随着消费者饮食结构的改变,植物蛋白对动物蛋白的替代效应逐步加强,既可以缓解蛋白质资源短缺现象,又有效降低全因死亡风险[1]。目前,植物蛋白饮食多以大豆制品为主,大豆富含优质蛋白质、氨基酸脂肪、多不饱和脂肪酸等重要营养素,以及大豆异黄酮等生理活性成分,具有预防癌症、心血管疾病等健康功效[2-3],是营养密集型食品的重要加工原料之一。然而,大豆也存在某些必需氨基酸(如赖氨酸、蛋氨酸)缺乏、糖苷型异黄酮肠道吸收较慢等问题,在营养上不能满足人体的全部需求,限制了其在植物基食品行业的应用[4]。因此,领域内专家继续探究优质植物蛋白质资源,其中微生物发挥了重要作用,如酵母菌、枯草芽孢杆菌等[5]。通过微生物的发酵,不仅可以产生优质微生物蛋白,又可以代谢大豆中以蛋白质、脂质、大豆异黄酮为代表的主要组分,平衡其氨基酸组成,有效提高其消化率,增强其营养特性,可用于植物蛋白资源的有效补充[6-7]。
在我国消费市场中,发酵豆制品的优势菌种以枯草芽孢杆菌为主,如豆豉、豆酱等[8-9]。枯草芽孢杆菌是一种公认安全的益生菌,蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖苷酶等生物酶系丰富,能有效地分解蛋白质等多种大分子物质,同时产生其特有代谢产物纳豆激酶,发挥高效溶栓的健康益处[10-11]。然而,我国传统发酵豆制品一般属于高盐食品,长期食用会增加高血压、心脏病及脑出血等健康风险[12],与当下营养健康消费理念相悖。因此,降低盐分,提高营养密度,甚至由调味品行业转型升级至大健康领域,是我国发酵豆制品未来的研究热点。此外,豆乳是重要的植物蛋白饮品,具有传质均匀、规模易扩大等优势,更适合作为枯草芽孢杆菌发酵食品的开发基质[13]。豆乳不含胆固醇和乳糖,被认为是牛奶的最佳替代品,在乳糖不耐症患者、高胆固醇患者、素食主义人群饮食结构中发挥了重要作用[14]。但目前利用枯草芽孢杆菌发酵豆乳的研究较少,应进一步评估利用枯草芽孢杆菌提高豆乳营养价值的潜力。
基于实验室前期枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSNK-5发酵豆乳的优良工艺[15],本研究旨在动态监测豆乳发酵过程中,蛋白质、脂肪、大豆异黄酮等大豆主要营养成分和功能成分的降解及转化情况,深入分析豆乳营养和功能特性的动态变化,以期为开发植物蛋白发酵食品,靶向富集目标组分,发展大豆加工产业提供重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
B.subtilis BSNK-5,实验室保藏;小粒黄豆东农690,市售;大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆素、黄豆黄素、染料木素(均为HPLC级),上海源叶生物科技有限公司;丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸等17种氨基酸标品(均为色谱级),美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇(均为色谱级),德国Merck公司;酵母提取物、蛋白胨(均为分析纯),英国Oxoid公司;氢氧化钠等其他试剂(均为分析纯),上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ZHJH-011128超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;LRH-250恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;TS-300DC恒温摇床,上海天呈实验仪器制造有限公司;DJ06E-D豆浆机,山东九阳股份有限公司;JY-LGJ-10C真空冷冻干燥机,北京金洋万达科技有限公司;YQ205-09全自动凯氏定氮仪,意大利VELP公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本HITACHI公司;E-816全自动索氏提取仪,瑞士AG公司;G7318AA气相色谱仪,美国Agilent公司;1220 Infinity Ⅱ LC高效液相色谱仪,美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 种子液制备
以实验室筛选的高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌BSNK-5为出发菌株[16],将BSNK-5液体冻存管从-80 ℃冰箱中取出,在LB固体平板上划线,37 ℃培养10 h;取单菌落,转至20 mL LB液体培养基中活化,200 r/min,37 ℃培养12 h;再取1 mL菌液,转接至100 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 r/min培养12 h,作为种子液备用。
