生物乙醇,由于具有清洁无毒、高生物降解、低温室效应气体排放等特性而受到极大的关注,被认为是能够替代化石燃料的理想能源之一[1]。传统生物乙醇主要是以甘蔗、玉米、薯类等原料生产,成本较高,而且容易导致粮食危机。目前已研发出以木质素纤维素为原料的第2代生物乙醇生产技术,具有良好的应用效果。全球海藻资源非常丰富,海藻中的主要成分是多糖类物质,占干重的40%～60%,被认为是生产生物乙醇的潜在原料[2-3]。蜈蚣藻(Grateloupia livida)是一种典型的红藻,广泛在太平洋和大西洋海域中,含有丰富的多糖[4]。但是由于其口感差,不适合食用,导致其加工价值低,资源利用程度较小[5],利用蜈蚣藻作为原料生产生物乙醇,能够显著提高其利用程度,产生良好的经济价值。然而目前,还未有利用蜈蚣藻生产生物乙醇的报道。
以海藻为原料发酵生产生物乙醇时,菌株一般不含有能够直接水解多糖的酶,无法直接利用其多糖进行生长和代谢[6]。因此,通过预处理的方法将多糖转化为单糖是目前生物乙醇发酵生产的重要步骤。目前,多糖常用的水解方法有酸处理、碱处理、生物酶解等方法,而酸处理对红藻、褐藻等海藻中多糖的水解效果较好[7]。目前,利用稀酸预处理对蜈蚣藻进行水解的方法还未见报道。稀酸预处理后水解液中强酸、营养成分等发酵环境较复杂,传统的发酵菌株由于应激耐受力差导致乙醇生产效率较低。库德毕赤酵母具有耐酸、耐盐、耐高温等多环境耐受性[8],以及高发酵乙醇的能力[9],具有在海藻酸水解液中生长和发酵乙醇的潜力。
因此,本研究以蜈蚣藻为原料,利用单因素和Bo-Behnken响应面试验优化稀酸预处理效果,分析水解液中单糖组成和含量。利用库德毕赤酵母作为发酵菌株,研究在不同接种量条件下菌株在蜈蚣藻水解液中的生长和乙醇发酵特性,进一步利用相关性网络分析不同单糖消耗对库德毕赤酵母生长和发酵乙醇的影响,明确对菌株生长和产乙醇最主要的单糖。本研究结果将为以蜈蚣藻为原料发酵生产生物乙醇提供重要的技术支持,为蜈蚣藻和其他低值藻类的高值化利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
蜈蚣藻(Grateloupia livida)采自汕头南澳岛,洗净、干燥、粉碎后粉碎处理后过80目筛备用。
库德毕赤酵母A16(Pichia kudriavzevii A16)分离自中国高温白酒酒曲[10]。
1.1.2 试剂
氢氧化钠,天津市汇杭化工科技有限公司;盐酸、硫酸,广州化学试剂;阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖标准品、 DNS 试剂,北京索莱宝科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯),上海安谱实验科技有限股份公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯甲烷、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母浸粉、蛋白胨、琼脂,广东环凯微生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
YEPD斜面培养基:1%(质量分数,下同)酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂,pH 5.0。
YEPD液体培养基:1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖,pH 5.0。
1.2 仪器与设备
HH-4数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司;Agilent 1100液相色谱仪,美国Agilent;酶标仪,瑞士TECAN公司;pH计,海仪迈仪器科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 稀酸预处理蜈蚣藻单因素试验优化
取2.0 g蜈蚣藻粉末,根据不同料液比(g∶mL)(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)加入硫酸(质量分数为0%、1%、2%、3%、4%、5%),在不同温度(70、80、90、100、110、120 ℃)下对蜈蚣藻进行热液预处理不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)。除特别说明外,料液比为1∶15、硫酸为3%、水解温度为100 ℃、水解时间为2 h。水解后的蜈蚣藻冷却至室温,8 000 r/min离心5 min,取上清液200 μL,测定蜈蚣藻水解液的还原糖含量,以质量分数(%)表示[11],还原糖的计算如公式(1)所示:
