袁晓龙等[21]从6株产香酵母中选择出1株异常毕赤酵母(Pichia anomala)并与果酒酵母进行共发酵,在增加了乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等原有酯类含量的同时,产生了草氨酸乙酯等独特的香气成分。类似的,吴尧等[22]使用异常威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus)与酿酒酵母在鸭梨酒中进行混合发酵,相对于酿酒酵母的单独发酵,丰富了香气化合物的组成尤其是酯类化合物,如:异戊酸乙酯、琥珀酸二乙酯、亚油酸乙酯和硝酸异山梨酯,可能会增加苹果和桑葚的香气,而且主要的酯类如乙酸乙酯、乙酸苯乙酯的含量也有明显的上升。
2 梨酒酵母的筛选
2.1 基于发酵能力的筛选
用于梨酒发酵的酵母往往从果皮或者果园的土壤中进行多重筛选。最初的筛选往往以发酵性能(尤其是乙醇产生能力)为主要指标。乙醇浓度一方面可以提升酒体的饱满度,另一方面也可以积极地影响香气[23]。早在2006年,石勇等[24]将梨自然发酵液中的酵母以生长能力、乙醇、残糖等为指标,经过三级筛选出一株发酵能力强的酵母。刘根娣等[25]使用破碎的冬果梨富集微生物,在麦芽汁中增殖后经过TTC平板、耐乙醇性能、产乙醇性能三重筛选中获得并随后鉴定出一株酿酒酵母,在调整糖度为20%的梨汁中能够产生体积分数为7.79%的乙醇。同样的,金磊等[26]从陕西蒲城酥梨的果皮或者梨园土壤中分离的酵母经过TTC染色法、杜氏管产气情况、梨汁中CO2失重三级筛选法筛选出1株酿酒酵母,该酵母能够以10%的接种量下在15°Brix的梨汁中7 d内产生体积分数为8.8%的乙醇。
与葡萄以及其他水果不同,梨汁中的糖分有相当一部分的山梨糖醇,有的品种甚至高达30%的总糖占比[27],山梨糖醇会增加梨酒中不必要的甜感,并且残留的山梨糖醇在人体通常无法完全吸收,过度摄入可能会导致腹胀、腹泻和肠胃胀气[7]。目前,对于梨酒酵母的评价指标仍然与其他果酒尤其是葡萄酒同质化,在梨酒中使用的酵母也有相当一部分是葡萄酒酵母,但是很少有研究关注梨酒酵母的山梨糖醇利用能力。山梨糖醇作为六碳糖醇,具备发酵成乙醇的潜力,大部分酿酒酵母能够在以山梨糖醇为唯一碳源的培养基中生长,但是迟滞期长达2～4周[28],通过在甘露醇中的长时间生长引起酿酒酵母的Tup1-Cyc8核心加压器的突变也能使其同化山梨糖醇[29],一些非酿酒酵母如Pichia pastoris[30],Kluyveromyces marxianus[31]也具有在山梨糖醇中生长的能力。GONZ
LEZ等[32]从巴塔哥尼亚苹果酒中分离出两株Saccharomyces uvarum,并首次描述了该种酵母以山梨糖醇为唯一碳源的生长能力,在未经过调糖的12 °Brix的梨汁的中试发酵中产生了体积分数为5.79%的乙醇,山梨糖醇代谢率高达50%。
2.2 基于香气的筛选
随着梨酒中香气对品质的影响逐渐受到重视,研究者开始将香气作为筛选梨酒酵母的重要指标之一,尤其是非酿酒酵母。非酿酒酵母是指来源于发酵环境与酿酒酵母不同的酵母群体,许多非酿酒酵母可以产生广泛的胞外酶,这有助于萜烯类、酯类和醇类的释放,从而提升发酵饮料的复杂性与多样性[33]。张大为等[34]从自然发酵的梨酒中分离酵母,并在发酵培养基中经过感官评定初筛,再根据总酯含量复筛出一株产香能力强的酵母,能在发酵第6天时产生0.38 g/L的总酯,但产酒精仅为0.8%(体积分数),随后鉴定为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)。