1.3.2 发酵豆乳制备
发酵豆乳制备工艺流程如下:
大豆清洗→室温浸泡10 h(豆水比1∶4)→打浆煮制(豆水比1∶8)→豆乳(装液量20%)→接菌(体积分数1.0%)→发酵(同种子液培养条件)[15]
不同时间发酵豆乳分别在发酵24、48、84 h时取样,以未发酵豆乳为对照,每个时间点3个平行。部分鲜样用于测定pH值、生物量、氨基酸态氮;其余样品经冷冻干燥后,用于后续分析。
1.3.3 菌株生长指标测定
采用pH计测定液体发酵豆乳的终点pH值。菌落总数:将发酵豆乳稀释不同倍数,通过涂布平板法,测定液体发酵豆乳中BSNK-5的活菌数。
1.3.4 蛋白质代谢基本指标检测
参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法自动凯氏定氮仪法、GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》第一法酸度计法分别测定发酵豆乳的蛋白质、氨基酸态氮。参考刘战霞等[17]分析方法并加以调整。取冻干样品0.3 g(精确至0.000 1 g),加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液,在105 ℃水解22 h,并0.22 μm滤膜过滤,吸取1 mL上清液定容至10 mL,上样至全自动氨基酸自动分析仪测定。
1.3.5 脂肪代谢基本指标检测
参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第一法索氏抽提法、GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》第二法乙酰氯-甲醇法测定发酵豆乳的脂肪、脂肪酸。
1.3.6 大豆异黄酮指标检测
参考GB/T 23788—2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》进行检测。
1.3.7 统计学分析
实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示,作图采用GraphPad Prism 7.0软件。随后进行统计学分析,P≤0.05、0.01和0.001时具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 发酵豆乳中B.subtilis BSNK-5的变化规律
通过pH值与生物量的变化,监测不同发酵时间点的豆乳中B.subtilis BSNK-5的生长状态,如图1所示。未发酵豆乳pH值在7.0左右,表现为中性,B.subtilis BSNK-5的发酵导致豆乳直接表现为碱性,并且随着发酵进程的推进,pH值呈现递增趋势,B.subtilis BSNK-5菌落总数也明显增加,发酵后期增长更为显著,发酵至84 h时,B.subtilis BSNK-5菌落总数达到1.08×108 CFU/mL。由此可见,B.subtilis BSNK-5在碱性环境中更易于生长繁殖。
图1 不同时间点发酵豆乳中pH值与菌落总数的变化
Fig.1 The changes of pH value and bacteria count in fermented soymilk at different time
2.2 发酵豆乳中蛋白质的变化规律
2.2.1 蛋白质的代谢分析
发酵豆乳中多肽、氨基酸主要是B.subtilis BSNK-5丰富的蛋白酶系降解大豆蛋白产生的。如图2所示,未发酵豆乳蛋白质含量为42.12 g/100 g,发酵至84 h时,其含量逐渐下降至32.22 g/100 g;氨基酸态氮反映了多肽和氨基酸的变化,其含量显著增加了12倍左右。因此,在B.subtilis BSNK-5的发酵下,豆乳蛋白质逐步降解为多肽和氨基酸等小分子含氮化合物,并进一步代谢形成了含氮的挥发性成分,导致豆乳体系中总氮水平下降。
a-蛋白质含量;b-氨基酸态氮含量
图2 不同时间点发酵豆乳中蛋白质的代谢变化
Fig.2 The metabolic changes of protein in fermented soymilk at different time
注:*P<0.05,**P<0.01,*** P<0.001(下同)。
2.2.2 氨基酸的组成分析