还原糖含量
(1)
式中:C为标准曲线查的糖量,mg;VT为提取液体积,mL;m为样品质量,mg;VS为测定用的样品体积,mL。
1.3.2 稀酸预处理蜈蚣藻响应面试验优化
取2.0 g蜈蚣藻粉末,按照1∶20(g∶mL)料液比加入稀硫酸溶液,在单因素试验的基础上,采用Design-Expert 11进行Box-Behnken试验设计(Box-Behnken design,BBD),选取硫酸质量分数、温度和时间为自变量因素,还原糖含量为响应值,进行响应面试验。
1.3.3 稀酸预处理后蜈蚣藻水解液中单糖组成和含量
按照响应面优化后的最适处理方法获得蜈蚣藻水解液,利用Agilent 1100液相色谱仪测定水解液中的单糖含量[12]。取500 μL蜈蚣藻水解液,加入500 μL 0.3 mol/L的NaOH和500 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液,混合均匀后,在60 ℃恒温水浴锅中反应80 min。冷却至室温后,加入500 μL 0.3 mol/L盐酸调节pH值为7,再加入2 mL三氯甲烷,振荡并静置,丢弃含有PMP下层有机液,重复3次。取1 mL上层水相,用0.22 μm微孔滤膜过滤后,利用HPLC分析单糖组成和含量。色谱柱为gracesmart.C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温为30 ℃,设置进样体积为5 μL,检测波长为250 nm,流动相A为100 mmol/L磷酸钠缓冲液,流动相B为乙腈,随后以1 mL/min的流速进行梯度洗脱。梯度洗脱条件为0～9 min时83%A,9～26 min时78%A,26～32 min时40%A,32～36 min时86%A。根据5种标准单糖(阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)的保留时间和峰面积,对蜈蚣藻水解液中的单糖进行定量分析。
1.3.4 库德毕赤酵母发酵蜈蚣藻水解液
库德毕赤酵母分别用YEPD斜面和YEPD液体培养基进行活化,获得酵母菌种子液[13]。用5 mol/L氢氧化钠溶液将蜈蚣藻水解液调节至pH值为5后,分别按照10%和20%的接种量将酵母菌种子液加入到含有50 mL蜈蚣藻水解液的250 mL锥形瓶中,在30 ℃摇床中180 r/min振荡培养24 h后,取发酵液6 000 r/min、4 ℃离心5 min,菌体用纯水洗涤,在105 ℃烘箱中烘干至恒重后称重,计算生物量(g/L)。上清液用于测定蜈蚣藻水解液中剩余单糖的含量和乙醇含量。采用UPLC[14]测乙醇含量。色谱柱为ICSep Coregel 87H3柱(300 mm×7.8 mm),柱温为30 ℃,进样量为10 μL,流动相为5 mmol/L硫酸溶液,流速为0.6 mL/min。根据乙醇的保留时间和峰面积,对蜈蚣藻发酵液中的乙醇进行定量分析。
1.4 统计分析
每组试验重复测定3次,结果以平均值±标准偏差表示。然后使用SPSS 26.0对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),使用Tukey法多重比较检验数据差异性(P<0.05)。利用Hiplot网站(https://hiplot.com.cn)构建库德毕赤酵母生物量和乙醇发酵特性与单糖组分之间的相关性热图[15]。基于Pearson相关性系数采用Cytoscape v.3.8.1构建库德毕赤酵母生物量和乙醇发酵特性与单糖组分之间的相关性网络图[16]。
2 结果与分析
2.1 稀酸预处理蜈蚣藻单因素试验条件优化
利用单因素试验对稀酸预处理蜈蚣藻的最适条件进行优化,结果如图1所示。红藻中富含卡拉胶、琼胶、纤维素和半纤维素分子等多糖类物质,这些高分子化合物主要由β-1,4糖苷键组成,在一定的氢离子浓度和高温作用下会持续降解,直至分解成葡萄糖、半乳糖等单糖[17]。稀硫酸常被用于破坏多糖的糖苷键,具有很好的水解效果[18]。本研究中,随着硫酸质量分数的增加,蜈蚣藻水解液中还原糖含量呈现先上升后下降的趋势(图1-A)。当硫酸质量分数为3%时,还原糖含量达到最大值(29.67%,质量分数),明显高于硫酸为0%时的还原糖含量(2.09%)。然而,硫酸质量分数超过3%后,还原糖含量反而下降,主要是因为过量的硫酸使得水解液中还原糖转化成糠醛等抑制物[19]。因此,确定水解蜈蚣藻的最适硫酸质量分数为3%。