为了改善其乙醇产生能力,在另一项研究中[35]作者将该株东方伊萨酵母与一株酿酒酵母进行原生质体融合产生融合子,相对于亲本酿酒酵母,提高了乙醇产量和总酯产量,分别为9.87%(体积分数)和0.37 g/L。LI等[36]分析了库尔勒香梨中微生物的动态组成,发现自然发酵初期的酵母组成主要为Metschnikowia chrysoperlae和Metschnikowia pulcherrima酵母,而在后期由Pichia mandshurica酵母主导,随后作者根据香气强度使用嗅探法筛选出产香较好的5株本土菌株,分别被鉴定为Metschnikowia sinensis,Wickerhamomyces anomalus,Hanseniaspora gulliermondii,Torulaspora delbrueckii和Pichia kluyveri。在后续的研究中,刘晓柱等[37]对其中的M. sinensis进行了发酵性能评价,并与商业酵母进行混合发酵,显著提高了库尔勒香梨酒酯类化合物的总量,主要表现在辛酸乙酯和月桂酸乙酯的提高,可能会增加梨酒果香方面的描述,但乙醇产量有所下降。
3 梨酒的发酵参数对酵母的影响
在梨酒的加工参数方面,前人[38]已进行了深入的综述,考虑到酵母在梨酒发酵中的重要性,以下部分将重点关注梨酒中加工参数对于酵母的可能影响。
3.1 温度对酵母的影响
温度会影响微生物的生长代谢以及体内的酶活性,一般来说温度会降低酵母的发酵速度,同时使得次生代谢产物更多的积累,同时梨酒中的酚类物质也会受到温度影响,从而产生不同程度的褐变。马懿等[39]使用酿酒酵母研究了不同温度对于库尔勒香梨梨酒品质的影响(8、13、18、23 ℃),发现在13 ℃时梨酒的酯类化合物,尤其是典型的酯类如辛酸乙酯和癸酸乙酯明显增加,但乙酸苯乙酯出现了下降。而在更低的温度下,高级醇如异戊醇则有较大的提升,而苯乙醇含量下降,同时,在低温下梨酒的非酶促褐变也减少,但是在较低温度(8和13 ℃)下,发酵时间显著延长,最长可达40 d,根据感官评价的结果,作者确定13 ℃作为库尔勒香梨梨酒的酿造最佳温度。通常,较低的温度会减缓酵母的发酵速度,但同时促进多样化风味化合物的生成[40]。温度对发酵品质的一个影响方面是酵母乙醇的产量,颜子豪等[41]使用果酒酵母探究了15、19、23、27 ℃下发酵的红梨梨酒的乙醇,结果发现在15 ℃下乙醇产量小于8%(体积分数),而其他温度下的乙醇产量均在10.5%(体积分数)左右。因此,如何在低温下平衡酵母在梨酒中的发酵能力和产香性能也是一个潜在的研究方向。
3.2 接种量对酵母的影响
除了温度,酵母的接种量对梨酒品质也有影响。颜子豪等[41]发现当酵母接种量高时,前期发酵的速度更快,但感官评分会有所降低,可能是因为高接种量的酵母在抑制杂菌的同时,较快的发酵速度也使得风味物质减少。韦唯等[42]探究了黄果梨中酵母的接种量与乙醇产量的关系,发现在0.03%～0.07%的5个接种梯度下,乙醇含量呈先上升后下降的趋势,在0.05%的接种量下达到最高的乙醇含量,接近13%(体积分数),类似的变化趋势也在王晓丽等[43]的研究中出现,这是由于酵母快速发酵导致乙醇含量剧增引起部分酵母的衰亡。
3.3 固形物对酵母的影响