氨基酸、必需氨基酸(essential amino acid,EAA)的组成比例以及限制性氨基酸的最低含量等指标发酵豆乳的营养品质与相关。不同时间点发酵豆乳中水解氨基酸的组成情况及整体变化趋势如表1所示,随着发酵时间的推进,氨基酸总量(total amino acid,TAA)由43.38 g/100 g下降至25.77 g/100 g,解释了蛋白质整体含量的下降的现象。EAA含量先上升后下降,但EAA占比逐渐增加(图3-a),由38.54%增加至51.89%。整个发酵过程中,大多数氨基酸含量有所下降,表明B.subtilis BSNK-5的发酵广泛水解氨基酸为醇、酸等对风味成分,但Lys和Met含量明显增加,弥补了豆乳自身氨基酸的不足。
表1 不同时间点发酵豆乳的氨基酸营养学评价
Table 1 Nutritional evaluation of amino acids in fermented soymilk at different time
必需氨基酸0 h24 h48 h84 hAASRCAAAASRCAAAASRCAAAASRCAAWHO/FAO模式Thr46.12±1.120.97±0.00344.62±3.930.92±0.0719.72±0.460.46±0.0115.07±1.780.42±0.0540Val39.77±1.530.83±0.0242.35±0.580.87±0.0137.27±0.280.86±0.0222.94±3.290.64±0.0850Phe+Tyr67.52±1.401.41±0.0173.72±0.891.52±0.0275.99±0.901.76±0.0380.87±1.862.27±0.0235Met+Cys24.60±0.470.52±0.0120.38±1.010.42±0.0224.25±2.530.56±0.0529.07±0.540.81±0.00740Ile47.59±1.051.00±0.00244.95±0.680.93±0.0138.76±2.700.90±0.0512.51±0.330.35±0.00270Leu51.72±1.131.08±0.00251.57±0.521.06±0.0143.52±0.751.01±0.0321.97±0.510.62±0.0160Lys56.84±1.171.19±0.00962.44±0.551.29±0.0162.73±1.521.45±0.0567.46±1.821.89±0.00255
注:RCAA最小的氨基酸,被认定为产品中的第一限制性氨基酸。
a-氨基酸含量;b-必需氨基酸含量;c-非必需氨基酸含量
图3 不同时间点发酵豆乳中氨基酸的组成
Fig.3 The composition of amino acids in fermented soymilk at different time
氨基酸评分(amino acid score,AAS)越接近100,该食物蛋白营养价值越高,并以氨基酸评分指数(score of ratio coefficient of amino acids,RCAA)进一步评价氨基酸的营养价值[18-19]。由表2可知,随着发酵时间的延长,RCAA的值不断变化,未发酵豆乳和24 h发酵豆乳中,含硫氨基酸Met+Cys的AAS和RCAA最小,为第一限制性氨基酸;在48 h发酵豆乳中,Thr的AAS(19.85)和RCAA(0.46)均最低,为第一限制性氨基酸,此时Met+Cys为第二限制性氨基酸;在84 h发酵豆乳中,第一限制性氨基酸变为Ile,其AAS最低(12.50),而Thr(15.98)为第二限制性氨基酸。总体而言,整个发酵过程中,大多数氨基酸含量降低,在B.subtilis BSNK-5发酵豆乳中,氨基酸代谢较为明显。虽然氨基酸作为次级代谢产物,但BSNK-5继续以氨基酸为底物进一步代谢。
表2 不同时间点发酵豆乳中脂肪酸的组成 单位:g/100 g
Table 2 The composition of fatty acids in fermented soymilk at different time
脂肪酸简称0 h24 h48 h84 h棕榈酸C16:0 2.13±0.03b2.70±0.24a2.07±0.04b1.93±0.07c硬脂酸C18:0 0.99±0.04b1.25±0.11a1.01±0.01b1.03±0.03b油酸*C18:1 N9C0.41±0.07b1.29±0.04a0.33±0.03b0.29±0.01c亚油酸*C18:2 N6C 3.90±0.06b6.18±0.55a3.57±0.05c2.58±0.09d亚麻酸*C18:3 N3 0.86±0.23ab1.12±0.10a0.83±0.03b0.64±0.02c脂肪酸总量TFA8.30±0.48b12.54±1.03a7.81±0.14b6.48±0.23c饱和脂肪酸总量TSFA3.12±0.04b3.95±0.35a3.08±0.05bc2.96±0.10c不饱和脂肪酸总量TUFA5.17±0.52b8.59±0.68a4.73±0.08b3.52±0.13c