A-硫酸质量分数;B-水解时间;C-水解温度;D-水解料液比还原糖含量的影响
图1 稀酸预处理蜈蚣藻水解的单因素试验条件优化
Fig.1 Optimization of single factor test conditions for hydrolysis of G.livida by dilute sulfuric acid
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
随着水解时间的增加,蜈蚣藻水解液中还原糖含量先上升后下降(图1-B)。当水解时间为2 h时,还原糖含量达到最大值(29.38%),但是当水解时间超过2 h时,还原糖含量显著下降,这与蒋媛媛等[20]的结论一致,主要是因为过长的水解时间会使得还原糖转化为糠醛的反应增加。因此,确定最适的水解蜈蚣藻时间为2 h。
高温有利于氢离子对多糖中糖苷键的破坏,从而产生更多的还原糖[21]。本研究中,随着水解温度的增加,蜈蚣藻水解液中还原糖含量先上升后下降(图1-C),这与KUMAR等[22]的研究结果一致。当水解温度为100 ℃时,还原糖含量达到最大值,为29.15%。当温度超过100 ℃时,还原糖含量呈现下降趋势,主要是由于过高的水解温度会加剧葡萄糖等还原糖脱水,生成糠醛和有机酸等化合物[23]。因此,确定蜈蚣藻的最适水解温度为100 ℃。
随着料液比的下降,蜈蚣藻水解液中还原糖含量呈现先上升后下降的趋势(图1-D)。当料液比为1∶20(g∶mL)时,还原糖含量达到最大值(35.51%)。然而,当料液比大于1∶20(g∶mL)时,还原糖含量显著下降,主要是由于体系中过量的氢离子会使得生成的葡萄糖转化为糖醛[24]。
由于不同时间、硫酸的质量分数和温度条件下蜈蚣藻水解液中还原糖含量差别较大,而不同的料液比条件下还原糖含量差别较小,因此选择时间、硫酸质量分数、温度这3个条件进行后续响应面优化试验。
2.2 稀酸预处理蜈蚣藻响应面优化试验
根据水解条件单因素试验结果,以时间(A)、硫酸质量分数(B)、温度(C)为响应面实验的3个因素,以还原糖含量(Y)为响应值,采用Box-Behnken试验设计实验方案和结果如表1所示。时间、硫酸与还原糖含量之间的关系可以用如下多元二次回归方程表示:Y=-276.392 3-22.898 1A+44.034 8B+5.139 3C+1.424 9AB+0.334 1AC-0.219 1BC-4.338 4A2-3.820 2B2-0.024 4C2。对回归方程进行方差分析,结果见表2。一次项A、B、C,交互项AB、AC、BC和二次项A2、B2、C2对提取得到还原糖含量影响极显著。对还原糖含量的影响,从大到小排序为:水解温度>硫酸质量分数>水解时间。此模型的P<0.000 1,响应面回归模型达到了极显著水平(P<0.01),失拟项(P=0.885 6>0.05)不显著,变异系数1.02%(<10%),说明非试验因素对结果影响不大,模型具有较好的试验稳定性。模型相关系数R2为0.996 4,这说明该试验模型与实际试验拟合较好。因此可以用此模型来分析和预测稀酸预处理试验中各因素对还原糖含量的影响。
表1 稀酸预处理蜈蚣藻水解液响应面试验设计方案及结果
Table 1 Response surface design scheme and results of hydrolysis of G.livida by dilute sulfuric acid
实验号A(时间)/hB(硫酸质量分数)/%C(温度)/℃Y(还原糖含量)/%11.5210033.0622310037.6832211034.5141.539034.5252310038.5562.5210028.9871.5410035.7682310038.309249033.33102411034.22112.5410034.53122.539028.69132310037.50142.5311037.76151.5311036.90162310037.9117229024.86
表2 稀酸预处理蜈蚣藻水解液响应面试验方差分析
Table 2 Analysis of variance in the response surface analysis of hydrolysis of G.livida by dilute sulfuric acid
