熊果苷,又名熊果素,化学名为4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷,是一种天然糖苷类化合物,广泛存在于熊果、越橘、乌饭树、马郁兰、沙梨树等植物中[1-2]。熊果苷作为20世纪90年代以来添加于化妆品中的美白剂,以其绿色天然、无毒高效等优势已成为美白祛斑类化妆品的首选主要原料。熊果苷还具有抗菌、镇咳、利尿、治疗脑部疾病等多种药理作用[3-5]。然而,熊果苷分子的多羟基结构,使其水溶性强、脂溶性差,难以透过细胞膜,生物利用度较低,极大地限制了其应用范围。研究表明,通过对熊果苷进行酰化修饰得到的酯衍生物,其脂溶性和生物活性强于母体化合物熊果苷[6-11]。例如以儿茶酚作为酪氨酸酶的底物时,熊果苷十一碳烯酸酯对酪氨酸酶的抑制活性比熊果苷高100倍,且在B16黑色素细胞培养过程中添加0.1 mmol/L的熊果苷十一碳烯酸酯,黑色素的产量下降了70%,而相同浓度的熊果苷对黑色素的生成没有任何抑制作用[6-7]。MASYITA等[8]发现熊果苷十一碳烯酸酯对酪氨酸酶的抑制率不但高于熊果苷且对果蝇S2细胞的毒性较低。熊果苷月桂酸酯和熊果苷阿魏酸酯均具有比亲代化合物更好的抗氧化活性和自由基清除活性[9-10]。因此,熊果苷酯衍生物不但具有比母体化合物更高的药理活性且对正常细胞的毒副作用更低,应用潜力较大[11]。
酶法合成熊果苷酯衍生物具有工艺简单、区域选择性高和环境友好等优点[12-14]。然而纯酶的制备过程涉及细胞培养、酶提取及分离纯化等多个步骤,复杂、耗时、成本高,且游离酶稳定性较差。微生物全细胞催化剂,除了具有酶催化的一系列优点外,其制备过程简单,不需要对酶进行分离纯化,成本较低,且完整的细胞结构还可以给酶提供相对自然的环境[15]。课题组前期筛选到了催化活性好、对有机溶剂耐受性强的米曲霉全细胞催化剂,可在非水介质中高效高区域选择性地合成豆腐果苷苯甲酸酯[16]。全细胞催化剂的催化活性与微生物菌株中胞内酶与胞壁连接酶的含量有着密切关系。培养基组成虽然可以有效促进微生物的生长,但是脂肪酶的生成和微生物的生长却不一定是同步的过程。因此,筛选出性能优良的产脂肪酶菌株后,对微生物菌株的培养过程进行探究,建立具有高生物量和高催化活性的微生物培养体系具有重要意义。
多数脂肪酶为诱导酶,有些碳源如油脂、吐温等,既可为细胞生长提供营养成分,也可作为脂肪酶生产的诱导剂[17]。WU等[18]用1 g/L大豆油作为碳源对铜绿假单胞菌进行培养36 h后,全细胞催化剂生物量较原始培养基提高了2倍,且可以高效催化豆腐果苷酯衍生物的合成。此外,氮源和无机盐也是微生物细胞生长和产酶的关键成分。研究发现酵母浸膏、胰蛋白胨等有机氮源更有利于脂肪酶的生产[19]。刘思远等[20]对产低温脂肪酶X16菌株发酵条件优化时,发现当分别以胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉作氮源时,菌株的酶活力很低,而用蛋白胨作氮源时酶活力最高。练妍[21]在制备荧光假单胞菌全细胞催化剂时发现,当大豆油和酵母膏的加入量分别在0.5%和0.13%以内时,两者有显著的增效作用,且生物质量随着二者加入量的增加而升高。迄今,利用全细胞催化剂合成熊果苷酯衍生物的研究较少,因此,本研究以课题组前期筛选到的能催化熊果苷酯衍生物合成的米曲霉为对象,探究培养基组分对细胞生物量及其催化熊果苷酯衍生物合成的影响,以期建立具有高生物量、高催化活性的微生物全细胞培养体系,为熊果苷及其他糖苷酯衍生物的工业化制备提供新思路和新方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种
米曲霉Aspergillus oryzae,购于广东省微生物菌种保藏中心。
1.1.2 主要试剂
熊果苷、正辛酸乙烯酯(vinyl n-octanoate),TCI(上海)化成工业发展有限公司;大豆油、山茶油、花生油、亚麻籽油、葡萄籽油、芝麻香油,当地超市;麦芽糊精,源叶生物公司;吐温,MACKLIN公司;葡萄糖、蔗糖、氯化钠、无水氯化钙、硫酸铵、二水合磷酸二氢钠、七水合硫酸亚铁、六水合三氯化铁、磷酸二氢钾、七水硫酸镁等,国药集团化学试剂有限公司;丙酮,莱阳市康德化工有限公司;酵母浸膏,郑州亚世生物技术有限公司;牛肉膏、蛋白胨,江苏宜兴市永信生物有限公司;琼脂(粉),天津市科密欧化学试剂有限公司;酸水解酪蛋白,合肥巴斯夫生物科技有限公司;营养肉汤,广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JA3003电子分析天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;BM1000生物显微镜,济南千司生物技术有限公司;台式恒温振荡器,苏州培英实验设备有限公司;CXG-1F低温层析柜,上海青浦沪西仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;MJ78灭菌锅,施都凯仪器设备(上海)有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,江苏通净净化设备有限公司;XH-C旋涡混合器,常州越新仪器制造有限公司;岛津LC-2030C高效液相色谱仪(色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18,Analytical 4.6 mm×250 mm 5-Micron),株式会社岛津制作所。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种培养方法
