硒是一种非金属化学元素,呈灰色,带金属光泽。它是机体健康必不可少的微量元素,在抗氧化防衰老、降血压、调节免疫、防癌抗癌、抗动脉硬化等多方面具有重要的生物学功能[1],也是一些酶的组成部分,包括谷胱甘肽过氧化物酶、碘甲腺原氨酸脱碘酶和硫氧还蛋白还原酶等,硒可以保护细胞免受氧化过程中形成的自由基的有害影响[2]。自然界中硒主要分为有机硒和无机硒两大类,无机硒较少,通常以硒单质、硒酸盐、亚硒酸盐形式存在,而有机硒形式较多,主要通过生物转化与氨基酸结合而成,一般是以硒蛋白(多肽)、硒多糖、硒核酸的形式存在[3],且具有生物利用率高、低毒等特性。我国是缺硒大国,硒的分布也极其不平衡,有2/3的土地缺硒,近7亿人口缺硒,共有22个省、72%的县处于缺硒状态[4]。由于人体不能自主合成硒,必须从食物中获取,因此开发富硒产品对改善我国缺硒状态具有重要意义。此外,微生物以其强富硒能力和硒转化能力成为发酵富硒的研究热点。
本文主要综述了微生物发酵富硒及其产物的生物活性,总结了目前用于发酵富硒的方式及微生物种类,阐释了微生物发酵富硒对生物体内硒形态的转化作用和产物的生物活性表达等,为微生物发酵富硒产品的开发和利用提供参考。
1 微生物发酵富硒研究进展
1.1 发酵富硒方式
微生物发酵富硒的方式包括固态和液态发酵,不同发酵方式对生物体内的氨基酸种类影响无差异,液态发酵比固态发酵所产生的挥发性物质种类多,且产生的总游离氨基酸含量也更高[5]。枯草芽孢杆菌、酿酒酵母以及一些对水分需求低的酒曲菌属、根毛霉属等菌株常用于固态发酵过程,而光合细菌、益生菌(如乳杆菌、双歧杆菌)、短小芽孢杆菌、产朊假丝酵母、雅致放射毛霉、黑曲霉等常用于液态发酵。据报道,采用纳豆芽孢杆菌固态或液态发酵可对鹰嘴豆进行富硒,用黑曲霉液态发酵可制备富硒黑茶,而大型真菌常用液态发酵富硒[6]。
1.2 富硒发酵微生物的种类
微生物发酵作为重要的生物技术,在工业生产和科学研究领域占据核心地位[7]。通常使用的微生物包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌等。细菌、真菌、微藻等微生物具有生长旺、繁殖快、适应强、代谢迅速及易于工厂化生产等优势,成为发酵富硒的重要途径。此外,通过对目前常用菌株的硒转化率及富硒趋势进行归纳总结,发现不同微生物其富硒能力有所差异,如下表1所示。
表1 微生物发酵富硒分类
Table 1 The selenium-rich classification by microbial fermentation
方法固态/液态发酵微生物种类富硒趋势参考文献微生物发酵富硒液态液态液态液态液态液态固态、液态液态液态液态液态液态液态液态乳酸菌酵母菌芽孢杆菌霉菌大型食用真菌罗伊氏乳杆菌在加硒量100 μg/mL时,菌种硒含量为4.40 mg/g,转化率可达13.3%[9]乳酸菌JX5在加硒量40 μg/mL时,硒的转化率可达80%以上[10]副干酪乳酪杆菌CCFM1089在加硒量6.57 mg/L时,硒含量最高达到849.6 mg/kg[11]酿酒酵母HXS-02在加硒量25 μg/mL时,总硒含量可到达2 303.97 μg/g[12]富硒酿酒酵母SY2在加硒量30 mg/L时,硒含量为1 920.5 μg/g,硒的转化率为82.7%[13]短小芽孢杆菌CD52在加硒量39 μg/mL时,有机硒转化率高达到96.0%[15]枯草芽孢杆菌JE21在加硒浓度1 mmol/L时,有机硒转化率达到最大值(94.61±0.82)%[16]蜡样芽孢杆菌在加硒量150 μg/mL时,硒转化率高达94.3%[17]地衣芽孢杆菌BI-001在加硒量120 μg/mL时,硒转化率为91.52%,纳米硒的产率高达74.83%[18]黑曲霉KY607770在水与茶的液料比为35(mL∶g)条件下,硒得率为(14.51±0.18)%[19]米曲霉在加硒量100 μg/mL时,2号菌株硒含量为2.22 mg/g[20]灵芝菌在加硒量为0～1 000 mg/kg时,6个菌丝体硒源利用率均达到90%以上[22]红色红曲菌M7在加硒量200 μg/mL时,硒含量有最大值(3 120.59±193.63) μg/g[23]红平菇在加硒量5.0 mg/L时,总硒质量分数101.23 μg/g[24]