方差来源自由度平方和均方F值P值显著性模型9239.3626.60213.22<0.000 1**A(时间)113.2013.20105.81<0.000 1**B(硫酸质量分数)133.7033.70270.22<0.000 1**C(温度)160.5360.53485.25<0.000 1**AB12.032.0316.280.005 0**AC111.1611.1689.48<0.000 1**BC119.2019.20153.96<0.000 1**A214.954.9539.710.000 4**B2161.4561.45492.64<0.000 1**C2125.0225.02200.56<0.000 1**残差70.873 10.124 7失拟项30.118 20.039 40.208 70.885 6不显著纯误差40.754 90.188 7总和16240.2 3R2=0.996 4R2Adj=0.991 7
注:**代表极显著(P<0.000 1)。
基于回归模型方差分析,采用Design-Expert 11作水解时间、水解温度以及硫酸质量分数对还原糖含量的响应面和等高线图,如图2所示。响应曲面和等高线图能直观反应交互作用对响应值的影响程度,曲面越陡,等高线越密集,则影响越显著,等高线越接近椭圆,2个因素的交互作用越强[25]。本研究中3个等高线图均近似椭圆形,说明两两因素交互作用显著;响应面反应了水解温度、硫酸质量分数和水解时间的趋势,皆为先上升后下降的趋势,均出现了最大值,表明最优试验条件包含在本次响应面试验中。
A-硫酸质量分数和水解时间(等高线图);B-水解时间和水解温度(等高线图);C-水解温度和硫酸质量分数(等高线图)D-硫酸质量分数和水解时间(响应曲面图);E-水解时间和水解温度(响应曲面图);F-水解温度和硫酸质量分数(响应曲面图)
图2 稀酸预处理蜈蚣藻水解条件优化的等高线和响应面图
Fig.2 Contour and response surface plots for hydrolysis optimization of G.livida by dilute sulfuric acid
经以上响应面分析,得到稀酸预处理蜈蚣藻最适水解条件为时间1.88 h、温度100.69 ℃、硫酸质量分数3.181%,方程预测还原糖含量理论上可达到38.51%。为了实验操作方便,选取时间1.8 h、温度100 ℃、硫酸质量分数3%作为最适的水解条件,在此条件下进行3次验证试验,得到还原糖含量平均值为37.64%,与预测值基本一致,表明该模型准确性和实用性较高,能够较好的预测还原糖含量。
2.3 稀酸预处理后蜈蚣藻水解液中单糖组成和含量分析
利用最适稀酸预处理条件对蜈蚣藻水解液进行预处理,并测定水解液中的单糖组成和含量,结果如表3所示。蜈蚣藻中主要的成分是卡拉胶,主要由半乳糖以及少量葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等单糖组成。本研究发现,蜈蚣藻水解液的主要单糖组成为半乳糖,其含量为9.367 g/L;同时含有较高浓度的葡萄糖和木糖,其含量分别为3.536 g/L和1.237 g/L;而鼠李糖和阿拉伯糖的含量较低,仅为0.1 g左右。与加酸水解液相比,未加酸水解液中的单糖组分含量显著下降,与LEE等[26]等研究结果一致。未加酸组中,蜈蚣藻水解液基本不含半乳糖、鼠李糖、木糖,而葡萄糖和木糖含量较高,分别为0.072 g/L和0.065 g/L。结果表明,稀酸预处理可以有效破坏蜈蚣藻多糖的糖苷键,从而解决藻类多糖不易被微生物直接利用的问题[27]。
表3 稀酸预处理对蜈蚣藻水解液中单糖组分和含量的影响 单位:g/L
Table 3 Effect of dilute sulfuric acid pretreatment on the components and contents of monosaccharide in the hydrolysate of G.livida
处理方式单糖组分木糖阿拉伯糖葡萄糖半乳糖鼠李糖未加酸0.065±0.012b0.002±0.000b0.072±0.000b0.001±0.000b0.001±0.000b加稀酸1.237±0.023a0.107±0.000b3.536±0.119a9.368±0.521a0.105±0.032a
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.4 库德毕赤酵母对蜈蚣藻水解液中单糖的利用及产乙醇的研究
库德毕赤酵母对蜈蚣藻水解液中不同单糖的利用情况,结果如图3所示。与蜈蚣藻水解液中初始单糖含量相比,发酵后水解液中各单糖组成含量均显著下降,特别是葡萄糖,在库德毕赤酵母发酵后含量被完全消耗,其次是半乳糖和木糖。有研究发现,葡萄糖是酵母菌首先利用的碳源,在发酵过程中会被快速消耗,用于其生长和代谢[28]。
图3 不同接种量对库德毕赤酵母在蜈蚣藻水解液中不同单糖利用的影响
