植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)广泛存在于自然发酵乳制品、肉类和植物基发酵食品中,具有多种生物活性,如调节免疫反应、降低血清胆固醇水平和调节肠道菌群平衡[1-2]。植物乳植杆菌代谢物是由植物乳植杆菌生长过程中产生的代谢物质,包括有机酸[3]、脂肪酸[4]、细菌素[5]等多种物质,这些物质在抵御致病菌、增强免疫力、促进肠道生态平衡方面发挥着重要作用。研究发现植物乳植杆菌L168及其代谢物吲哚-3-乳酸可通过调节抗肿瘤侵润CD8+T细胞的表观遗传学机制从而改善急性肠炎小鼠肠道炎症、肿瘤生长和肠道生态失调[6]。植物乳植杆菌SCB2505代谢物能明显抑制沙雷氏菌生物被膜合成,破坏细胞壁和细胞膜的完整性,使得菌体皱缩凹陷,甚至裂解死亡[7]。然而灭活菌对于机体健康的益处也陆续被报道。灭活的嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,Akk菌)具有改善高胰岛素血症和胰岛素敏感性的作用,其发挥益生机制的可能是得益于来自于外膜上的一种恒温蛋白,该蛋白可以提高肠道屏障功能,并对体重、脂肪葡萄糖代谢具有有益作用[8-9]。此外,在肉鸡日粮中添加灭活植物乳植杆菌可以增加有益菌的丰度、促进肠道发育及激活免疫反应,从而提高肉鸡的生长性能[10-11]。但关于灭活微生物对宿主机体的影响还有待进一步研究,其可能是一种有益的免疫调节剂。
代谢组学是一种能够详细评估生物系统内代谢成分的技术,可用于评估加工食品的质量、安全性和微生物特性变化。非靶向代谢组学能对样本中各类代谢物进行分析,测定各代谢物的含量、表征代谢物分子的表现型并对比不同样品组间的概况。微生物代谢组学不仅阐明了各种代谢途径的网络关系,而且阐明了微生物与宿主之间相互作用的机制[12]。本试验基于超高效液相色谱高分辨质谱(ultra high performance liquid chromatography orbitrap exploris mass spectrometry,UHPLC-OE-MS)技术结合多变量分析的方法探究灭活处理方式植物乳植杆菌产生的物质,找出植物乳植杆菌主要差异代谢物,探究其潜在的生物标志物,为灭活植物乳植杆菌的研发及其应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6株植物乳植杆菌原始菌株,由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库(Lactic Acid Bacteria Collection Center, LABCC)提供。乳酸菌细菌培养基MRS。甲醇、乙腈均为色谱级,德国CNW科技公司;乙酸铵为色谱级,美国Sigma公司;氨水为色谱级,美国Fisher Chemical公司。
1.2 仪器与设备
LRH-250电热恒温培养箱,上海一恒科技仪器有限公司;AR2202CN电子天平,奥豪斯仪器上海有限公司;Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris120高分辨质谱、Heraeus Fresco17离心机,美国赛默飞公司;PS-60AL超声仪,深圳市雷德邦电子有限公司;Bioscreen C全自动生长曲线测定仪,上海谓载商贸发展有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 植物乳植杆菌生长曲线测定
6株植物乳植杆菌原始菌株于-80 ℃保藏环境中取出,在4 ℃条件下解冻。解冻后的菌液接入MRS液体培养基中,37 ℃恒温静置培养24 h以活化菌株。按2%接种量取活化后的菌液接种于MRS液体培养基中,振荡混匀。然后将200 μL菌液打入孔板中,放入全自动生长曲线测定仪中进行检测,设定条件为:吸光度600 nm,温度37 ℃,时长30 h,每隔1 h 读取1次数据。
1.3.2 植物乳植杆菌代谢物的制备
将菌株经MRS液体培养基中活化2代后,以接种量2% 接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养18 h。然后在4 ℃,5 000 r/min离心10 min,收集上清液,记为对照组。另取等量菌液,经过65 ℃,30 min灭活后再4 ℃,5 000 r/min离心10 min,收集上清液,记为试验组。为了确保试验的代表性,每个培养基中取3个样。
1.3.3 UHPLC-OE-MS代谢组学分析
灭活和未灭活的植物乳杆菌离心上清液样品送至上海百趣生物医学科技有限公司进行非靶向代谢组学分析,具体操作如下。
1.3.3.1 样品预处理
移取100 μL样品至1.5 mL EP管,加入400 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1],涡旋混匀30 s,在冰水浴中超声10 min;-40 ℃静置1 h。然后在4 ℃,12 000 r/min离心15 min,取上清液于进样瓶中上机检测。所有样品另取等量上清混合成QC样品上机检测。
1.3.3.2 代谢物UHPLC-OE-MS的检测