梨酒的固形物含量较低,且含有大量难以发酵的山梨糖醇,因此在接种酵母之前通常需要调整固形物含量。外源糖既为酵母提供转化为乙醇的碳源,同时糖分过高也会对酵母造成渗透压胁迫,这一点在梨酒中尤其需要被重视,因为梨酒中较高含量的山梨糖醇会产生比相同浓度葡萄糖更高的渗透压。与接种量相似,在一定范围内,糖度对于梨酒酒精度的影响也是先升高后降低的趋势。刘延波等[44]根据乙醇产量和感官评分,在糖度18%～26%选择了24%作为菠萝梨酒的发酵初始糖度;田学梅等[45]发现生姜梨酒在初始糖度为20%可以产生最高酒精度;类似的,王晓丽等[43]在火龙果酥梨酒中选择了24.5%作为初始糖度,产生了体积分数为10.2%的乙醇。
3.4 混合发酵对酵母的影响
在混合发酵体系中,不同的微生物之间可能会存在正向或者负向的相互作用,在曾智娟等[46]的关于生姜梨酒的研究中,产香酵母Yeast-W2和Yeast-NJSYS-70明显抑制了产酒精酵母Yeast-全兴5#的酒精产生能力和糖消耗能力,而产香酵母P. anomala与产酒精酵母的混合发酵既可以提高酒精度也能显著增加总酯含量。
不同种属的酵母在接种过程的时间间隔也会影响发酵结果,过早的接种会导致酿酒酵母产生杀伤性多肽从而对非酿酒酵母造成胁迫[47],而过晚接入酿酒酵母则会导致非酿酒酵母前期消耗过多营养物质如可利用氮从而抑制酿酒酵母的生长[48],此外,为了在发酵体系中占据生态位优势,有些非酿酒酵母还会产生一些抗真菌化合物[49]。在车路萍等[19]研究了S. fibuligera与酿酒酵母的接种工艺,结果表明同时等比例接种时,酿酒酵母对S. fibuligera的抑制作用较强;随着接种时间间隔的增加,这种抑制逐渐减弱,最后确定24 h为最佳接种间隔。袁晓龙等[21]探究了酿酒酵母与产香酵母接种间隔对鸭梨酒发酵的影响,发现24 h接种间隔时,酒精度最高,残糖含量最低。
通常在次序接种时,考虑到非酿酒酵母较弱的乙醇耐受能力,先接种非酿酒酵母,再接种酿酒酵母。然而,非酿酒酵母在早期的快速生长可能会抑制酵母菌的生长以及且其低乙醇生产能力可能导致酒精度降低,吴尧等[22]在鸭梨酒中探究了后接入非酿酒酵母的可行性,发现当同时接种时,酿酒酵母的生长更容易受到竞争抑制,随着接种间隔的增加,后接入的异常威克汉逊酵母则逐渐处于劣势,表现为菌体数明显下降,但是对酒精度的影响不大。此外,共同接种也丰富了鸭梨酒的香气成分。
3.5 pH对酵母的影响
梨酒中酵母的最适发酵pH与菌株特性及果汁基底的组成密切相关。王晓丽等[43]对火龙果酥梨酒中果酒酵母接入时的pH进行单因素试验,结果显示,在pH值为3.6时,酵母能产生接近10%(体积分数)的酒精度,而当pH值升高到4.0时,酒精度显著降低到约7%(体积分数),这种在较小pH区间内出现的敏感性可能与复合梨酒的营养丰富、易受杂菌污染有关。适宜的pH既能避免酵母产生胁迫,也能有效抑制杂菌生长。而在田学梅等[45]的生姜梨酒的研究中,酵母在pH值为4.5时可以产生最高的酒精度。杜娟等[50]以鲜梨果酿造梨酒,在pH值为3.0～4.5时酿酒酵母的乙醇产量变化不大。孟金明等[51]在枇杷和贡梨的复合酒中选择pH 4.6为最佳发酵pH值,而当pH<4.0时酵母受到抑制明显。一般来说,酵母的正常生长pH值应该在4.5左右[52],但在真实的梨酒发酵过程中,考虑到与其他杂菌的竞争关系,需要灵活选择最适的pH。
3.6 SO2及替代物对酵母的影响
SO2由于其抑菌及抗氧化能力在果酒酿造中使用广泛,但其对人体的危害和对发酵体系中酵母的抑制使其添加量需要被严格控制。闫子茹等[38]综述了梨酒中范围在60～100 mg/L的加硫量;颜子豪等[41]测试了果酒酵母在加硫量为140～200 mg/L的发酵能力,发现对酒精度和残糖的影响较小。
