米糠是稻谷加工的主要副产物,我国每年因加工产生的米糠高达1 000多万t,大多用于动物或渔业饲料,甚至被直接废弃[1]。研究表明,米糠中的多酚、黄酮、膳食纤维等表现出良好的生物活性[2-3]。此外,米糠蛋白含量丰富且来源广泛,是制备生物活性肽的优质来源。与米糠蛋白相比,米糠多肽具有抗氧化[4]、免疫调节[5]、抗肿瘤[6]、降血压[7]等多种生理功效。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)是氧化还原反应所需的重要辅酶之一,广泛存在于人体细胞中。具有DNA修复、促进细胞代谢以及抗氧化等作用[8]。随着年龄的增长,NAD+水平呈现下降趋势,导致与衰老相关疾病的出现。NAD+含量受NAD+合成酶或NAD+降解酶共同调控,靶向NAD+降解途径或提高NAD+水平有助于其参与细胞抗氧化过程。最近研究发现,CD38是一种NAD+降解酶,是导致衰老过程中NAD+下降的主要原因[9]。抑制CD38活性可以恢复NAD+水平,逐渐成为抗衰老研究的热门方向。

目前米糠多肽的提取大多采用单一酶处理,很少利用物理手段进行预处理,从而导致多肽得率较低。在相关的研究报道中,存在采用超声辅助酶解制备米糠多肽的案例[10],但鲜见高压均质辅助酶解工艺的详细研究。高压均质能够破坏蛋白质中大分子聚集体,提高其溶解性与稳定性,从而提高酶解效率。此外,目前针对不同品种米糠多肽的抗氧化活性研究鲜见报道。本文以不同稻米品种来源的米糠为原料,采用高压均质-酶法制备工艺提取多肽,将此条件下得到的抗氧化活性最高的米糠多肽进行分离纯化并鉴定。并且为探究米糠多肽的分子机制,解释米糠多肽的抗氧化机制和研发抗衰老靶向药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

籼稻菁两优溢香丝苗、莹香两优268、协和优香66。粳稻天隆优11569、港优1号、天隆优663:产地江苏盱眙(北纬32°43′～33°13′、东经118°11′～118°54′),由天津天隆科技股份有限公司提供。

1.1.2 试剂

碱性蛋白酶(20万 U/g)、铁氰化钾、FeCl3、三氯乙酸,KH2PO4、K2HPO4、NaOH、HCl,95%(体积分数)乙醇,DPPH,ABTS,葡聚糖凝胶(Sephadex G-25),以上试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GL16-FW-100多功能粉碎机,北京海富达科技有限公司;ATS高压均质机,安拓思纳米技术有限公司;ZWY-2102C恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;BY-600C低速离心机,湖南湘仪实验室仪器有限公司;Epoch2酶标仪,美国Thermo公司;ALPHA1-2LD冷冻干燥机,德国Christ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 米糠预处理

将新鲜米糠通过粉碎机粉碎,根据PHONGTHAI等[11]的方法对米糠进行脱脂,将脱脂米糠晾干,备用。

1.3.2 高压均质预处理参数的筛选

脱脂米糠粉加入去离子水配成一定料液比的米糠悬浮液,研究均质压力与料液比对米糠悬浮液影响。探究料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL),均质压力(20、40、60、80、100 MPa)对肽含量的影响。

1.3.3 单因素试验

固定时间2 h、pH 10、温度55 ℃,考察加酶量(2 000、2 400、2 800、3 200、3 600 U/g)对肽含量及还原力的影响。

固定加酶量3 200 U/g、时间2 h、温度55 ℃,考察pH值(9、9.5、10、10.5、11)对肽含量及还原力的影响。

固定加酶量3 200 U/g、时间2 h、pH 10,考察温度(40、45、50、55、60 ℃)对肽含量及还原力的影响。

固定加酶量3 200 U/g、pH 10、温度55 ℃,考察时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)对肽含量及还原力的影响。

1.3.4 正交试验

以酶解液的还原力为指标,基于单因素的试验结果,分别选取3个水平,进行L9(34)的正交试验。试验因素及水平见表1。

1.3.5 多肽及蛋白质含量的测定

取适量米糠酶解液,加入等体积的100 g/L三氯乙酸溶液,室温静置20 min,5 000 r/min离心10 min。采用Lowry法[12]测定多肽含量,多肽含量的计算如公式(1)所示:

