蛋白酶是一类能水解蛋白质和多肽类物质的酶的总称,是最早被研究的酶类之一。每年全球销售的商业酶中,蛋白酶约占60%[1]。根据其不同来源,蛋白酶可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。与动植物蛋白酶相比,微生物蛋白酶具有种类丰富、原料不受限制、便于工业化生产等优点,因此,微生物产蛋白酶已成为蛋白酶制剂的主要来源,工业上超过2/3的蛋白酶来自于微生物发酵生产[2]。例如,蜡样芽孢杆菌[3]、铜绿假单胞菌[4]、假坚固芽孢杆菌[5]、枯草芽孢杆菌[6]等细菌已用于生产工业用蛋白酶。细菌蛋白酶凭借其高催化活性和高生产能力的优点,在洗涤剂、皮革、饲料、食品加工、制药等不同行业都有着广泛应用[7]。
在皮革行业中,脱毛工序是产生绝大多数污染废水的主要工序[8]。目前,由石灰和硫化物组成的化学脱毛体系在皮革脱毛中应用最为广泛。这种方法是依靠硫化物分解毛发结构来达到脱毛目的,因此废水很难处理[9]。化学脱毛废水中的化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)、五日生化需氧量(five-day biochemical oxygen demand,BOD5)和硫化物含量等指标远高于废水排放的环保要求,导致废水处理负担沉重。近年来,许多研究致力于在皮革酶法脱毛工艺应用,以替代全部或部分传统化学品,从而减少污染量,减轻环境保护的压力。近年来,国内外有很多皮革脱毛酶的研究,包括来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶[10-12]、蜡样芽孢杆菌的碱性蛋白酶[13]、枯草芽孢杆菌的角蛋白酶[14-15]以及铜绿假单胞菌的角蛋白酶[4]。除了无毒和对环境无害外,在脱毛过程中,酶的处理不会完全水解毛发结构。在这种情况下,处理后毛发的主体仍然存在,这将大大减少脱毛废水中的化学需氧量、生化需氧量和硫化物含量[16]。然而,由于酶的成本较高,而且会对皮革的胶原纤维造成破坏,因此酶法脱毛的应用仍然有限,远未达到实际可行的程度。
本研究从一株高产蛋白酶的菌株淀粉液化芽孢杆菌BS5582出发,优化了其产酶条件并进一步研究了其酶学性质,最终将该菌株产蛋白酶在牛皮脱毛中进行应用。淀粉液化芽孢杆菌BS5582产蛋白酶表现出良好的牛皮脱毛能力且胶原活性低,在制革行业清洁生产上有一定的应用前景。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens BS5582,CGMCC 1314)为作者所在实验室前期筛选得到且保藏于本实验室。
1.1.2 酶制剂
中性蛋白酶,最适温度为45～55 ℃,最适pH值为5.5～7.0;碱性蛋白酶,最适温度为35～45 ℃,最适pH值为9.0～10.5;角蛋白酶,最适温度为50～60 ℃,最适pH值为10.5～11.5。均购自白银赛诺生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
种子培养基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0;pH 7.0。
基础发酵培养基(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨10.0,Na2HPO4·12H2O 6.0,KH2PO4 4.0,MgSO4 1.0和CaCl2 1.0;pH 7.0。
优化发酵培养基(g/L):玉米粉50.0,豆饼粉40.0,Na2HPO4·12H2O 6.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 1.8和CaCl2 0.75;pH 6.5。
1.1.4 仪器与设备