Fig.3 Effect of different inoculations of P.kudriavzevii on the utilization of different monosaccharides in the hydrolysate of G.livida
进一步研究了库德毕赤酵母在蜈蚣藻水解液中生长和产乙醇的情况,结果如表4所示。库德毕赤酵母在蜈蚣藻水解液中具有良好的生长特性,当接种量为10%和20%时,生物量分别达到3.15 g/L和3.89 g/L,说明蜈蚣藻水解液中具有适于酵母菌生长的丰富营养物质。同时库德毕赤酵母在蜈蚣藻水解液中具有良好的乙醇生产能力,当接种量为10%和20%时,乙醇质量浓度分别达到0.66 g/L和1.64 g/L,说明库德毕赤酵母具有利用蜈蚣藻生产乙醇的潜力,接种量的增加能够有效提高菌株的产乙醇能力以及乙醇生产率。
表4 不同接种量对库德毕赤酵母在蜈蚣藻水解液中生长和乙醇发酵特性的影响
Table 4 Effect of different inoculations of P.kudriavzevii on the growth and ethanol fermentation characteristics in the hydrolysate of G.livida
指标10%接种量20%接种量M0/(g/L)0.52±0.05b1.22±0.03aMt/(g/L)3.15±0.28b3.89±0.04aC/(g/L)0.66±0.01b1.64±0.12aP/(g/g菌体)0.21±0.01b0.42±0.01aQ/(g/L/h)0.03±0.00b0.07±0.01a
注:M0为发酵前生物量;Mt为发酵后生物量;C为乙醇浓度;P为菌株产乙醇能力;Q为乙醇生产率(下同)。
库德毕赤酵母的生长和乙醇发酵与蜈蚣藻水解液中单糖利用间的相关性,如图4中所示。蜈蚣藻水解液中各单糖含量与生物量和各乙醇发酵参数呈显著负相关(P<0.05),说明蜈蚣藻水解液中单糖的消耗在库德毕赤酵母的生长和乙醇生产过程中起到很重要的作用。生物量与各乙醇发酵参数呈显著正相关(P<0.05),说明库德毕赤酵母的生长状况直接关系到乙醇的发酵生产。葡萄糖是酵母菌发酵生产乙醇的主要原料,能够直接通过糖酵解途径分解成乙醇[29]。本文发现,在所有单糖中,葡萄糖的消耗对库德毕赤酵母生物量的增加和乙醇的生产影响最大,说明葡萄糖是库德毕赤酵母在生长和乙醇发酵代谢的主要碳源。半乳糖可以通过降解D-半乳糖的代谢途径生成D-葡萄糖-6-磷酸,然后再通过糖酵解途径产生乙醇和能量[30]。在本文中,半乳糖的消耗对库德毕赤酵母生长和乙醇发酵也发挥着重要的影响。
A-相关性热图;B-相关性网路图
图4 蜈蚣藻水解液中不同单糖利用对库德毕赤酵母的生长和乙醇发酵特性的影响
Fig.4 Effect of utilization of different monosaccharides in the hydrolysate of G.livida on the growth and ethanol fermentation characteristics of P.kudriavzevii
3 结论
通过单因素和Bo-Behnken响应面试验优化确定最佳稀酸预处理蜈蚣藻水解液的条件为料液比1∶20(g∶mL)、时间1.8 h、温度100 ℃、硫酸质量分数为3%,还原糖含量达到37.64%。稀酸预处理能够显著提高蜈蚣藻水解液中单糖含量,其中最主要单糖成分为半乳糖和葡萄糖。库德毕赤酵母能够在蜈蚣藻水解液中具有良好的生长和产乙醇特性,接种量的增加能够显著提高菌株的生物量和乙醇发酵特性。蜈蚣藻水解液中各单糖含量与生物量和各乙醇发酵参数呈显著负相关,生物量与各乙醇发酵参数呈显著正相关,说明蜈蚣藻水解液中单糖的消耗在库德毕赤酵母的生长和乙醇生产过程中起到很重要的作用,而酵母菌的生长状况直接关系到乙醇的发酵生产。相关性网络图(图4)显示,葡萄糖的消耗对库德毕赤酵母生物量的增加和乙醇的生产影响最大,是库德毕赤酵母在生长和乙醇发酵代谢的主要碳源。利用蜈蚣藻为原料,通过稀酸预处理结合库德毕赤酵母发酵,具有生产生物乙醇的应用潜力,为蜈蚣藻的高值化利用提供重要技术支撑,也为其他低值藻类的利用提供参考。
[1] 黄伊婷, 黄清妹, 杨亚会, 等.大型藻类发酵燃料乙醇的研究进展[J].中国酿造, 2017, 36(8):26-30.HUANG Y T, HUANG Q M, YANG Y H, et al.Research progress on fuel ethanol fermentation from macroalgae[J].China Brewing, 2017, 36(8):26-30.