随着人们对于食品健康的重视,酿酒行业一直在寻找潜在添加剂以减少SO2的使用,这些添加剂也可能对酵母的生理生化活动有着影响。张大为[53]研究了不同中草药抗菌性能在梨酒中的应用,发现酸枣仁与丁香的组合具有较强的抗菌抗氧化能力,同时对于酿造菌株的抑制最小,在3%的添加量下可代替70%的SO2用量,在香气方面与正常SO2添加量的梨酒相比差别不大。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)是一种植物源的类黄酮化合物,其抗氧化性、抑菌性以及安全性使其有潜力代替SO2的在果酒加工中的作用。马懿等[54]在梨酒中研究了DMY、SO2及其两者联用对梨酒的影响,发现适量的DMY除了在体外抗氧化活性、总酚总黄酮、酒体色泽方面有着可预见的改善之外,同时在香气物质的产生上,乙酸乙酯、己酸乙酯及辛酸乙酯等关键酯类化合物含量也有着明显上升,作者推断DMY可能影响了酵母的乙酰辅酶A、脂肪酶的生成以促进酯类合成[55]。类似的,陈晓姣等[56]探究了在添加富含谷胱甘肽酵母衍生物(glutathione-enriched inactive dry yeast,g-IDY)对梨酒品质的影响,发现g-IDY的添加在酒体抗氧化指标提升的同时,也可以增加醇类化合物的含量,作者认为g-IDY释放的谷胱甘肽(glutathione,GSH)可以维持酵母内的氧化还原态平衡以减少高级醇的氧化。但这种香气上的提升也可能是g-IDY的添加使得营养调节变化如可利用氮增加导致的,因为酵母会通过Ehrlich途径形成高级醇[57],这一点在邓星星等[58]的研究中有所提及,作者直接添加了GSH作为SO2的替代物,可使得大多数醇类、酚类和萜烯类化合物的含量增加。
4 梨酒酵母研究的不足和展望
4.1 不足
首先,在酵母的筛选来源上。梨酒酵母的来源往往局限于梨的果园土壤或者果皮,但是从葡萄源的酵母尤其是非酿酒酵母在梨酒中的筛选潜力并未受到足够的重视。葡萄园中的酵母往往在酿酒环境和野外环境中进行广泛的交换和进化[59],这可能会使得来源于葡萄园的酵母有更好的发酵性能,如耐受糖能力和产生乙醇能力。另外,我国拥有多个成熟的葡萄酒产区,具有丰富的微生物资源,来自不同风土的微生物可以使得梨酒的风格更加多样化。
其次,在酵母的筛选标准上。之前的梨酒酵母筛选的标准主要是评价其耐受乙醇能力、乙醇产生能力、SO2耐受性等基础的指标,评价标准过于单一,且与葡萄酒酵母的筛选标准同质化严重,不利于突出梨酒本身的特点。因此,在未来,研究人员可以根据梨汁的特点,将酵母的山梨糖醇利用能力、产酸能力、抗氧化物质的产生能力以及产香能力等做为梨酒酵母筛选中更重要的标准。
第三,非酿酒酵母的生物防治作用在梨酒中研究较少,许多非酿酒酵母如M.pulcherrima、S.bacillaris和P.kluyveri在提升香气评价的同时可以抑制不良酵母和霉菌,具有减少SO2添加量的潜力[60]。
最后,在梨酒发酵参数的研究上,现有的研究大多将感官评价作为单因素或者响应面分析的重要指标,这增加了评判标准的主观性和不可复制性的风险。将具体的数据如酒精度、残糖、pH以及辛酸乙酯等特征香气的含量作为单一评定标准或者加权指标进行发酵参数的研究会增加研究结果可信度和广泛性。
4.2 展望
将梨果加工成梨酒可以有效提高梨产品的附加价值并推动梨加工产业的进一步发展。尽管梨酒的加工和销售中仍面临许多挑战,但相信随着研究的深入、技术的落实以及市场接受度的不断提高,梨酒行业会进一步蓬勃发展。
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