SW-CJ-1FD型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;BSP-250型恒温培养箱,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;HYL-C3型组合式摇床,太仓市强乐实验设备有限公司;5804R型台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;UV-1100型紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;AX2202ZH/E型电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;FE28型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DIGESTOR 8型消解仪,丹麦FOSS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株培养方法
种子培养:接斜面菌种一环于种子培养基中,180 r/min旋转式摇床培养12 h,培养温度37 ℃。
摇瓶发酵:在250 mL三角瓶中,装入25 mL发酵培养基,0.1 MPa灭菌20 min,接种量4%,于200 r/min培养,培养温度37 ℃。
1.2.2 蛋白酶活力的测定
参照国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中福林法测定蛋白酶活力。酶活力定义:在 40 ℃时1 mL酶液1 min催化酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需要的酶量为1个蛋白酶活力单位。
1.2.3 培养基组成对菌株产蛋白酶的影响
1.2.3.1 碳源种类及浓度对产酶的影响
在基础发酵培养基中分别用10 g/L乳糖、麦芽糖、玉米粉、可溶性淀粉和糊精代替葡萄糖作为碳源,发酵48 h后,测定上清液的酶活力确定合适的碳源。在此基础上,设定较优碳源的不同添加量(10、20、30、40、50、60、70 g/L),培养48 h后测定上清液酶活力,确定碳源的较优添加量。
1.2.3.2 氮源种类对及浓度对产酶的影响
在培养基中分别添加10 g/L蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、尿素和硫酸铵作为氮源,发酵48 h后,测定上清液的酶活力确定较优氮源。在此基础上,设定较优氮源的不同添加量(10、20、30、40、50、60、70 g/L),培养48 h后测定上清液酶活力,确定氮源的较优添加量。
1.2.3.3 无机盐的浓度优化
在培养基中分别依次添加不同浓度的Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4和CaCl2,考察不同无机盐浓度对菌株产酶的影响。
1.2.4 发酵条件
1.2.4.1 培养基初始pH对产酶的影响
发酵培养基的初始pH值分别用HCl溶液(3.0 mol/L)和NaOH溶液(3.0 mol/L)调节至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,培养48 h后测定上清液酶活力,考察培养基较优初始pH。
1.2.4.2 装液量对产酶的影响
在250 mL三角瓶中分别装入10、15、20、25、30、35 mL发酵培养基进行发酵,培养48 h后测定上清液酶活力,考察三角瓶的较优装液量。
1.2.4.3 发酵温度对产酶的影响
分别采用31、33、35、37、39 ℃等温度进行发酵,培养48 h后测定上清液酶活力,确定最较优养温度。
1.2.4.4 接种量对产酶的影响
采用优化后的培养基,分别设置4%、6%、8%、10%、12%、14%的接种量,培养48 h后测定上清液酶活力,确定较优接种量。
1.2.5 蛋白酶酶学性质分析
1.2.5.1 最适反应pH和pH稳定性的测定