[2] YIN Y N, WANG J L.Pretreatment of macroalgal laminaria japonica by combined microwave-acid method for biohydrogen production[J].Bioresource Technology, 2018, 268:52-59.
[3] KRAAN S.Mass-cultivation of carbohydrate rich macroalgae a possible solution for sustainable biofuel production[J].Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 2013, 18(1):27-46.
[4] 蔡苗苗, 陈胜军, 杨贤庆, 等.舌状蜈蚣藻蛋白质的提取及其抗氧化活性研究[J].南方水产科学, 2020, 16(2):99-106.CAI M M, CHEN S J, YANG X Q, et al.Extraction and antioxidant activity of protein from Grateloupia livida[J].South China Fisheries Science, 2020, 16(2):99-106.
[5] 陈素文, 冯彬, 李婷, 等.蜈蚣藻属生物学与养殖研究进展[J].南方水产科学, 2019, 15(1):119-123.CHEN S W, FENG B, LI T, et al.Research progress in biology and aquaculture of Grateloupia[J].South China Fisheries Science, 2019, 15(1):119-123.
[6] TSE T J, WIENS D J, REANEY M J T.Production of bioethanol—a review of factors affecting ethanol yield[J].Fermentation, 2021, 7(4):268.
[7] TURNER W, GREETHAM D, DU C Y.The characterisation of Wickerhamomyces anomalus M15, a highly tolerant yeast for bioethanol production using seaweed derived medium[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10:1028185.
[8] LI C S, XU Y, LI L H, et al.Acid stress induces cross-protection for cadmium tolerance of multi-stress-tolerant Pichia kudriavzevii by regulating cadmium transport and antioxidant defense system[J].Journal of Hazardous Materials, 2019, 366:151-159.
[9] LI C S, LIU Q Y, WANG Y Q, et al.Salt stress improves thermotolerance and high-temperature bioethanol production of multi-stress-tolerant Pichia kudriavzevii by stimulating intracellular metabolism and inhibiting oxidative damage[J].Biotechnology for Biofuels, 2021, 14(1):222.
[10] 刘秋影, 李春生, 杨贤庆, 等.基于TMT的定量蛋白质组学技术解析盐胁迫提高库德毕赤酵母耐热性机制[J].食品科学, 2022, 43(14):102-110.LIU Q Y, LI C S, YANG X Q, et al.Tandem mass tag-based quantitative proteomics revealed the mechanism by which salt stress improves the thermotolerance of Pichia kudriavzevii[J].Food Science, 2022, 43(14):102-110.
[11] 张晓丹,张姗,王红玉,等.预处理方式对海带生物质利用性能的影响[J].广东海洋大学学报, 2022, 42(6):24-29.ZHANG X D, ZHANG S, WANG H Y, et al.Effects of pretreatment methods on the utilization performance of Laminaria japonica biomass[J].Journal of Guangdong Ocean University, 2022, 42(6):24-29.
[12] 太敏瑞, 蔡泓滢, 李瑞, 等.不同褐藻来源岩藻多糖理化性质及其免疫调节作用[J].广东海洋大学学报,2022,42(3):62-71.TAI M R, CAI H Y, LI R, et al.Physicochemical properties and immunomodulatory effects of fucoidan from different brown algae[J].Journal of Guangdong Ocean University, 2022, 42(3):62-71.
[13] 李春生. 库德毕赤酵母重金属积累特性及高盐/低pH下镉抗性提高机理研究[D].青岛:中国海洋大学, 2015.LI C S.Heavy metal bioaccumulation characteristics and mechanisms of the improved cadmium tolerance at high NaCl concentrations or low pH in Pichia kudriavzevii[D].Qingdao:Ocean University of China, 2015.
[14] LI C S, LI L H, YANG X Q, et al.Effect of inorganic salt stress on the thermotolerance and ethanol production at high temperature of Pichia kudriavzevii[J].Annals of Microbiology, 2018, 68(5):305-312.
