再制马苏里拉干酪贮藏期间的拉伸性和析油性变化研究

近年来随着消费者对披萨类食品需求的增加,再制干酪越来越受到消费者的青睐[1]。再制干酪通常是通过混合天然干酪、奶油、奶粉、乳化盐、水等原料,经过加热和剪切而获得的均匀产品,与天然干酪不同,再制干酪不需要经历成熟阶段,并且允许干酪制造商调整再制干酪的具体工艺参数和配方比例来满足市场需要[2]。尽管我国干酪行业发展仍处于初级阶段,但干酪产业规模不断扩大,拥有巨大的发展潜力,再制干酪已成为国内干酪消费的主要类型[1,3]。

再制马苏里拉干酪作为再制干酪的重要种类,被广泛地用于披萨、焗饭、烧烤或烘焙类食品中,其受热后所表现出的拉伸性和析油性被认为是重要的功能用途[4]。为保证干酪的功能特性,延长产品保质期,低温贮藏(尤其是冷冻保藏)常被用于干酪生产后的保藏[5-6]。因冷藏成本经济,使用方便,也被用于干酪的贮藏。尽管再制干酪较天然干酪有着更佳的贮藏稳定性[7],但冷藏条件对其品质劣变依然有着重要的影响。DHARAIYA等[8]发现在冷藏过程中,模拟马苏里拉干酪的油脂析出呈现线性增加,而干酪的拉伸性则在一定范围内波动。GUO等[9]研究发现可拉伸型再制干酪在冷藏过程中pH 4.6可溶性氮组分、可溶性钙、可溶性磷和结合水组分显著增加。O′MALLEY等[10]认为干酪类似物中残留的纤溶酶可能是引起模拟干酪蛋白质水解的主要原因。

再制马苏里拉干酪的产品质量受到诸多因素的影响,包括原料的成分和配比、生产过程中的工艺参数、贮藏条件以及产品的最终参数(如pH值、干物质含量、蛋白质含量)等[11],导致不同来源的再制马苏里拉干酪产品存在品质差异。因此本研究选择目前国内市售的7种不同品牌再制马苏里拉干酪和2种天然马苏里拉干酪,比较其在4 ℃冷藏和-18 ℃冻藏条件下的品质变化,重点测定不同时间节点干酪的拉伸性、油脂析出性、蛋白水解程度、纤溶酶、牛组织蛋白酶B(Cath-B)、牛组织蛋白酶D(Cath-D)的活力和微观结构,从宏观和微观层面对干酪品质进行评价。目的是了解再制马苏里拉干酪产品在长期低温贮藏过程中的功能特性变化以及产品间品质差异,为再制马苏里拉干酪类产品开发及质量提升提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

7种市售不同品牌再制马苏里拉干酪(1～4号、6～8号样品)和2种天然马苏里拉干酪(5号、9号样品)。其主要配料见表1。

尼罗红染液、固绿染液,美国Sigma-Aldrich公司;BCA试剂盒,索莱宝生物科技有限公司;牛纤溶酶、Cath-B、Cath-D试剂盒,上海酶联科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ME2002E02电子天平,梅特勒托利多仪器有限公司;LS800激光共聚焦显微镜,德国蔡司公司;Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪,丹麦福斯集团公司;CR21Ⅲ高速冷冻离心机,日本HITACHI公司;NanoQuant Infinite M 200 PRO酶标仪,瑞士Tecan公司;SU 8020扫描电镜,日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 拉伸性测定

取碎状马苏里拉干酪样品60 g均匀置于事先均分为4份的6寸披萨饼,置于预热好的烤箱中270 ℃烘焙260 s,冷却至样品温度达到70～80 ℃。均匀用力向上拿起一份披萨饼,测定拉丝长度,每个样品重复3次,精确到0.1 cm,拉伸长度平均值表示马苏里拉干酪的拉伸性[12]。

1.3.2 油脂析出性测定

采用改良的Schreiber实验法测定马苏里拉干酪的析油性,方法略有改动。取3 g马苏里拉干酪样品,置于直径15 cm的滤纸中央,在室温下回复温度30 min,然后将其放入预热至100 ℃的烘箱内,100 ℃下加热1 h取出,在室温下回复30 min。用直尺测定马苏里拉干酪析出油圈的直径。每个样品测定3次,精确到0.1 cm,油圈直径平均值表示马苏里拉干酪的油脂析出性[13]。