在pH 5.0～11.0的缓冲液中按标准方法测定酶活力,pH 5.0～7.5使用20 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,pH 8.0～9.0使用20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液,pH 9.5～11.0使用20 mmol/L的硼酸-硼酸钠缓冲液,以最大酶活力为100%,确定最适作用pH。40 ℃下,在不同pH缓冲液体系中保留60 min,取样测定残余酶活力,以处理前的酶活力定为100%,得到pH稳定性曲线。
1.2.5.2 最适反应温度和温度稳定性的测定
在20～70 ℃每隔5 ℃测定蛋白酶活力,并以最大酶活力定义为100%,绘制酶活力温度曲线,确定最适反应温度。分别在各温度条件下保温60 min,以保温前该温度下的酶活力定为100%,绘制温度稳定性曲线。
1.2.5.3 金属离子对酶活力的影响
考察金属离子对蛋白酶活力的影响时,所用金属离子包括Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+,将酶液与金属离子母液混合至离子终浓度5 mmol/L,分别测定酶活力,以未经处理的酶液活力定义为100%。
1.2.5.4 抑制剂和表面活性剂对酶活力的影响
在酶液中加入苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol,β-ME)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Triton-X、Tween20、Tween80等抑制剂和表面活性剂至终浓度为5 mmol/L,分别测定酶活力,以未经处理的酶液活力定义为100%。
1.2.6 蛋白酶牛皮脱毛应用
1.2.6.1 脱毛方法
切下一块约5 cm×5 cm的牛皮置于250 mL三角瓶中,按照料液比1∶3加入一定浓度的酶溶液和几颗玻璃珠。将三角瓶放在恒温摇床中,40 ℃ 160 r/min作用8 h。
1.2.6.2 毛发残留率的测定
在一块5 cm×5 cm脱毛后的牛皮上画出3 cm×3 cm的方格,取4个角上和中心位置的方格并记录残留毛发的数量,取3次不同部位的3 cm×3 cm方格并计算3次取平均值,最后的毛发残留率以R表示,单位为“根/cm2”。
1.2.6.3 脱毛液中羟脯氨酸含量测定
(1)试剂配制
羟脯氨酸标准溶液:准确称取100 mg羟脯氨酸,用蒸馏水溶解定容至100 mL,即得到1 mg/mL羟脯氨酸溶液。取2 mL用200 mL容量瓶定容。再取上述溶液5、10、20、30、40、50 mL定容至50 mL。(质量浓度即为1、2、4、6、8、10 μg/mL)。
柠檬酸缓冲液(pH 6):称取37.5 g二水柠檬酸钠、5.5 g一水柠檬酸、57 g三水醋酸钠和385 mL异丙醇,用蒸馏水定容至1000 mL。
氯胺T溶液:将1.41 g氯胺T溶解于20 mL水中,加入50 mL柠檬酸缓冲液(pH 6),再用异丙醇定容至100 mL,使用前制备。
高氯酸溶液:取70 mL和200 mL 70%高氯酸溶液,分别用蒸馏水定容至250.00 mL,得到浓度为3.15 mol/L和57%的高氯酸溶液。
艾氏试剂:将20 g对二甲氨基苯甲醛溶于30 mL 57%高氯酸溶液,避光保存。使用前,取5 mL上述溶液,用异丙醇定容至25.0 mL
(2)脱毛液的消解
将脱毛废液8 000 r/min离心10 min,取4 mL上清液于消解管中,加入4 mL 12 mol/L浓盐酸,在120 ℃的消解仪中消解12 h。消解结束后用NaOH溶液调节pH至6～6.5,再用去离子水定容至100 mL。
(3)比色法测定羟脯氨酸含量
取1 mL消解液于比色管中,加入1 mL柠檬酸缓冲液混匀后加入1 mL氯胺T,混匀后放置5 min;加入3.15 mol/L高氯酸1 mL,混匀后放置5 min;加入1 mL艾氏试剂,混匀后于65 ℃干式恒温仪中保温15 min;在冷水浴中冷却3 min,静置30 min后,以未加入羟脯氨酸的试样为空白测定其在560 nm波长处的吸光度值。