[15] LI C S, LI W J, LI L H, et al.Microbial community changes induced by a newly isolated salt-tolerant Tetragenococcus muriaticus improve the volatile flavor formation in low-salt fish sauce[J].Food Research International, 2022, 156:111153.
[16] YANG D Q, LI C S, LI L H, et al.Novel insight into the formation mechanism of umami peptides based on microbial metabolism in Chouguiyu, a traditional Chinese fermented fish[J].Food Research International, 2022, 157:111211.
[17] KUSMIYATI K, HADIYANTO H, FUDHOLI A.Treatment updates of microalgae biomass for bioethanol production:A comparative study[J].Journal of Cleaner Production, 2023, 383:135236.
[18] HEBBALE D, RAMACHANDRA T V.Optimal sugar release from macroalgal feedstock with dilute acid pretreatment and enzymatic hydrolysis[J].Biomass Conversion and Biorefinery, 2023, 13(9):8287-8300.
[19] FENG D W, LIU H Y, LI F C, et al.Optimization of dilute acid hydrolysis of Enteromorpha[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2011, 29(6):1243-1248.
[20] 蒋媛媛, 包海军, 曾淦宁, 等.稀酸预处理铜藻制备生物乙醇工艺[J].环境科学研究, 2014, 27(7):804-812.JIANG Y Y, BAO H J, ZENG G N, et al.Optimization of Sargassum horneri pretreatment process using diluted acid for bioethanol[J].Research of Environmental Sciences, 2014, 27(7):804-812.
[21] DEY S, JAYARAMAN N.Glycosidic bond hydrolysis in septanosides:A comparison of mono-, di-, and 2-chloro-2-deoxy-septanosides[J].Carbohydrate Research, 2014, 399:49-56.
[22] KUMAR R, PRAKASH O.Experimental investigation on effect of season on the production of bioethanol from wheat-stalk (WS) using simultaneous saccharification and fermentation (SSF) method[J].Fuel, 2023, 351:128958.
[23] 张维特, 时旭, 欧杰等.酸法水解绿潮藻生物质及发酵制乙醇的效果[J].上海海洋大学学报, 2011, 20(1):131-136.ZHANG W T, SHI X, OU J, et al.Effect of preparing alcohol with green tide algae biomass by acid hydrolysis[J].Journal of Shanghai Ocean University, 2011, 20(1):131-136.
[24] TERAMOTO H, SUDA M, INUI M.Effects of potential inhibitors present in dilute acid-pretreated corn stover on fermentative hydrogen production by Escherichia coli[J].International Journal of Hydrogen Energy, 2022, 47(68):29219-29229.
[25] 黄明浩, 黄泰奇, 邓丽娟.响应面法优化白英粗多糖提取工艺及其体外抗氧化活性的分析[J].食品工业科技, 2023, 44(22):219-225.HUANG M H, HUANG T Q, DENG L J, et al.Optimization of Solanum lyratum crude polysaccharide extraction process using response surface methodology and analysis of its in vitro antioxidant activity[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(22):219-225.
[26] LEE J Y, LI P, LEE J, et al.Ethanol production from Saccharina japonica using an optimized extremely low acid pretreatment followed by simultaneous saccharification and fermentation[J].Bioresource Technology, 2013, 127:119-125.
[27] SIRAJUNNISA A R, SURENDHIRAN D.Algae—A quintessential and positive resource of bioethanol production:A comprehensive review[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 66:248-267.
[28] 孙乐乐. 绿色介质耦合汽爆处理秸秆及其高固酶解发酵乙醇的研究[D].北京:中国科学院大学, 2021.SUN L L.Study on green medium coupled steam explosion pretreatment of corn stover and processes of high-solids enzymatic hydrolysis and fermentation for ethanol production[D].University of Chinese Academy of Sciences, 2021.
[29] SALAZAR Y, VALLE P A, RODR
GUEZ E, et al.Mechanistic modelling of biomass growth, glucose consumption and ethanol production by Kluyveromyces marxianus in batch fermentation[J].Entropy, 2023, 25(3):497.
[30] KIM J, SUNWOO I, JO H, et al.Enhancement of galactose uptake for bioethanol production from Eucheuma denticulatum hydrolysate using galactose-adapted yeasts[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2023, 46(6):839-850.