1.3.3 干酪中蛋白酶活性测定

取1.5 g马苏里拉干酪于10 mL蒸馏水中混匀,40 ℃水浴30 min,后12 000 r/min离心10 min,取上清液。按照试剂盒的方法测定马苏里拉干酪中纤溶酶、Cath-B、Cath-D水平。

1.3.4 总氮、pH 4.6可溶性氮及完整酪蛋白含量测定

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准-食品中蛋白质的测定》中的方法测定干酪中的总氮含量。

在pH 4.6的条件下采用凯氏定氮法测定马苏里拉干酪样品中pH 4.6可溶性氮含量[9]。具体方法为:称取0.75 g马苏里拉干酪样品,置于25 mL的pH 4.6的乙酸缓冲液中研磨制成悬浮液,40 ℃水浴静置1 h,于4 ℃下以3 000×g离心力离心30 min,最后分离出上清液。利用上清液进行凯氏定氮,测定干酪中pH 4.6可溶性氮含量。

完整酪蛋白含量[14]的测定方法如公式(1)所示:

完整酪蛋含量=(总氮含量-pH 4.6可溶性氮含量)×6.38

式中:6.38为干酪制品中氮换算为蛋白质的系数。

1.3.5 激光共聚焦显微镜分析方法

将1%(质量分数)固绿染液与0.5%(质量分数)尼罗红染液以1∶1(体积比)混合,得混合染液。将马苏里拉干酪样品切成薄片,将马苏里拉干酪薄片置于载玻片,滴加上述混合染料染色于样品上,避光染色20 min后,纯水冲洗样品,盖上盖玻片,封片后置于显微镜下,在63倍油镜下观察[15],尼罗红与固绿水溶液的激发波长分别为528 nm与633 nm。

1.3.6 扫描电镜分析方法

取1～2 g马苏里拉干酪样品于2 mL离心管中,2.5%(质量分数)戊二醛溶液(电镜专用)浸泡4 h后用0.1 mol/L PBS(pH 7.2)冲洗样品3次,间隔10 min/次,再分别用体积分数分别为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇样品梯度脱水,每个体积分数的乙醇处理10 min,最后冷冻干燥36 h后制样喷金,于扫描电镜下对马苏里拉干酪结构详细观察分析[16]。

1.3.7 干酪感官评定

由10名经过培训的感官小组成员对马苏里拉干酪进行感官评分。每名成员发放一组随机编号的样品和一张评分表,采用双盲法进行检验。马苏里拉干酪感官评定标准见表1,参考标准RHB 507—2015《匹萨用拉丝性干酪感官评鉴细则》稍作修改,感官评定得分取平均值。

1.4 数据处理

每个马苏里拉干酪样品至少进行3次平行实验,结果用±标准差表示,采用SPSS 26进行数据分析,Origin 2020作图。

2 结果与分析

2.1 干酪贮藏过程中拉伸性的变化

干酪拉伸性可定义为在对熔融干酪持续施加拉伸应力时酪蛋白网络保持其完整性的能力[9]。拉伸性是马苏里拉干酪的一个重要功能特性,拉伸性干酪赋予比萨等食品独特的拉丝品质。图1显示各品牌干酪样品在4 ℃和-18 ℃下贮藏180 d期间的拉伸性变化。总体来看,不同贮藏温度条件下不同品牌马苏里拉干酪的拉伸性变化不同,变化幅度在25～50 cm;天然马苏里拉干酪的拉伸性总体优于再制马苏里拉干酪,且前者180 d贮藏期内变化幅度更小;不同贮藏温度(4 ℃和-18 ℃)对于再制干酪的拉伸性有着重要影响。

在4 ℃冷藏条件下,再制马苏里拉干酪样品中拉伸性最好的为4号样品,平均拉伸长度为30 cm左右;拉伸性最差的为7号样品,其拉伸长度平均仅有5 cm。随着贮藏时间的延长,拉伸性下降最慢的为2种天然马苏里拉干酪;再制马苏里拉干酪中拉伸性下降程度最低的为6号样品,拉伸长度仅降低27%左右;拉伸性最差的7号样品在冷藏75 d后几乎失去拉伸性。