注:*为不饱和脂肪酸;同行小写字母不同表示具有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.3 发酵豆乳中脂肪的变化规律
2.3.1 脂肪的代谢分析
大豆脂肪含量约为15%～20%(质量分数),在豆类中居首位。在B.subtilis BSNK-5发酵作用下,脂肪会降解为不同碳链长度的脂肪酸。由图4可知,经过B.subtilis BSNK-5发酵后,脂肪含量并没有下降,反而处于上升状态,由最初的10.20 g/100 g增加至16.35 g/100 g,推测部分为微生物生长过程中产生;脂肪酸在发酵至24 h时,含量显著增加,约为12.54 g/100 g,但发酵后期又逐渐下降。因此,脂肪和脂肪酸在B.subtilis BSNK-5发酵豆乳中的变化不仅与豆乳本身的基质有关,也与微生物的生长有关,如微生物自身脂肪的影响以及其代谢产生的脂肪酶所引起的酶促反应。
a-脂肪;b-脂肪酸
图4 不同时间点发酵豆乳中脂肪的代谢变化
Fig.4 The metabolic changes of fat in fermented soymilk at different time
2.3.2 脂肪酸的组成分析
脂肪酸(fatty acid,FA)属于长链烃的羧酸,分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸,大豆中脂肪酸以棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸最为常见[20]。由表2可知,发酵豆乳中5种脂肪酸含量均在24 h发酵豆乳中显著增加,随后又逐渐下降。此外,在上述5种脂肪酸中,不饱和脂肪酸总量始终高于饱和脂肪酸总量,但是发酵后期二者逐渐接近;而在24 h发酵豆乳中,不饱和脂肪酸总量占比达到68%,显著高于饱和脂肪酸总量。又知亚麻酸和亚油酸有较高的营养价值,整个发酵过程中,发酵豆乳始终以亚油酸为主。
2.4 发酵豆乳中大豆异黄酮的变化规律
大豆异黄酮是大豆中天然活性成分,以结合型糖苷和游离型苷元两种形式存在,后者更利于人体消化吸收[21]。本研究定量检测了6种主要大豆异黄酮,即大豆苷、大豆素、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素。由图5可知,整个发酵过程中,结合型糖苷的含量一直处于下降的状态;而游离型苷元的含量整体呈增加的趋势,在48 h发酵豆乳中达到最大值,其含量由最初的0.009 g/100 g增加至0.163 g/100 g。
图5 不同时间点发酵豆乳中大豆异黄酮的变化
Fig.5 The changes of soybean isoflavones in fermented soymilk at different time
由表3可知,未发酵豆乳中,大豆异黄酮以结合型糖苷为主,占比为97%。在发酵过程中,大豆苷和染料木苷含量一直递减,而黄豆黄苷在24 h发酵豆乳中达到峰值,占比52%;总苷元、黄豆黄素和染料木素含量均在48 h发酵豆乳中达到峰值,其中大豆素含量一直增加,且在总苷元中占比最高;尽管84 h发酵豆乳中总苷元含量低于48 h发酵豆乳中,但是其在总异黄酮占比中最高,约为71%。因此,B.subtilis BSNK-5发酵豆乳中,大豆异黄酮的形式逐渐从结合型糖苷转为游离型苷元,提高了豆乳的生物利用率。
表3 不同时间点发酵豆乳中大豆异黄酮的组成 单位:g/100 g
Table 3 The composition of soybean isoflavones in fermented soymilk at different time
异黄酮存在形式0 h24 h48 h84 h大豆苷糖苷型0.098±0.001a0.022±0.002b0.015±0.001c0.009±0.003d大豆素*苷元型0.033±0.01c0.085±0.004b0.096±0.002a黄豆黄苷糖苷型0.040±0.004b0.125±0.002a0.038±0.001b0.035±0.010b黄豆黄素*苷元型0.009±0.001b0.010±0.003b0.017±0.001a0.012±0.001b染料木苷糖苷型0.126±0.001a0.025±0.002b0.017±0.001c0.013±0.001d染料木素*苷元型0.025±0.001c0.062±0.001a0.033±0.002b总糖苷0.264±0.002a0.191±0.006b0.070±0.002c0.057±0.010d总苷元0.009±0.001d0.069±0.008c0.163±0.002a0.142±0.001b总异黄酮0.273±0.002a0.240±0.01b0.233±0.002b0.199±0.010c