真菌种子液培养基:PDA培养基。取200 g去皮马铃薯切碎,沸水煮20 min左右至土豆泥状,期间不断搅拌防止糊底。完成后将纱布叠至8层,用其过滤土豆泥。加入15～20 g琼脂粉(条),溶解后再加入20 g葡萄糖,待冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL,即得到PDA培养基,115 ℃灭菌15 min待用。
菌种培养与接种:将米曲霉从试管斜面上接种到PDA平板上划线,30 ℃下培养72 h。孢子成熟后,在长满菌丝的PDA培养基上移入无菌水,用接种环将每个平板上的菌丝刮下放入盛有100 mL无菌水的锥形瓶中,摇匀得到孢子悬液。将孢子悬液稀释10倍后,利用血球计数板于显微镜下观察计数,按照7.2×105个/mL的接种量进行发酵培养。
真菌初始发酵培养基(g/L):1.0大豆油,2.0胰蛋白胨,5.0 (NH4)2SO4,0.2 MgSO4·7H2O,在30 ℃、180 r/min条件下培养36 h。
1.3.2 全细胞催化剂的制备
米曲霉摇瓶培养结束后,过滤去除发酵液,用离子水洗涤湿菌体后,冷冻干燥后即可获得全细胞催化剂,4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.3 培养基成分对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
首先分别考察碳源(大豆油、山茶油、花生油、亚麻籽油、芝麻香油、葡萄籽油、蔗糖、麦芽糊精、葡萄糖和吐温60)和氮源(胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、营养肉汤、酵母浸膏、酸水解酪蛋白)以及不同浓度的大豆油和胰蛋白胨对细胞生物量及其催化熊果苷酰化反应的影响;进而考察不同种类的无机盐(MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、NaH2PO4·2H2O、FeSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、CaCl2)对细胞生物量及其催化活性的影响,并在含6.0 g/L大豆油、7.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L (NH4)2SO4、0.2 g/L CaCl2的培养基中考察培养时间对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷辛酰化反应的影响。
1.3.4 米曲霉全细胞催化熊果苷酰化反应
米曲霉全细胞催化熊果苷酰化反应:将2 mL脱水丙酮、20 mmol/L熊果苷和200 mmol/L正辛酸乙烯酯加入10 mL带盖反应瓶中,底物溶解后再加入40 mg/mL的米曲霉全细胞催化剂,40 ℃、200 r/min进行反应,定时取样并进行HPLC分析。
1.3.5 高效液相色谱分析条件
流动相:80%甲醇,20%水。底物转化率、区域选择性的计算参照先前建立的方法进行[14]。
2 结果与分析
2.1 碳源种类对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
碳源不但是微生物生长过程中重要的营养物质,而且合适的碳源能够诱导脂肪酶的产生。本实验选取大豆油、花生油、山茶油、亚麻籽油、芝麻香油、葡萄籽油、蔗糖、麦芽糊精、吐温60、葡萄糖共10种营养物质作为碳源,研究碳源种类对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷辛酰化反应的影响。由图1可知,不同种类的碳源对全细胞生物量及其催化熊果苷辛酰化反应的影响较为显著。在所检测的几种碳源中,以大豆油作为碳源时,全细胞生物量和催化效率最高,分别为1.43 g/L和99.25%。当以花生油、葡萄籽油、山茶油和芝麻香油作为碳源时,细胞生物量分别为1.12、0.99、0.95和0.73 g/L,底物转化率均高于90%。这可能是因为油脂不但可以为细胞生长代谢提供碳源,而且其分解代谢产生的脂肪酸更有利于微生物诱导脂肪酶的生成。当以糖类物质做为碳源时,细胞生物量和细胞催化活性处于中等偏上水平,其原因可能是酶的合成受到阻遏或酶活力受到抑制。吐温60作为一种表面活性剂,增加了米曲霉全细胞细胞膜的通透性,导致了细胞内胞内酶流出,从而降低了全细胞催化熊果苷酰化反应的活性。因此综合10种碳源对细胞生物量及其催化熊果苷辛酰化反应的效率,以大豆油为碳源生物量最高和催化效率最好,故选其作为米曲霉全细胞后续培养的碳源。