1.2.6.4 扫描电镜分析
为表征脱毛效果与胶原纤维松散效果,将脱毛后的牛皮切成小块放入冷冻干燥机中-50 ℃进行48 h冷冻干燥。所有皮革样品的表面和横截面被切割尺寸为2 mm×2 mm,厚度约1 mm,固定在导电样品平台上,进行镀金处理,以增加导电性。最后,用FEI Quanta 250 FEG扫描电子显微镜观察脱毛牛皮表面毛孔形态和皮肤横截面胶原纤维结构形态。
1.2.6.5 脱毛废水污染指标的测定
脱毛废水经过40目筛网粗过滤后,测定总固体悬浮物(total suspended solids,TSS)、COD、BOD5 三项指标。TSS指标测定参照GB/T 11901—1989《水质 悬浮物的测定 重量法》;COD指标测定参照HJ 828—2017《水质 化学需氧量的测定 重铬酸盐法》;BOD5指标测定参照HJ 505—2009《水质 五日生化氧量(BOD5)的测定 稀释与接种法》。
2 结果与分析
2.1 培养基成分对产酶活力的影响
2.1.1 碳源及碳源浓度对产酶活力的影响
碳源参与菌体的生长和产物的合成,是构成细胞结构和代谢产物的重要营养物质[17],因此考察了不同碳源对菌株产酶的影响。如图1-a所示,以可溶性淀粉为碳源产蛋白酶活力最高,达到364.31 U/mL。使用为碳源时得到的酶活力次之,但是与可溶性淀粉相比没有显著差异。由于玉米粉中含有一定的氮源和微生物生长必须的生长因子,可以促进菌株的生长,且其价格与可溶性淀粉相比较低廉,因此选择玉米粉作为较优碳源。考察玉米粉质量浓度对菌株发酵产酶的影响(图1-b),发现当玉米粉的质量浓度达到50.0 g/L时,菌株产酶活力最高,因此较优玉米粉质量浓度为50.0 g/L。
a-碳源种类;b-玉米粉质量浓度
图1 碳源种类及玉米粉质量浓度对蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of carbon source type and corn powder concentration on protease activity
2.1.2 氮源及氮源浓度对产酶活力的影响
氮源是构成细胞核酸和蛋白质的重要元素,是细胞生长和形成代谢产物的重要营养物质,可分为有机氮源和无机氮源。有机氮源含有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸,还含有多糖、脂肪、维生素、微量元素和生长素,属迟效氮源,而无机氮源一般属速效氮源。在基础发酵培养基中分别添加蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、尿素和硫酸铵作为氮源,发酵结果如图2-a所示。BS5582菌株利用酵母膏、牛肉膏和豆饼粉产蛋白酶水平较高,利用蛋白胨产蛋白酶水平一般,而尿素和硫酸铵都不能被很好利用。一般有机氮对菌体产酶的效果比无机氮更好,豆饼粉中含丰富的大分子蛋白类、多肽、氨基酸和微量元素,属迟效氮源,可以保证发酵后期的氮源量,可作为蛋白酶分泌的诱导物,且价格低,适宜于发酵生产。酵母浸膏、牛肉浸膏含较多的氨基酸,是速效氮源,但价格偏贵。因此,豆饼粉为较优氮源。进一步考察了不同浓度豆饼粉条件下菌株的产酶情况。如图2-b所示,当豆饼粉质量浓度为40.0 g/L时BS5582菌株产蛋白酶的酶活力最高,达到3 590.59 U/mL。
a-氮源种类;b-豆饼粉质量浓度
图2 氮源种类及豆饼粉浓度对蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of nitrogen source type and soybean powder concentration on protease activity
2.1.3 无机盐浓度对产酶活力的影响