1.2.1 乳酸菌发酵富硒
乳酸菌是一类革兰氏阳性杆菌或球菌、可发酵乳糖或葡萄糖产生大量乳酸的细菌的通称,目前,在食品、医药等领域应用最多的乳酸菌主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等[8],不同种属的乳酸菌对硒元素的富集能力也有差异。陈永旭等[9]对罗伊氏乳杆菌进行富硒发酵试验,发现Na2SeO3质量浓度在100 μg/mL时,有机硒的转化量为4.40 mg/g,转化率为13.3%,达到有机硒富集的最大临界值,由此得到富硒益生菌可以兼具有机硒和益生菌的作用。韦梦婷等[10]在MRS(man rogosa sharpe)培养基中富硒培养9株乳酸菌,发现JX5这株乳酸菌在加硒量为40 μg/mL条件下培养2 h硒的转化率可达80%以上,说明乳酸菌具有一定的转化无机硒为有机硒的能力。仲雨晴[11]在37 ℃条件下对罗伊氏黏液乳杆菌CCFM130进行富硒培养,发现硒含量高达849.6 mg/kg,比初始硒含量提高了60%以上,体现了菌株CCFM1303对硒的强富集能力。总之,乳酸菌经富硒发酵后,其活性可以与有机硒充分结合,使其成为一种良好的富硒载体。因此,乳酸菌在发酵富硒领域具有较好的应用前景。
1.2.2 酵母菌发酵富硒
酵母对硒富集转化能力高,同时还具有生长繁殖快、发酵周期短等特点。硒在酵母生长时可以被吸收利用,因此将酵母放入含有无机硒(亚硒酸盐)的培养基中培养时,一部分的无机硒可以被酵母同化为有机硒,使硒能够更高效、更安全地被利用。孙朝阳等[12]以酿酒酵母为出发菌株,经10 mol/L NaN3处理40 min和2.50% H2O2筛分,观察到HXS-01和HXS-02这两株菌株富硒水平高、富硒能力稳定,其中HXS-02酿酒酵母其总硒含量可到达2 303.97 μg/g,其产率为7 945.19 μg/L且有机硒占总硒的百分比超过97%。涂青等[13]以富硒酿酒酵母SY2为发酵菌种,确定了在初始pH 5.0,发酵温度30 ℃,接种量8%,硒添加量30 mg/L,发酵时间24 h的最适发酵条件下,富硒酵母硒转化率为77.5%。在拟指数补料方式下,培养周期为34 h,富硒酵母得率为0.252 g/g,硒含量为1 920.5 μg/g,硒的转化率为82.7%。
1.2.3 芽孢杆菌发酵富硒
芽孢杆菌由于能够产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶等多种酶类,并且具有防虫防病等效用,因此用于食品、医疗、农业等多个领域[14]。陆富海等[15]经过多轮筛选得到一株目的菌株短小芽孢杆菌CD52,对发酵条件优化时,确定在接种量为3.9%、Na2SeO3质量浓度为39 mg/L、初始pH值为5.6时有机硒转化率最高,可达到96.0%。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性好氧性细菌,拥有良好的硒转化能力。张芯[16]研究发现,在Na2SeO3添加浓度为1 mmol/L、添加时间为开始培养后的第8 h、枯草芽孢杆菌JE21菌体接种量为4%时,有机硒转化率达到最大值(94.61±0.82)%。CHEN等[17]从恩施地区筛选了一株蜡样芽胞杆菌对其进行富硒培养,响应面实验优化得到硒转化率高达94.3%。张立秋等[18]以地衣芽孢杆菌BI-001为研究对象进行富硒实验,发现在Na2SeO3质量浓度为120 μg/mL条件下培养60 h,硒的转化率为91.52%,纳米硒的产率高达74.83%,表明该菌具有良好合成纳米硒的能力。
1.2.4 霉菌发酵富硒
霉菌指丝状真菌,其易于繁殖培养且环境适应性强,在富硒培养时可在短时间内产生大量产物,因此具有广泛的应用前景。宋鹏鹏[19]通过对黑曲霉液态发酵,在黑曲霉孢子接种量9.4%,液料比36.3 mL/g,发酵时间 9.5 d的工艺条件下,产品液态发酵富硒速溶黑茶硒得率为(14.51±0.18)%。李红卫[20]通过紫外诱变获得4株耐硒米曲霉菌株,经筛选确定2号菌株作为出发菌株富硒发酵,在接种量10.64%,装液量85.4 mL,转速185 r/min的最优发酵条件下,此时的最大响应值米曲霉的富硒值为2.349 mg/g,较出发菌株提高了5.8%。