将进样瓶中装入已预处理好的样品,放入4 ℃的进样盘中。使用Vanquish超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色谱柱对目标化合物进行分离[13]。液相色谱A相为水相,含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水,B相为乙睛。进样体积2 μL。
利用控制软件(Xcalibur 版本:4.4, Thermo)控制Orbitrap Exploris 120质谱仪进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下:鞘气流速:50 Arb,辅助气流速:15 Arb,毛细管温度:320 ℃,全MS分辨率:60 000,MS/MS分辨率:15 000,碰撞能:SNCE模式20/30/40 eV,喷雾电压为:3.8 kV(正离子)或-3.4 kV(负离子)。
1.4 数据处理
代谢组学原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后,使用R包进行代谢物鉴定,所用数据库为BiotreeDB(V3.0)[14]。使用MetaboAnalyst 5.0在线工具对差异代谢物进行KEGG 数据库富集分析。所得结果采用R包进行可视化分析。
2 结果与分析
2.1 植物乳植杆菌的OD600值变化
植物乳植杆菌在培养30 h过程中的OD600值变化趋势,如图1所示。结果表明,所有的菌株在10 h进入稳定期,在12 h基本趋于平缓。
图1 植物乳植杆菌在MRS培养基中OD600值的变化
Fig.1 Changes of OD600 values of L.plantarum in MRS medium
2.2 植物乳植杆菌代谢物的正交偏最小二乘法判别分析
由于主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种无监督分类模型,呈现的结果会受一些与分组无关的变量影响,不利于解析代谢物的显著差异性。通过正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)分析,可以过滤掉代谢物中与分类变量不相关的正交变量,并对非正交变量和正交变量分别分析。因此,利用OPLS-DA分类模型对代谢物进行表达,该模型的优势是有利于发现组间差异并能有效筛选差异代谢物。由图2-A可知,横坐标展示样本的组间差异,纵坐标表示样本的组内差异,两组的样本点在OPLS-DA得分图上可完全分开。为避免模型出现过度拟合现象,通过置换检验对模型有效性做进一步检验。本研究置换检验结果如图2-B所示。本研究置换检验模型为R2Y=0.92、Q2=-0.19,表明原模型不存在过拟合现象,具有一定意义。
A-OPLS-DA得分图;B-置换检验图
图2 植物乳植杆菌代谢产物的OPLS-DA得分图和置换检验图
Fig.2 OPLS-DA score plot and permutation test plot of Lactiplantibacillus plantarum metabolites
2.3 植物乳植杆菌代谢物差异物的鉴定
采用多维分析和单维分析相结合的办法筛选组间差异代谢物。根据OPLS-DA模型分析结果,对差异代谢物进行筛选,将t检验P值<0.05,OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(variable importance in projection,VIP值)>1和差异改变倍数(fold change,FC)>1.2或<0.8作为筛选条件,筛选到的差异代谢物火山图,如图3所示。结果表明,在本研究中共鉴定到24种差异代谢物,与对照组相比,试验组有19种上调的差异代谢物,即相对含量增加,占总差异代谢物的79.17%;有5种代谢物下调,即相对含量降低,占总差异代谢物的20.83%。基于FC>2,即试验组的相对含量比对照组高2倍以上,鉴定到的差异丰富的代谢物质有亮氨酸-组氨酸二肽、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)和L-精氨酸。
图3 植物乳植杆菌灭活与未灭活差异代谢物的火山图
Fig.3 Volcano diagram of differential metabolites with and without inactivation of Lactiplantibacillus plantarum
2.4 差异代谢物的代谢通路分析
通过KEGG数据库富集分析,共富集到6条代谢通路,结果如表1、图4所示。这6条通路分别是精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、抗坏血酸与醛酸代谢、氨酰-tRNA生物合成以及糖基磷脂酰肌醇-锚生物合成。图4中,图形越大表示差异代谢物的富集率越高;不同的颜色表示富集的显著性(即P值),绿色越深表示该通路越显著富集,右侧颜色梯度表示P值大小。差异极显著(P<0.01)的代谢通路是精氨酸和脯氨酸代谢,富集到这条代谢通路的差异代谢物分别是L-精氨酸、4-乙酰氨基丁酸酯。
表1 植物乳植杆菌中差异代谢通路基本信息
Table 1 Basic information of differential metabolic pathways in Lactiplantibacillus plantarum