磷是核酸、磷脂和蛋白质的重要成分,构成高能磷酸化合物,是许多酶的活性基;钠维持细胞的渗透压,促进菌体的生长繁殖;钾是许多酶的激活剂,在芽孢杆菌生长过程中参与胞内物质运输系统的组成,可以促进糖类的代谢,控制细胞质膜的透性。培养基的pH要适合微生物的繁殖要求,但菌体的代谢产物会改变pH,因此在配制培养基时,不仅培养基的起始pH符合微生物的要求,而且要考虑采用何种缓冲液作用保持pH。芽孢杆菌前期利用碳源产酸使pH降低,后期利用氮源使pH升高,在一定范围内,磷酸根对培养基pH的变化起缓冲作用。因此本实验设计在培养基中分别依次添加Na2HPO4·12H2O和KH2PO4提供磷、钠和钾保证菌体生长和产酶需要,同时由于这2种无机盐能形成一定的缓冲体系,保证菌体的生长和酶的分泌表达。发酵结果如图3-a所示,KH2PO4可以促进BS5582产蛋白酶,当Na2HPO4·12H2O和KH2PO4的质量浓度分别为6.0 g/L和3.0 g/L时,蛋白酶活力达到最高。镁是许多酶的激活剂,对控制核蛋白体的聚合作用起着重要的作用,钙控制细胞的生理状态以及许多酶的稳定剂[18]。在发酵培养基中分别添加不同浓度的MgSO4和CaCl2,发酵结果如图3-b所示,MgSO4和CaCl2的质量浓度分别为1.8 g/L和0.75 g/L时,蛋白酶酶活力达到最高。
a-Na2HPO4·12H2O;b-KH2PO4;c-MgSO4;d-CaCl2
图3 无机盐浓度对蛋白酶活力的影响
Fig.3 Effect of inorganic salt concentration on protease activity
2.2 发酵条件对产酶活力的影响
2.2.1 培养基初始pH对产酶活力的影响
培养基的pH值会通过影响细胞膜所带的电荷改变膜的通透性,同时会影响培养基中有机化合物的离子化程度,影响细胞对营养物质的吸收,影响细胞生长和代谢产物的分泌,而且会影响酶的活力,因此在发酵过程中需要维持一定的pH,以维持微生物的正常代谢[19]。由于摇瓶发酵过程中的培养基pH无法检测和控制,因此一般考察培养基初始pH。调节发酵培养基的初始pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,发酵48 h后,离心测定上清液酶活力。从图4-a可以看出,培养基初始pH值为6.0～7.0,蛋白酶酶活力均较好,pH值为6.0～6.5时,产酶最高。因此,选择pH 6.0为较优初始pH值。
a-培养基初始pH;b-发酵温度;c-接种量;d-装液量
图4 发酵条件对产蛋白酶活力的影响
Fig.4 Effect of fermentation conditions on protease-producing activities
2.2.2 发酵温度对产酶活力的影响
在酶制剂生产中,发酵温度影响微生物的生长繁殖、代谢以及培养基的溶氧及黏度等,合适的发酵温度,既有利于菌体生长同时能保证目标产物的合成[20]。分别采用31、33、35、37、39 ℃进行发酵。发酵结果如图4-b,温度过高和过低都不利于蛋白酶的合成,发酵温度为35 ℃时,产酶最高。
2.2.3 接种量对产酶活力的影响
接种量的多少会影响菌体发酵过程中的延滞期,发酵周期和代谢副产物等。接种量过少会导致发酵初始菌体浓度过低,使迟滞期延长,酶合成速率降低,接种量过多可能导致发酵初期菌体过快生长,过多消耗了营养物质,影响酶的合成[21]。采用优化后的培养基分别设置4%、6%、8%、10%、12%、14%的接种量,发酵结果如图4-c所示,接种量为10%时,产酶最高。
2.2.4 装液量对产酶活力的影响
发酵培养好氧性微生物时,需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和代谢产物的合成,微生物所能利用的是溶解于培养基中的氧,溶氧的大小对菌体的生长和产物的性质和产量都会产生不同的影响。实验室一般通过改变三角瓶的装液量和摇床的转速来改变溶氧的大小。在250 mL三角瓶中分别装入不同体积的培养基进行发酵,于37 ℃发酵48 h后,测定上清液中的酶活力。从图4-d可以看出,装液量对菌株产蛋白酶的影响较显著,可见溶氧对蛋白酶的产量有很大的影响,在溶氧偏低时,供氧不足,产酶降低。当培养基装液量为15 mL时,产酶最高。