图1 碳源种类对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.1 Effects of carbon sources on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
2.2 氮源种类对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
氮源是构成生物体中蛋白质、核酸及其他氮素化合物的原料,不但能有效促进细胞生长,同时也能促进全细胞内脂肪酶的生产。唐诗潮等[22]研究发现,氮源对于黑曲霉细胞中具有水解活性诱导酶系的产生具有一定的促进作用,且作用结果因氮源种类不同而异,有机氮源获得的细胞催化效果更好。本实验探究了7种有机氮源对米曲霉全细胞的生物量及催化熊果苷辛酰化反应的影响(图2)。研究发现,当牛肉膏与酸水解酪蛋白作为氮源时,微生物全细胞生物量较小,分别为0.13 g/L及0.11 g/L,这可能是由于酸水解酪蛋白为盐酸消化酪蛋白的水解物,其中维生素大部分被强盐酸水解破坏,营养低,无法给菌株提供良好的营养条件,牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、有机酸类等多种成分,且在加工过程中往往需要添加其他成分,其中含有的一些物质可能不利于本实验中米曲霉细胞的生长。相反,其余几种氮源物质均能满足米曲霉细胞生长所需,生物量较高,其中当以胰蛋白胨作为氮源时,米曲霉全细胞生物量达到1.43 g/L。从催化熊果苷辛酰化反应效果来看,氮源种类对细胞生物量与催化活性的影响无相关性,不同氮源培养基中培养出的米曲霉细胞催化熊果苷的转化率均大于80%,其中当胰蛋白胨、酵母浸膏、蛋白胨为氮源时,熊果苷转化率均达到99%,即使牛肉膏与酸水解酪蛋白抑制了米曲霉细胞生长,生物量较低,但这2种氮源培养全细胞催化熊果苷辛酰化的转化率分别为91%和82%。综合考虑微生物全细胞生物量及催化效果,确定胰蛋白胨作为作为米曲霉全细胞后续培养的氮源。
图2 氮源种类对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.2 Effects of nitrogen sources on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
2.3 大豆油质量浓度对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
大豆油在本培养过程中,既要提供米曲霉生长所需碳源,同时能诱导脂肪酶的产生,其浓度对全细胞的生物量与催化效果有显著影响。本实验探讨了不同质量浓度大豆油(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、9.0、10.0、12.0 g/L)对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响。如图3所示,在所选浓度范围内,米曲霉细胞生物量随着大豆油质量浓度的增加呈先增大后降低的趋势,当大豆油质量浓度<6.0 g/L时,全细胞生物量随大豆油质量浓度增加而增大,进一步增加其浓度,全细胞量有所下降,且当大豆油质量浓度为6.0 g/L时,细胞生物量最大为3.78 g/L。这可能是因为过低含量的大豆油无法为细胞生长代谢提供充足的碳源,而过高含量的大豆油分解得到的油酸、亚油酸等物质会令发酵培养基呈酸性,抑制微生物细胞的生长。从催化熊果苷酰化效果来看,碳源浓度对全细胞催化熊果苷反应活性影响较小,熊果苷的转化率均大于95%。综合考虑微生物全细胞生物量与催化效果,确定当大豆油最佳质量浓度为6.0 g/L。
图3 大豆油浓度对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.3 Effects of soybean oil concentration on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
2.4 胰蛋白胨浓度对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