代谢通路P值富集的差异代谢物精氨酸和脯氨酸代谢0.006L-精氨酸、4-乙酰氨基丁酸酯精氨酸生物合成0.045L-精氨酸烟酸和烟酰胺代谢0.048NAD抗坏血酸与醛酸代谢0.026葡糖二酸糖基磷脂酰肌醇-锚生物合成0.045尿苷二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺氨酰-tRNA生物合成0.15L-精氨酸
图4 植物乳植杆菌差异代谢物的KEGG富集气泡图
Fig.4 KEGG enrichment bubble diagram of differential metabolites of Lactiplantibacillus plantarum
3 结论与讨论
本研究基于FC>2,即试验组的相对含量比对照组高2倍以上,鉴定到的差异丰富的代谢物质有亮氨酸-组氨酸二肽、NAD和L-精氨酸3种代谢物质。有研究表明,宿主摄入亮氨酸-组氨酸二肽后对机体具有有益作用,例如,减少抑郁相关的情绪障碍、降血压、促进动物生产性能[15-17]。NAD是机体新陈代谢过程中不可或缺的氧化还原酶类的辅酶,参与生物体内细胞各种物质代谢、能量合成、延缓衰老及细胞DNA修复等若干种反应[18]。例如,细胞三羧酸循环,糖、脂肪、氨基酸等营养物质的代谢利用。此外,NAD+在炎症反应中展现出有益效果。NAD+药物治疗可以明显减少小鼠NOD样受体热蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-containing 3, NLRP3)炎性小体和炎症因子的分泌而发挥抗炎作用[19]。
差异代谢物富集分析发现,灭活处理对植物乳植杆菌差异代谢物参与的影响主要集中在精氨酸和脯氨酸代谢通路,L-精氨酸和4-乙酰氨基丁酸酯富集在该通路中。L-精氨酸是一种功能性氨基酸,除了作为蛋白质的构成基本单位外,在严重疾病中治疗具有有效性。本研究中结果显示,试验组的L-精氨酸相对含量比对照组高2.3倍,4-乙酰氨基丁酸酯相对含量比对照组高1.58倍,说明灭活处理后,对于植物乳植杆菌的这2种代谢物的相对含量上调。L-精氨酸在血液中释放一氧化氮,有助于血管肌肉壁扩张,从而扩大血管,这意味着它有助于为机体的肌肉和组织带来营养和氧气。有研究表明,在对于脑转移瘤患者放疗前给予口服精氨酸干预后,大部分的患者出现完全或部分缓解,而对照组仅有22%出现缓解。导致这一结果的因素是NO依赖的糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶抑制和亚硝基化DNA损伤时ADP核糖聚合酶的过度激活,最终损害了癌细胞对辐射诱导的DNA损伤的修复,同时保护了肿瘤浸润淋巴细胞[20]。在肉鸡日粮中补充L-精氨酸,可以促进肉鸡小肠的发育、增加免疫器官指数,从而促进蛋鸡早期的生长性能[21]。这些结果以及精氨酸的表观作用机制表明其在医疗及动物养殖领域均有较好应用前景。4-乙酰氨基丁酸酯作为与心血管死亡风险相关的新型代谢物,发现其在血浆中的含量与长寿呈正相关[22]。此外,对于哮喘患者的研究发现,4-乙酰氨基丁酸酯可作为哮喘保护性相关的代谢物,对于治疗哮喘具有潜在的意义[23]。
在对植物乳植杆菌灭活处理后发现假木贼碱、6-氨基-6-脱氧镰刀菌素、O-磷酸-L-丝氨酸等5种代谢物的相对含量下降。O-磷酸-L-丝氨酸是形成丝氨酸的直接也是唯一前体物质,有研究发现限制饮食中的丝氨酸可以显著减缓小鼠肿瘤的生长,其原因是在丝氨酸缺乏的条件下,原本正常的鞘脂生物合成途径会转而生产有毒性的脱氧鞘脂,从而毒杀癌细胞[24]。6-氨基-6-脱氧镰刀菌素可以在5’-甲硫腺苷/腺苷高半胱氨酸水解酶水解下,转化为腺嘌呤和去次黄嘌呤夫他洛辛,后者作为维生素K3合成的前体物质[25],幽门螺杆菌依赖维生素K3作为电子转运体,进行关键代谢物的生物合成途径[26],因此靶向维生素K3途径或可成为抗幽门螺杆菌新型疗法提供新的方向。假木贼碱是一种生物碱,具有抗胆碱酯酶、抗菌和杀虫等活性[27],可用于治疗疥癣等皮肤病,也可用于防治菜青虫、蚜虫等虫害。以上物质具有独特的重要作用,但是在如处理后相对含量却下降了,导致这一结果的因素可能是随着植物乳植杆菌在培养过程中pH值的降低和/或在加热条件下,使得这些物质降解,从而导致其相对含量降低。
本研究针对灭活植物乳植杆菌的代谢物建立了基于超高效液相色谱高分辨质谱技术的非靶向代谢组学方法,进行了初步鉴定比较。结果表明,植物乳植杆菌在灭活前后的差异代谢物共24种。KEGG富集分析表明,植物乳植杆菌在灭活后富集到的差异极显著(P<0.01)的代谢通路是精氨酸和脯氨酸代谢,L-精氨酸和4-乙酰氨基丁酸这2种差异代谢物富集到这该代谢通路中。这些物质对于促进机体健康、提高动物的生产性能、临床医疗的应用具有重要前景。众所周知,益生菌的效果存在特异性,其发挥作用很大程度上取决于益生菌的菌株、剂量、贮运条件及宿主的生理状态等因素。目前,灭活益生菌产品也展现出类似活菌的有益作用,并且具有安全性更好、更耐储运等优势。然而,关于灭活益生菌的效果仍需进行深入研究。本研究为灭活植物乳植杆菌的代谢物鉴定提供理论依据,也为开发灭活植物乳植杆菌功能性、益生产品提供理论参考。