优化后的发酵培养基(g/L):玉米粉50.0,豆饼粉40.0,Na2HPO4·12H2O 6.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 1.8和CaCl2 0.75;优化后的发酵条件为培养基初始pH 6,发酵温度35 ℃,接种量10%,装液量15 mL。该条件下,培养48 h后粗酶液酶活力达到(5 270.59±19.61) U/mL,是优化前的21倍。
2.3 B.amyloliquefaciens BS5582蛋白酶酶学性质研究
2.3.1 酶的最适温度及温度稳定性
蛋白酶活力的温度曲线如图5-a所示,蛋白酶在40～60 ℃具有较高的蛋白酶活力,在20～45 ℃处理1 h后仍能保持80%以上的酶活力,当温度继续升高至60 ℃以上后,蛋白酶的剩余活力急剧下降,在70 ℃ 处理1 h后蛋白酶完全失活。40 ℃时,蛋白酶活力最高且处理1 h后酶活力损失也相对较小,因此BS5582菌株产蛋白酶的最适温度为40 ℃。
a-温度;b-pH
图5 温度和pH对蛋白酶活力的影响及其稳定性
Fig.5 Effect of temperature and pH on protease activity and its stability
2.3.2 酶的最适pH及pH稳定性
蛋白酶活力的pH曲线如图5-b所示,蛋白酶在pH 7～9具有较高的蛋白酶活力,属于弱碱性蛋白酶。在pH 6～10处理1 h后仍能保持50%以上的酶活力,可见BS5582蛋白酶在较宽的pH范围内都具有较高的稳定性。在pH 8.5时,蛋白酶活力最高且处理1 h后残留酶活力仍有85%左右,因此BS5582菌株产蛋白酶的最适pH值为8.5。
2.3.3 金属离子对酶活力的影响
不同金属离子对酶的活力可能产生不同影响,有些金属离子可以作为辅助因子,可以提高酶的活力和稳定性,进而促进酶的催化反应;有些金属离子对酶活力几乎无影响甚至可能抑制酶活力[22]。在酶液中添加不同的金属离子至终浓度5 mmol/L并测定蛋白酶活力,结果如图6-a所示,Mn2+对蛋白酶有显著的激活作用,添加Mn2+后酶活力为对照的4.3倍。Ca2+和Mg2+的添加对蛋白酶有轻微的激活作用。Li+、K+和Co2+对酶活力影响甚微。Zn2+和Cu2+对蛋白酶有一定的抑制作用,而Fe2+和Fe3+的添加会显著抑制蛋白酶活力。
a-金属离子;b-抑制剂和表面活性剂
图6 金属离子、抑制剂和表面活性剂对蛋白酶活力的影响
Fig.6 Effect of metal ions, inhibitors, and surfactants on protease activity
2.3.4 抑制剂和表面活性剂对酶活力的影响
在酶液中添加不同的抑制剂和表面活性剂至终浓度5 mmol/L并测定蛋白酶活力,如图6-b所示,PMSF为丝氨酸蛋白酶的抑制剂,添加PMSF之后的蛋白酶活力几乎丧失,可见该蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶。抑制剂EDTA、DTT和β-ME对该酶的抑制作用并不明显。表面活性剂SDS对该酶有一定的抑制作用,而Triton-X、Tween20、Tween80均对该蛋白酶具有激活作用。
2.4 B.amyloliquefaciens BS5582产蛋白酶在牛皮脱毛中的应用
2.4.1 B.amyloliquefaciens BS5582蛋白酶脱毛能力分析
将BS5582蛋白酶粗酶液稀释至100 U/mL牛皮脱毛实验,根据其酶学性质选择温度40 ℃、pH 8.5作为较优脱毛实验条件。选择3种市售酶制剂作为作为对照,同样稀释成100 U/mL的酶溶液并按照最适条件进行没脱毛实验。BS5582蛋白酶与3种市售蛋白酶制剂的脱毛效果照片如图7-a所示。BS5582产蛋白酶和市售碱性蛋白酶具有较好的脱毛效果,在8 h酶溶液处理后毛发基本脱落。市售中性蛋白酶和市售角蛋白酶则仍有较多毛发残留。值得一提的是,BS5582产蛋白酶脱毛后的废液中羟脯氨酸含量明显低于市售碱性蛋白酶(图7-b)。羟脯氨酸是皮肤中胶原蛋白所特有的一种氨基酸,脱毛废液中的羟脯氨酸含量可以间接表征酶对于真皮胶原成分的损伤程度[23]。由此可见,BS5582产蛋白酶在脱毛效果良好的同时,其较低的胶原活性也减轻了对牛皮的损伤,降低了后续成革质量出现问题的风险。