肽含量/mg/g米糠

(1)

1.3.6 还原力测定

参考XIAO等[13]的方法并加以修改,1 mL的样品加入1 mL的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液和1 mL的10 g/L的铁氰化钾溶液,50 ℃水浴20 min,加入1 mL的100 g/L的三氯乙酸溶液,3 000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL的蒸馏水和0.5 mL的1 g/L的FeCl3溶液,700 nm测定溶液的吸光值。

1.3.7 DPPH自由基清除率测定

参考WANG等[14]的方法,1 mL样品加入1 mL的0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,避光静置30 min,517 nm处测定吸光值A1。等体积的乙醇溶液代替DPPH作为空白组A2,等体积的蒸馏水代替样品溶液作为对照组A0。其计算如公式(2)所示:

DPPH自由基清除率

(2)

1.3.8 ABTS阳离子自由基清除率测定

参考CARRILLO等[15]的方法。将7 mmol/L的ABTS试剂与等体积的2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合为ABTS母液,4 ℃避光条件下反应12～16 h,备用。将ABTS母液用去离子水稀释,直到在734 nm处吸光值达到0.7±0.02,即得ABTS工作液。1 mL样品加入3 mL ABTS工作液混匀,避光反应6 min,在734 nm处测定吸光值A1。等体积的蒸馏水代替样品溶液作为空白组A0,其计算如公式(3)所示:

ABTS阳离子自由基清除率

(3)

1.3.9 羟自由基(·OH)清除率测定

参考XU等[16]的方法,1 mL的样品加入0.5 mL的10 mmol/L的水杨酸溶液、0.5 mL的10 mmol/L的FeSO4溶液和0.5 mL的8.8 mmol/L的H2O2溶液,在510 nm处测吸光值A1。蒸馏水代替水杨酸溶液在溶液作为空白组A2,等体积的蒸馏水代替样品溶液作为对照组A0。其计算如公式(4)所示:

·OH清除率

(4)

1.3.10 超滤分离

使用截留相对分子质量为3、10 kDa的超滤管对米糠蛋白酶解液进行超滤,得到UF1(Mw<3 kDa)、UF2(3 kDa<Mw<10 kDa)和UF3(Mw>10 kDa)3个不同的组分。测定各组分的抗氧化活性。

1.3.11 凝胶色谱分离

参考FENG等[17]的方法稍作修改,对超滤后抗氧化活性最高的组分用超纯水配制成80 mg/mL的溶液,经0.22 um的水膜过滤后,利用Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离。参数设置如下:上样量1.5 mL,洗脱液为超纯水,流速0.5 mL/min,检测波长280 nm,按峰收集洗脱液。冷冻干燥后测定抗氧化活性,选取活性最高的组分用于后续分析。

1.3.12 LC-MS/MS鉴定

委托科学指南针平台完成纯化肽的结构鉴定。质谱采用Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher)进行质谱分析,分析时长:60 min。检测方式:正离子。质谱测试原始文件用软件MaxQuant 1.5.5.1检索相应的数据库,最后得到蛋白质鉴定及定量分析结果。

利用PeptideRanker对质谱鉴定的肽段进行生物活性评分,评分>0.5时,结果具有可靠性。

1.3.13 分子对接

通过检索PDB蛋白数据库(www.rcsb.org/)获取CD38(PDB ID:3DZK)的蛋白晶体结构,使用Discovery Studio软件对受体蛋白处理。多肽的3D结构由Chem Draw 7.0构建。根据结合能大小对结果进行排序和可视化分析。

1.3.14 数据处理

数据均采用Excel 2016和SPSS 25.0统计软件进行处理,实验结果重复3次,数据结果以平均值±标准差表示,使用Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 高压均质单因素试验

由图1-a可知,均质压力在20～60 MPa时,米糠肽含量随压力的升高不断增加,压力为60 MPa时,含量达到最高,与未均质的米糠悬浮液相比,米糠肽的含量提升了2.5倍左右。随着压力继续升高,由于蛋白受到压力过大,蛋白质暴露的亲疏水基团的平衡被打破,导致蛋白质沉淀,溶肽含量降低[18];由图1-b可知,随着料液比的增大,肽含量呈下降趋势,当料液比为1∶10(g∶mL)时,肽含量虽增加,但由于溶液浓度较大,均质过程中会引起机器堵塞,造成机器损伤。因此选择均质压力为60 MPa,料液比为1∶15(g∶mL)。