[1] FANG Z F, LU W W, ZHAO J X, et al.Probiotics modulate the gut microbiota composition and immune responses in patients with atopic dermatitis:A pilot study[J].European Journal of Nutrition, 2020, 59(5):2119-2130.
[2] 张晨玥, 马微微, 卢慧敏, 等.植物乳杆菌CCFM 8661调节肠道菌群及缓解便秘研究[J].食品与发酵工业, 2023,49(18):58-65.ZHANG C Y, MA W W, LU H M, et al.Lactobacillus plantarum CCFM 8661 to regulate intestinal microbiota and relieve constipation[J].Food and Fermentation Industries, 2023, 49(18):58-65.
[3] MAO Y, ZHANG X J, XU Z H.Identification of antibacterial substances of Lactobacillus plantarum DY-6 for bacteriostatic action[J].Food Science &Nutrition, 2020, 8(6):2854-2863.
[4] SJÖGREN J, MAGNUSSON J, BROBERG A, et al.Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14[J].Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12):7554-7557.
[5] 高兆建, 黄亮浩, 丁飞鸿, 等.源自泡菜的植物乳杆菌产新型广谱抑菌细菌素的特性分析[J].食品科学, 2021, 42(10):171-177.GAO Z J, HUANG L H, DING F H, et al.Characterization of novel broad-spectrum bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum from pickles[J].Food Science, 2021, 42(10):171-177.
[6] ZHANG Q Q, ZHAO Q, LI T, et al.Lactobacillus plantarum-derived indole-3-lactic acid ameliorates colorectal tumorigenesis via epigenetic regulation of CD8+ T cell immunity[J].Cell Metabolism, 2023, 35(6):943-960.
[7] 饶苇, 陈奎霖, 方子莹, 等.植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌的抑菌机理[J].食品与发酵工业, 2024,50(8):138-145.RAO W, CHEN K L, FANG Z Y, et al.Antibacterial mechanism of Lactobacillus plantarum SCB2505 metabolites against Serratia liquefaciens[J].Food and Fermentation Industries, 2024,50(8):138-145.
[8] DEPOMMIER C, EVERARD A, DRUART C, et al.Supplementation with Akkermansia muciniphila in overweight and obese human volunteers:A proof-of-concept exploratory study[J].Nature Medicine, 2019, 25(7):1096-1103.
[9] OTTMAN N, REUNANEN J, MEIJERINK M, et al.Pili-like proteins of Akkermansia muciniphila modulate host immune responses and gut barrier function[J].PLoS One, 2017, 12(3):e0173004.
[10] 万瑾怡, 袁建敏.灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能和肠道健康的影响[J].中国畜牧杂志, 2023, 59(10):299-308.WAN J Y, YUAN J M.Effects of inactivated Lactobacillus plantarum on growth performance and intestinal health of broilers[J].Chinese Journal of Animal Science, 2023, 59(10):299-308.