以胰蛋白胨为氮源,分别考察了0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、10.0 g/L的胰蛋白胨对米曲霉生物量及其催化熊果苷酰化反应的影响(图4)。如图4所示,当胰蛋白胨质量浓度为0.5～7.0 g/L时,米曲霉细胞生物量随着胰蛋白胨浓度的增加逐渐增大,进一步增加其质量浓度,全细胞量有所下降,且当胰蛋白胨质量浓度为6.0 g/L时,细胞生物量最大为4.12 g/L。其原因可能是a)当培养基中胰蛋白胨浓度高于米曲霉细胞液内浓度时,细胞为了减小浓度差而过度吸水导致死亡;b)胰蛋白胨分解代谢产生的酸性物质会导致发酵培养基的pH为酸性,从而使得细胞生物量下降。综合考虑,确定当胰蛋白胨的质量浓度为7.0 g/L时为最佳氮源浓度。
图4 胰蛋白胨浓度对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.4 Effects of tryptone concentration on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
2.5 无机盐种类对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
无机盐对微生物的生长代谢起重要的调节作用,有些金属离子不但利于菌株的生长,能够增加其全细胞生物量,而且还可以与酶分子的活性中心有效结合,达到激活酶的效果。本实验考察了8种无机盐(MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、NaH2PO4·2H2O、FeSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、CaCl2)对米曲霉生物量及其催化熊果苷酰化反应的影响。由图5可知,8种无机盐对米曲霉细胞生长及其催化熊果苷辛酰化反应均有促进作用,其中当培养基中添加CaCl2时,全细胞生物量最高,达到5.53 g/L,底物转化率达到99%。究其原因可能是无机盐中阴阳离子进入细胞,维持米曲霉细胞内的离子平衡,促进了米曲霉细胞的生长;无机盐还能调节细胞内外的渗透压,维持细胞内外渗透压的平衡;同时无机盐离子能够作为脂肪酶的激活剂或者辅酶,参与脂肪酶的催化,从而提高了脂肪酶的活力。综合考虑生物量与催化效果,选择CaCl2作为最佳金属盐。
图5 无机盐种类对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.5 Effects of inorganic saltson on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
2.6 培养时间对米曲霉全细胞生物量及催化熊果苷酰化反应的影响
酶的生物合成与细胞生长并不一定是同步进行,因此本实验考察了全细胞生物量及催化效果与培养时间的关系。由图6可知,全细胞生物量在初始阶段生物量较少,当培养时间延长时,生物量也在逐渐增大,在60 h生物量达到最大(6.52 g/L)。当培养时间超过60 h时,生物量显著下降,这可能是因为在培养后期,培养液中底物不断被消耗,且米曲霉菌株进入衰退期菌体发生自溶引起来的生物量下降。此外,全细胞的催化活力随着培养时间的延长呈先上升后下降的趋势,当培养至36 h,底物转化率达到99%,当培养时间超过60 h后,转化率有所下降。由此可见,催化熊果苷酰化合成的酶,伴随着细胞的生长而开始;在细胞进入旺盛生长期时,酶大量生成;当细胞生长进入平衡期后,酶的合成逐步停止。综上所述,综合生物量及催化效率,最终确定最优的培养时间为48 h。
图6 培养时间对米曲霉全细胞生物量和催化熊果苷酰化反应的影响
Fig.6 Effects of incubation time on the whole cell biomass and arbutin acylation reaction catalyzed by Aspergillus oryzae
3 结论
本研究探讨了培养基组成对米曲霉全细胞生物量及其催化熊果苷辛酰化反应的影响。结果表明,最佳培养基为:6.0 g/L大豆油,7.0 g/L胰蛋白胨,5.0 g/L (NH4)2SO4,0.2 g/L CaCl2,且在30 ℃、180 r/min条件下培养48 h所得到的米曲霉全细胞生物量为6.28 g/L,为原始培养基培养所得生物量的4.36倍,而前人在优化的最佳培养条件下获得的具有酰化活性的米曲霉全细胞催化剂的最高生物量只有2.899 g/L[21]。此外催化熊果苷辛酰化反应的底物转化率和区域选择性分别达99.55%和99%,相较于之前LI等[23]使用假丝酵母全细胞催化熊果苷辛酰化的92.4%的转化率和94.7%的区域选择性均有所提高[23]。本研究建立了一种新型可催化熊果苷酯衍生物生物合成的微生物全细胞培养体系,该方法的细胞量有优势且具有成本较低、高效和高选择性的优点,为工业化制备熊果苷酯类衍生物提供了理论依据和技术指导,但是本研究中全细胞催化剂的制备是在摇瓶中进行的,为了满足工业化应用的需求,尚需在培养规模方面做进一步的探究。
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