1.2.5 大型食用真菌发酵富硒
食用菌是指可以食用的大型蕈菌,种类繁多,且具有较高的食用价值和药用价值,常见的食用菌包括灵芝、金针菇、平菇、香菇、羊肚菌、猴头菇、竹荪、木耳等[21]。李蕾[22]通过对6个灵芝菌株菌丝体富硒培养,发现灵芝菌丝体的总硒含量与培养基中Na2SeO3浓度呈正相关,但不同灵芝菌株间存在差异。当Na2SeO3质量浓度在0～1 000 mg/kg时,6个菌丝体硒源利用率均达到90%以上。龙鹏程等[23]对5种红曲菌菌株富硒培养筛选,得到富硒能力最强菌株红色红曲菌M7,当在Na2SeO3质量浓度为200 μg/mL的PDA(potato dextrose agar)培养基中培养时,红色红曲菌M7菌丝体中的硒含量有最大值(3 120.59±193.63) μg/g。张文婧等[24]从4种平菇中选取红平菇进行富硒培养,在150 r/min、pH 6.5、Na2SeO3质量浓度5.0 mg/L的条件下,红平菇富硒菌丝体生物量1.204 mg/L,总硒质量分数101.23 μg/g。
2 硒的存在形式及形态转化
自然界中,硒主要以有机和无机两种形态。有机硒可直接被生物体吸收和利用,而无机硒则需要通过酶的同化作用转化为有机硒,随后被生物体吸收并进行代谢。通过硒转化,硒在生物体内以硒蛋白、硒多糖、硒核酸形式存在,且具有抗氧化、抗炎症、调节免疫、保护脏器等多方面的生物学功能。
2.1 硒蛋白(多肽)
ROMAN等[25]研究表明,硒是几种具有重要生物学功能蛋白活性位点的关键成分,且多种硒蛋白在转录机制、氧化应激和氧化还原信号调节中发挥作用,硒通常以硒代半胱氨酸的形式在硒蛋白中发挥生理活性[26]。以富硒酵母菌株库德里阿兹威氏毕赤酵母XJ1-3为试验菌株,邓乾坤等[27]发现,碱法提取酵母富硒蛋白最佳提取条件为NaOH浓度0.1 mol/L,液料比7.5∶1(mL∶g),提取时间140 min。在此优化条件下,酵母富硒蛋白的提取率达到12.62%,酵母富硒蛋白中硒含量为358.9 μg/g,富硒酵母细胞通过生物作用将无机硒转化为有机硒,使硒与细胞内部的蛋白质和多糖结合。通常,硒原子取代甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)中的硫原子,成为氨基酸中的一部分,进而形成硒蛋白。生物活性肽是一种由短氨基酸序列组成的特异性蛋白质片段,而富硒生物活性肽是在一定条件下将无机硒与多肽通过螯合反应所得到的产物,相比硒蛋白而言,硒肽具有更高的消化率和吸收率,且具备生物活性肽的多种生物学功能[28]。微生物来源富硒生物活性肽主要有两种方式:①酶解含硒蛋白产生富硒肽;②微生物转化法将无机态硒转化为结合态富硒肽。大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶酶解作用后再分离、纯化得到的混合物,高思薇等[29]通过分析富硒大豆多肽体内吸收效率发现,硒以大豆肽为载体,可以显著提高其体内吸收率,在合理控制剂量的前提下,富硒大豆肽可以作为人体补硒的优选方式之一。
2.2 硒多糖
硒多糖是通过硒化修饰多糖形成的化合物,在具备补硒功效的同时,也具有较高的生物活性[30]。王路瑶[31]通过研究确定产胞外多糖的最佳营养因素组合:葡萄糖35.59 g/L、酵母粉25.58 g/L、马铃薯浸出汁30.56%(质量分数)和豆芽汁20.29%(质量分数)。基于摇瓶发酵优化条件,再利用10 L发酵罐扩大培养,产胞外多糖产量进一步提高到28.2 g/L。在10 L发酵罐中进一步分别对Na2SeO3和流加培养基的浓度进行了控制和优化,获得胞外硒多糖的最高产量为26.8 g/L,比未优化前提高了523.26%,其硒含量为1 205.15 μg/g,是摇瓶发酵产量的1.52倍。通过红外光谱和扫描电镜分析,得出硒通过O—O键或Se
O键与胞外多糖结合,从而改变了胞外多糖的形态。罗盈依[32]以红平菇P043为实验菌株,在最优富硒培养条件Na2SeO3质量浓度7.5 mg/L,pH 7.0和转速200 r/min下,菌丝有机硒含量22.24 mg/kg和总糖含量88.60 g/100 g,结果表明红平菇P043具有良好的硒富集能力和多糖转化能力。REN等[33]通过红外光谱分析,得出富硒香菇中硒与多糖的连接方式除了O—Se—O、SeO外,还有Se—O—C结构,说明硒与多糖的连接方式是硒酸酯结构,此外常见的还有Se—C和Se—H结构[34]。