a-牛皮脱毛照片;b-毛发残留率和脱毛废液中羟脯氨酸含量
图7 BS5582产蛋白酶及市售蛋白酶脱毛能力分析
Fig.7 Dehairing effect of protease produced by B.amyloliquefaciens BS5582 and commercial proteases
2.4.2 脱毛牛皮扫描电镜分析
用扫描电镜进一步分析了经酶处理脱毛和灰碱法(硫化钠-石灰体系)脱毛处理的牛皮的表面和切面。如图8-a所示,化学脱毛后,毛发从发根处断裂并脱落。然而,大量的毛根仍留在毛囊中,脱下的毛发没有被完整的保留。这是由于化学法脱毛的原理是硫化钠与石灰为主的化合物直接作用于毛和表皮,打断毛和表皮中角蛋白分子结构里的双硫共价键,破坏毛和表皮的结构稳定性,使其逐步溶解,所以脱毛废液中有较多的毛渣。相比之下,酶法脱毛是让毛发从毛囊中完整的去除。酶脱毛后的毛孔更加细小,皮肤表面也更加光滑。牛皮切面的观察结果表明,在BS5582产蛋白酶作用下更好地去除了纤维间质,酶解脱毛能更有效地分散表皮中的胶原纤维束(图8-b)。这表明,与传统的化学脱毛相比,酶脱毛能够同时有效地脱毛和打通纤维束[24]。
a-牛皮表面;b-牛皮切面
图8 脱毛牛皮扫描电镜照片
Fig.8 SEM observation of dehaired cattle hide
2.4.3 脱毛废液污染指标分析
牛皮脱毛过程中产生的废水经过滤收集后进行污染指标分析,结果见表1。酶法脱毛所产生的的废水中各项污染指标明显低于传统化学脱毛,例如总固体悬浮物、化学需氧量、生化需氧量。硫化钠作为一种强碱性物质,溶解在水中后会产生有毒气体硫化氢和大量高碱性污染废水。酶法脱毛后废水的TSS、COD和BOD5分别为1 628.89、36 990.72、13 856.16 mg/L,比化学脱毛降低约87%、39%和45%。化学脱毛后的废水呈强碱性,而酶脱毛后的废水几乎呈中性。硫化钠是一种强碱性物质,溶解在水中会产生硫化物和高碱性废液,而酶脱毛废水主要取决于用于稀释或溶解酶的缓冲液,本研究中的缓冲液近似中性。此外,基于硫化物的脱毛方法具有毛发破坏性,导致废液中含有大量有机和无机污染物[25]。相比之下,在酶脱毛过程中,酶能有效水解毛孔中的一些交联物质,如黏蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖,从而破坏毛干和毛孔之间的紧密连接。因此,在一定的物理摩擦作用下,毛发可以完整保留并从毛孔中脱落。
表1 脱毛废水污染指标测定 单位:mg/L
Table 1 Pollution parameters of dehairing wastewater
废水指标灰碱法脱毛酶法脱毛pH值12.15±0.057.26±0.02TSS13 108.89±54.191 628.89±30.97COD60 637.20±1531.1136 990.72±584.96BOD525 067.32±1488.4113 856.16±373.49
3 结论与讨论
本研究对一株高产蛋白酶的菌株B.amyloliquefaciens BS5582进行了产酶条件优化,优化后酶活力达到(5 270.59±19.61) U/mL,相比优化前提高至21倍。菌株所产的蛋白酶最适温度和pH分别为40 ℃和8.5。其高蛋白酶活力具有良好的牛皮脱毛能力且胶原损伤小。相比于传统灰碱法脱毛,该蛋白酶脱毛后牛皮毛孔中无发根残留,毛发完整脱落。脱毛废水的污染指标TSS、COD和BOD5分别比化学脱毛降低约87%、39%和45%,符合绿色生产制造的理念,在制革行业清洁生产技术中有一定应用前景。
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