3 讨论
植物基发酵食品因其高营养价值而备受欢迎,其中大豆富含高营养和功能价值的优质蛋白、脂肪、大豆异黄酮,一直作为低成本发酵基质,制备优质植物蛋白制品[22]。本研究旨在动态监测豆乳在B.subtilis BSNK-5发酵过程中pH变化以及微生物的生长情况,同时分析了以蛋白质、脂肪以及大豆异黄酮的量效变化。枯草芽孢杆菌具有调节机体免疫、维护肠道菌群平衡、促进生长发育等显著的益生作用[23]。在豆乳发酵过程中,菌落总数呈指数级增长,pH环境由中性转为碱性,侧面解释了碱性丝氨酸蛋白酶NK的产生,因此,发酵豆乳中富集了B.subtilis BSNK-5的特有功能成分。并且纳豆枯草芽孢杆菌生物酶系丰富,是正向改善大豆主要营养成分和功能成分的有益微生物[24]。
豆乳发酵过程中,蛋白质含量明显下降,氨基酸态氮含量显著上升,表明B.subtilis BSNK-5产生的蛋白酶有效降解大豆蛋白为多肽和氨基酸,17种氨基酸中有10种氨基酸单一下降,使得水解氨基酸整体水平下降,表明B.subtilis BSNK-5过度的蛋白酶水解作用促使氨基酸的进一步降解,产生了含氮的挥发性成分,如2,5-二甲基吡嗪、游离氨等,促成了豆乳中总氮含量的整体下降[25]。但是,发酵过程中,EAA占比增加,且蛋氨酸和赖氨酸含量也明显上升。并且,在必需氨基酸的营养学评价中,AAS和RCAA整体上也是降低的,但是第一限制性氨基酸呈现动态变化,由最初的Met+Cys转为Thr和Ile,B.subtilis BSNK-5的发酵正向调节了豆乳氨基酸的组成,弥补了大豆缺乏蛋氨酸的不足,整体提高了豆乳的营养价值。豆乳发酵过程中,粗脂肪有所提高,这可能是由于显著增长的B.subtilis BSNK-5自身脂肪积累,代谢过程中醇和酸等风味物质的酯化反应形成酯类等衍生物,以及脂质键的修饰,共同引起了发酵豆乳中脂肪的变化,而且B.subtilis BSNK-5产生的脂肪可作为针对病原体的抗菌剂[26];B.subtilis BSNK-5分泌的脂肪酶促进了脂肪酸的合成,但脂肪酸作为菌体膜脂质和调节膜流动性的必要成分,会继续被B.subtilis BSNK-5利用,促进其指数级增长和存活,或者影响发酵豆乳的风味品质[27],从而引起发酵体系中脂肪酸含量的先增后降,其中,亚油酸作为人体必需脂肪酸之一,其含量占比仍旧突出,其中24 h发酵豆乳最高,B.subtilis BSNK-5的发酵伴随着豆乳降低胆固醇、预防心血管疾病等潜在功效的提高[28]。
大豆异黄酮具有抗疲劳、抗高血压和缓解女性更年期综合症等健康益处[29],主要以难以被人体吸收的结合态糖苷形式存在,微生物的发酵作用产生更高生物活性的苷元型异黄酮[30]。B.subtilis BSNK-5发酵豆乳过程分泌的β-葡萄糖苷酶,将糖苷型异黄酮有效转化为苷元异黄酮,以大豆苷到大豆素的转化最为显著,提高了豆乳的消化吸收利用率,以增强其生物利用度。但发酵后期,黄豆黄素和染料木素水平有所下降,可能是因为葡萄糖苷转化为琥珀酰葡萄糖异黄酮,如琥珀酰-β-染料木素,或发生羟基化反应,形成了羟基型苷元[25]。然而,豆乳质量特性的改善主要通过B.subtilis BSNK-5分泌的蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖苷酶等代谢大豆中营养组分实现,针对性研究B.subtilis BSNK-5胞外生物酶的酶活力,以精准调控豆乳营养特性,对我国发酵豆制品的功能性开发具有重要意义。
4 结论
本研究以B.subtilis BSNK-5为发酵菌株,有效监测了发酵过程中液体豆乳基础营养成分和功能成分的转化。随着发酵时间的延长,B.subtilis BSNK-5的生物量呈指数增长,有效增加了豆乳的生物活性。发酵豆乳中,蛋白质含量和水解氨基酸含量与发酵时间呈负相关,但氨基酸态氮和必需氨基酸含量与发酵时间呈正相关,84 h发酵豆乳中,EAA占比由最初的38.54%增加至51.89%,超过了非必需氨基酸占比。发酵过程中,脂肪及脂肪酸在24 h发酵豆乳中表现突出,而苷元型大豆异黄酮在48 h发酵豆乳中最高,并以大豆苷元到大豆素的构型转化效率最优。因此,B.subtilis BSNK-5的发酵调整了豆乳中蛋白质、脂肪等营养成分的组成比例以及大豆异黄酮功能成分的构型转变,显著改善了大豆的营养价值,正向调节了豆乳中氨基酸组成,提高了豆乳生物利用度,为功能性发酵植物蛋白饮品的质量控制提供科学支持。
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