2.3 硒核酸
核糖核酸可以结合并携带硒元素,Se进入RNA中的tRNA并对翻译蛋白质过程有促进作用。酵母作为一种高核酸含量的物质,其体内核酸含量高达2.7%～11%。王新风等[35]发现,市售活性干酵母普遍具有耐硒富硒的能力,在无机硒添加量8 mg/L,pH 5.5,温度30 ℃,培养时间42 h摇瓶发酵富硒培养。在15%酵母、1.0% NaOH、2.0% CaCl2和搅拌时间60 min的提取条件下,提取的硒核酸中硒的含量为4 257 μg/g干重。
3 发酵富硒产物的生物活性
3.1 抗氧化活性
硒能够清除自由基中的羟基自由基(·OH)从而发挥抗氧化作用。在植物体内,硒参与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等功能性酶系的生成,功能性酶系有清除植物体内自由基,减少活性氧积累的功能,因此能有效抑制活性氧对生物分子造成的损害[21],此外硒对人及动物也具有抗氧化作用。黄轶驰等[36]研究发现,动物机体抗氧化作用机制分为清除活性氧和增强酶促抗氧化系统的抗氧化能力两种。硒在动物体内主要以硒蛋白、硒多糖形式发挥抗氧化作用。徐颖等[37]对纳豆菌进行富硒培养,在最佳发酵条件下,纳豆激酶活性为(40.56±0.19) FU/g,与自然发酵、纳豆菌发酵相比,经富硒纳豆菌发酵的鹰嘴豆,其超氧阴离子自由基(·O2-)清除率、·OH清除率和DPPH自由基清除率均提高了10%以上,表明富硒培养能提高生物体抗氧化能力。李理等[38]对传统发酵食品中分离的32株乳酸菌进行富硒培养并筛选,获得的富硒菌株可在发酵乳时使无机硒快速高效转化成有机硒,且显著提高了发酵乳的抗氧化活性,赋予发酵乳双重的功能特性。富硒发酵乳的·OH清除率为(45.69±3.61)%,是无机硒乳的2.99倍、无机硒发酵乳的2.49倍。姜冬洋等[39]在富硒发酵实验中发现,在硒质量浓度为60 μg/mL时黑木耳菌丝体发酵总硒含量最大,在最佳条件下富硒黑木耳菌丝体硒多糖提取率为(17.49±0.10)%。相比于对照组维生素C的DPPH、·OH的清除率,富硒黑木耳菌丝的清除率随硒多糖浓度不断增大,且均达到40%以上,并在总还原力试验中表现出较强的还原能力。
3.2 抗炎活性
硒的抗炎活性与抗氧化活性有较为密切的联系。当炎症发生时,硒可以抑制活性氧的生成,从而达到增强T细胞分化,改善机体免疫调节功能的目的。含有硒的化合物通常具有较好的抗炎活性[40],目前发现有抗炎作用的主要有谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、硒蛋白 S(selenoprotein S, SelS)、硒蛋白 K(selenoprotein K, SelK)、硒蛋白 P(selenoprotein P, SelP)等[41]。如下图1所示,在内质网中,硒蛋白部分通过影响蛋白折叠来调节炎症,其中硒蛋白 M(selenoprotein M, SelM)和硒蛋白 15(selenoprotein 15, Sep15)在蛋白质折叠中起关键作用[42]。人体缺硒不仅会降低机体的抗氧化能力、抑制硒蛋白的生物活性,还会导致炎症加剧。食用菌硒多糖能通过降低炎症因子mRNA表达,调节相关凋亡蛋白的表达等分子机制来减缓炎症的发生。王奕琦等[43]对樟芝菌液态发酵多糖富硒条件进行优化,发现樟芝菌硒多糖在富硒的同时,能够具有高于无硒多糖的抗炎活性。WANG等[44]研究发现,富硒黑木耳多糖通过减少小鼠海马体中促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1 β)的释放,能持续抑制由D-半乳糖诱导的神经炎症。
图1 硒蛋白的合成过程及抗炎活性表达[42]
Fig.1 The synthesis process of selenoprotein and the expression of anti-inflammatory activity[42]
3.3 调节免疫