2.2 酶解单因素试验结果

如图2-a所示,加酶量为2 000～3 200 U/g时,肽含量与还原力逐渐增加,加酶量为3 200 U/g时,肽含量以及抗氧化活性最高,大于3 200 U/g时,出现下降趋势。可能是因为体系中加酶量过高,导致酶与酶之间产生竞争,导致肽的生成量减少,抗氧化活性降低[19]。此外,酶本身作为一种蛋白质,结构复杂,当加酶量过高时,酶分子之间作用更加频繁,可能导致酶发生降解,酶解效率下降[20]。因此确定最佳加酶量为3 200 U/g。

如图2-b所示,随着pH的升高,肽含量以及还原力呈上升趋势,pH=10时,肽含量以及还原力最高,pH>10时,两者均会下降。原因可能是,由于酶的催化作用需要一定的pH,超出这个范围,酶的空间结构受到干扰,从而降低酶活力[21],所以确定最佳反应pH值为10。

如图2-c所示,随着温度的升高,肽含量以及还原力不断升高,55 ℃时达到最高,随后下降。这是由于当温度过高时,酶的天然构象受到破坏,酶的活性受到抑制甚至失去活性,抑制了多肽的生成[22]。因此确定最佳反应温度为55 ℃。

如图2-d所示,随着时间的增加,肽含量以及还原力不断升高,酶解时间为2 h时,达到最高,继续增加酶解时间,肽含量以及还原力出现下降。可能由于酶解时间过长,蛋白质发生聚集沉淀,导致提取率降低[23]。因此选择最佳酶解时间为2 h。

2.3 正交试验结果

由表2可知,因素主次顺序为:B>C>D>A,即影响米糠多肽还原力的因素主次顺序为:酶解温度>pH>酶解时间>加酶量,最佳酶解条件是A2B2C2D2,即加酶量3 200 U/g,酶解温度为55 ℃、pH 10、酶解时间2 h。在此条件下进行3次平行试验,还原力可达0.762。根据最佳工艺提取不同品种米糠多肽,米糠肽含量分别是:莹香两优268为46.82 mg/g米糠、协和优香66为59.86 mg/g米糠、菁两优溢香丝苗为62.84 mg/g米糠、天隆优663为73.71 mg/g米糠、港优一号为73.97 mg/g米糠、天隆优11569为89.95 mg/g米糠。

2.4 不同来源的米糠多肽的抗氧化活性比较

如表3所示,粳稻中港优一号抗氧化活性高于粳稻其他品种;籼稻中菁两优溢香丝苗的抗氧化活性高于籼稻其他品种。菁两优溢香丝苗DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率显著高于港优一号(P<0.05),·OH与还原力无显著性差异(P>0.05)。此外,在所有品种的抗氧化活性比较中,与天隆优663相比,菁两优溢香丝苗的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH清除率分别提高了71.78%、11.94%、23.77%;还原力提高了6.06%。因此,菁两优溢香丝苗显示出良好的抗氧化性能,可能具有潜在的抗衰老作用,进而开展后续实验进行功能表征。

2.5 分离纯化

由图3可知,超滤分离后得到UF1(Mw<3 kDa)、UF2(3 kDa<Mw<10 kDa)和UF3(Mw>10 kDa)3个组分,UF1组分的抗氧化活性最好,显著高于其他组分(P<0.05),其DPPH自由基清除率为76.6%,还原力为0.06。研究表明,分子质量小的多肽抗氧化活性更高,可能是由于分子质量小的多肽具有较小的空间位阻,可以作为更好的电子供体,与自由基发生反应,将其转化为更稳定的产物[24]。UF1组分经Sephadex G-25分离后,得到2个组分F1、F2(图4),收集测定各组分的抗氧化活性。由图5可知,F2组分的抗氧化活性显著高于F1组分(P<0.05)。因此选取F2组分进行下一步分析。