[11] 易先国. 热灭活植物乳杆菌对肉鸡生长性能、肠道形态及免疫相关基因表达的影响[J].中国饲料, 2020(18):34-38.YI X G.Effects of thermally inactivated plant Lactobacillus on growth performance, intestinal morphology and immune-related gene expression in broilers[J].China Feed, 2020(18):34-38.
[12] YE D Y, LI X W, SHEN J Z, et al.Microbial metabolomics:From novel technologies to diversified applications[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2022, 148:116540.
[13] WANG J L, ZHANG T, SHEN X T, et al.Serum metabolomics for early diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma by UHPLC-QTOF/MS[J].Metabolomics, 2016, 12(7):116.
[14] ZHOU Z W, LUO M D, ZHANG H S, et al.Metabolite annotation from knowns to unknowns through knowledge-guided multi-layer metabolic networking[J].Nature Communications, 2022, 13(1):6656.
[15] ANO Y, KITA M, KITAOKA S, et al.Leucine-histidine dipeptide attenuates microglial activation and emotional disturbances induced by brain inflammation and repeated social defeat stress[J].Nutrients, 2019, 11(9):2161.
[16] CHAVES-L
PEZ C, SERIO A, PAPARELLA A, et al.Impact of microbial cultures on proteolysis and release of bioactive peptides in fermented milk[J].Food Microbiology, 2014, 42:117-121.
[17] 仲茜, 许丹丹, 王旋, 等.饲料中添加亮氨酸和谷氨酰胺对大菱鲆幼鱼生长和肠道健康的影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版), 2023, 53(4):8-17.ZHONG Q, XU D D, WANG X, et al.Effects of dietary leucine and glutamine on growth and intestinal health of juvenile turbot (Scophthalmus maximus L.)[J].Periodical of Ocean University of China, 2023, 53(4):8-17.
[18] 郑世雄, 吕婧, 郭沈涛, 等.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体防治衰老相关疾病作用机制研究进展[J].中国公共卫生, 2023, 39(6):793-799.ZHENG S X, LYU J, GUO S T, et al.Progress in research on mechanism of nicotinamide adenine dinucleotide and its precursors against aging-related diseases[J].Chinese Journal of Public Health, 2023, 39(6):793-799.
[19] 王欣. NAD+/NLRP3在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的自噬作用及机制探讨[D].石家庄:河北医科大学, 2021.WANG X.Autophagy and mechanism of NAD+/NLRP3 in experimental autoimmune encephalomyelitis mice[D].Shijiazhuang:Hebei Medical University, 2021.
[20] MARULLO R, CASTRO M, YOMTOUBIAN S, et al.The metabolic adaptation evoked by arginine enhances the effect of radiation in brain metastases[J].Science Advances, 2021, 7(45):eabg1964.
[21] YU J, YANG H M, WANG Z Y, et al.Effects of arginine on the growth performance, hormones, digestive organ development and intestinal morphology in the early growth stage of layer chickens[J].Italian Journal of Animal Science, 2018, 17(4):1077-1082.
[22] WANG F L, TESSIER A J, LIANG L M, et al.Plasma metabolomic profiles associated with mortality and longevity in a prospective analysis of 13,512 individuals[J].Nature Communications, 2023, 14(1):5744.
[23] ZHU Y Q, MENG X Y, YANG J H.Causal link between human blood metabolites and asthma:An investigation using Mendelian randomization[J].Archives of Asthma, Allergy and Immunology, 2023, 7(1):12-22.
[24] MUTHUSAMY T, CORDES T, HANDZLIK M K, et al.Serine restriction alters sphingolipid diversity to constrain tumour growth[J].Nature, 2020, 586(7831):790-795.
[25] WANG S Z, HAAPALAINEN A M, YAN F N, et al.A picomolar transition state analogue inhibitor of MTAN as a specific antibiotic for Helicobacter pylori[J].Biochemistry, 2012, 51(35):6892-6894.
[26] BANCO M T, MISHRA V, OSTERMANN A, et al.Neutron structures of the Helicobacter pylori 5’-methylthioadenosine nucleosidase highlight proton sharing and protonation states[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(48):13756-13761.
[27] 杜华, 周立刚, 李春, 等.藜科植物化学成分与生物活性的研究进展[J].天然产物研究与开发, 2007,19(5):884-889.DU H, ZHOU L G, LI C, et al.Recent studies on the chemistry and bioactivity of Chenopodiaceous plants[J].Natural Product Research and Development, 2007,19(5):884-889.