免疫活性是多糖最显著的生物学活性之一,而硒也显著影响机体的免疫系统。越来越多的药理及临床研究表明,食用菌硒多糖可以通过促进细胞因子产生、影响细胞信号转导等途径调节和增强细胞的免疫功能[45]。研究表明,硒多糖通过刺激免疫细胞释放细胞因子白介素(interleukin, IL)、干扰素(interferon, INF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等发挥功能,其中免疫系统发挥功能的关键在于免疫细胞释放促炎细胞因子和抗炎细胞因子。LI等[46]发现富硒灰树花多糖不仅能够调节免疫细胞的活性促进细胞免疫反应,还能够调节肠道微生物群落改善肠道健康并增强机体免疫功能。不少研究表明,硒蛋白在调节免疫中发挥重要作用,例如硒蛋白SELENOK(硒蛋白 K)作为参与蛋白质翻译后修饰酶的关键辅助因子,有助于免疫调节[47],还有研究评估了富硒双孢蘑菇对免疫细胞的调节作用,结果表明硒蛋白可以增强免疫细胞的活性和增殖,还具有增强细胞免疫功能的作用[48]。FANG等[49]从富硒大米蛋白水解物(selenium-enriched rice protein hydrolysates, SPHs)中获得具有免疫调节活性的硒肽,并通过质谱鉴定及数据库比对确定SPHs的免疫调节活性与含硒肽结构中的硒代蛋氨酸(SeMet)序列相关。
3.4 抗肿瘤活性
硒具有抗肿瘤活性并且可降低患肿瘤概率。硒和多糖协同作用能表现出更强大的抗肿瘤活性,如图2,通过细胞实验,发现富硒平菇多糖对正常细胞无明显影响,但可以抑制癌细胞从上皮细胞到间质细胞的转化,有可能成为一种天然抗肿瘤药物[50]。在体外实验中,经松茸硒蛋白处理的血清能抑制K562细胞的增殖,从而引起细胞凋亡形态学改变和核间体DNA断裂[51]。ZHOU等[52]在制备柠檬多糖纳米硒的实验中,结果显示出对HepG2细胞的杀伤作用较强,能有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。
图2 硒多糖的生物活性表达[50,53]
Fig.2 The bioactive expression of selenoglycans[50,53]
3.5 其他生物活性
LIU等[54]证实了富硒大豆多肽可通过提高GSH-Px活性和GSH的含量,提高肝细胞存活率,抑制肝星状细胞的活化,从而缓解四氯化碳引起的肝纤维化损伤。黄晶等[55]发现,富硒灵芝多糖对妊娠期糖尿病大鼠脂肪酸代谢具有明显的调控作用,其可通过调节脂肪酸α-氧化和β-氧化相关蛋白酶,特别是调节β-氧化相关蛋白酶,进而降低血脂,改善肝功能,最终保护肝脏。另外,FANG[56]经实验发现,经过转录后的mRNA将从细胞核进入细胞质并与核糖体结合,而带有Se的反义DNA会阻断核糖体与mRNA的结合,如图3,还证明了硒核酸具有更强的核酸酶抗性,与核糖核酸酶H(ribonuclease H, RNase H)更好的相容性和更有效的细胞基因沉默,在反义药物发现方面具有巨大的潜力。
图3 核酸上的Se原子特异性修饰、作用表达及RNase H与硒修饰的DNA和RNA双链复合物的晶体结构[56]
Fig.3 Se atom-specific modification, action expression and the crystal structures of RNase H in complex with selenium-modified DNA and RNA duplexes on nucleic acids[56]
4 结语
微生物以其对硒元素较强的富集和转化能力,被研究者广泛关注,富硒载体也得到了有效的开发与利用。硒与微生物二者结合,展现出良好的生物活性,其中的硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是很好的补硒剂,但目前国内对硒核酸的研究内容较少。虽然对微生物发酵富硒条件的优化已比较成熟,但机体内的硒含量还有待提高,生物有机硒的构效关系、作用机理和代谢途径也尚未完全清楚,有待进一步研究。微生物发酵富硒及其产物生物活性研究进展有助于开发出更多的富硒微生物食品,为人类健康提供更大的价值。
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