2.6 多肽的结构鉴定及虚拟筛选

通过LC-MS/MS共鉴定出979条多肽序列。检测到的肽段分子质量在399～2 517 Da,根据PeptideRanker活性评分结果,筛选出60条多肽序列。将得到的配体与CD38蛋白进行分子对接,按照对接结果的-CDOCKER_ENERGY数值进行排序,对接结合能如表4所示。

2.7 分子对接

分子对接用于表明多肽与CD38的确切结合位点。对结合能最高的YGGGY进行可视化分析,如图6所示。

YGGGY与CD38的关键氨基酸残基Thr221、Lys129、Asp156形成氢键作用,与Trp125形成π-π相互作用,与氨基酸残基Trp189、Glu146、Arg127、Asp155形成盐桥相互作用,还与CD38的一些残基形成范德华相互作用,包括Leu157、Leu145、Val185等。多肽YGGGY含有芳香环,芳香环能与·OH发生反应,增强抗氧化功效[25]。多肽YGGGY的N端为酪氨酸,研究发现Tyr位于肽的N端比C端抗氧化能力更好,这与GIRGIH等[26]研究结果相仿。综上所述,目标肽在CD38蛋白的活性位点与CD38蛋白形成较强的氢键网络,抑制了NAD+降解酶的活性,从而发挥了抗氧化作用。

3 结论

采用均质-酶法提取米糠多肽,通过单因素与正交试验确定了最佳提取条件。将提取的的多肽进行抗氧化活性测定发现,不同品种之间抗氧化活性差异较大,其中籼米中菁两优溢香丝苗多肽的抗氧化活性最好。分子对接结果发现,多肽YGGGY与CD38蛋白结合良好,暗示多肽可能通过抑制NAD+降解酶的活性来促进抗氧化。由于分子对接是一种虚拟筛选的方法,后续可通过果蝇、线虫等生物进行体内实验进一步验证多肽的抗氧化能力,从而深入研究抗衰老机制。

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Preparation and identification of rice bran antioxidant peptide by high-pressure homogenization-assisted enzymatic method

YAN Chengcheng, LI Ziteng, WANG Fang*, WANG Ruhua

(College of Food Science and Engineering, Tianjin University of Science &Technology, Tianjin 300457, China)

ABSTRACT Rice bran peptides were extracted by high-pressure homogenization-assisted enzymatic extraction technology from three varieties of indica rice bran and three varieties of japonica rice bran.The peptides in the enzymatic hydrolysate were separated, purified and identified to investigate their anti-aging mechanism.Results showed that the optimal extraction conditions for rice bran peptides based on peptide content and reducing power when the homogenization pressure was 60 MPa, the material-to-liquid ratio was 1∶15 (g∶mL), enzyme dosage was 3 200 U/g, enzymolysis time was 2 h, pH was 10, and enzymolysis temperature was 55 ℃.The protein hydrolysate with the highest antioxidant activity has been identified.Totally sixty peptides with good activity were obtained through ultrafiltration, Sephadex G-25 separation and purification, and LC-MS/MS analysis.The results of molecular docking showed that the peptide YGGGY had the lowest binding free energy, and it interacts with the active site of the CD38 protein (NAD+ degrading enzyme) through hydrogen bonding, van der Waals forces, salt bridges, etc.This suggested that it had the potential function of inhibiting the activity of the NAD+ degrading enzyme so that the organism could provide sufficient NAD+ content against oxidative stress and slow down aging.It provides a scientific basis for analyzing and interpreting the antioxidant mechanism of rice bran peptide and for the development of whole grain products.

Key words rice bran;high-pressure homogenization;enzymatic extraction;separation and purification;molecular docking

第一作者：硕士研究生(王芳副教授为通信作者,E-mail:wf7599@163.com)

基金项目：天津市水稻现代农业产业技术体系创新团队项目(ITTRRS2021100006)

收稿日期：2023-12-07,改回日期:2024-01-08

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038190

引用格式：闫程程,李紫藤,王芳,等.米糠中抗氧化肽的高压均质-酶法制备及鉴定[J].食品与发酵工业,2024,50(21):95-101.YAN Chengcheng, LI Ziteng, WANG Fang, et al.Preparation and identification of rice bran antioxidant peptide by high-pressure homogenization-assisted enzymatic method[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(21):95-101.