在-18 ℃冻藏条件下,再制马苏里拉干酪中4号样品具有最佳拉伸性,其平均拉伸长度为42 cm左右,较4 ℃冷藏条件下高12 cm左右;7号样品的拉伸性最差,其平均拉伸长度为24 cm,优于4 ℃冷藏的拉伸性。相对于4 ℃冷藏条件,-18 ℃下各马苏里拉干酪样品的拉伸性下降相对缓慢,拉伸长度下降最低的为3号样品,整个贮藏期几乎没有发生改变;拉伸长度下降最大的为6号样品,降低了约32%。拉伸性最差的7号样品冻藏180 d后仍具有一定的拉伸性。

马苏里拉干酪的拉伸性与其中酪蛋白分子之间的相互作用密切相关[17]。随着干酪贮藏时间的延长,其中蛋白质降解,长丝状结构变短、断裂[18]。蛋白质降解、水分分布改变、可溶性钙比例增加等因素对马苏里拉干酪的拉伸性具有重要影响[19]。本研究各干酪样品在4 ℃冷藏条件下拉伸性下降幅度总体上大于冻藏条件下的下降幅度,可能与干酪样品中蛋白酶的活力有关(2.4节部分相关讨论)。

2.2 干酪贮藏过程中析油性的变化

干酪析油性是指干酪在烘烤过程中干酪融化并析出油脂,这些脂肪可能会聚在一起从蛋白质基质中分离[13]。适量析油可使食物看起来更诱人,但过度析油会导致食物油腻,反而降低消费者食欲。析油性反映了干酪加热后的流动分散能力及干酪内部胶束结构的变化[20]。脂肪在干酪中的物理状态及其与酪蛋白的相互作用与析油性密切相关[21]。

图2显示各品牌干酪样品在4 ℃和-18 ℃下贮藏180 d期间的析油性变化。天然马苏里拉干酪总体析油性低于再制马苏里拉干酪,且在180 d贮藏条件下变化幅度更小。4 ℃贮藏条件下,7号样品的析油性最低,平均析油直径约为3 cm;析油性最高的为3号样品,平均析油直径达14 cm左右。贮藏期间,除7号样品外,各干酪的析油性均呈现上升趋势;析油性升高最多的为8号样品,其析油性升高约78%。

-18 ℃贮藏180 d期间,除7号样品外,各品牌干酪析油性均呈一定程度上升趋势,但是总体变化相对缓慢;7号样品析油性最低,120 d后没有进一步油脂析出;析油性最高的为3号样品。析油性变化最大的为8号样品,其析油性升高34%。

据报道,除了贮藏温度影响干酪中油脂的存在状态外,添加胶体对再制马苏里拉干酪的析油性也有较大影响[19]。本研究7号样品在贮藏过程中的析油最少,可能与该产品配料中含有微晶纤维素有关[22]。

2.3 干酪贮藏过程中完整酪蛋白含量的变化

干酪中完整酪蛋白含量与其理化性质密切相关[18]。通过测定干酪贮藏过程蛋白降解程度及完整酪蛋白含量,可以探究干酪的质构、风味、拉伸性、乳化体系稳定性等的变化。基于上述对不同品牌马苏里拉干酪样品贮藏期间拉伸性和析油性变化的分析比较结果,选择4 ℃冷藏条件下拉伸性和析油性变化最明显的3种再制马苏里拉代表样品即4号样品(拉伸性最佳),7号样品(析油最少)和8号样品(析油增加最多),分析其中蛋白降解及完整酪蛋白含量在冷藏期间的变化。

图3显示3种再制马苏里拉代表样品冷藏期间的总氮含量、pH 4.6可溶性氮含量及完整酪蛋白含量的变化。干酪中总氮含量除4号样品的变化较明显外,7号和8号样品的变化不明显;各样品pH 4.6可溶性氮含量含量均随贮藏时间的延长而显著增加,其中8号样品增加幅度最大,4号样品次之,7号样品增加幅度最小。4号和8号样品中完整酪蛋白含量有显著增加,而7号样品的变化不明显。上述结果表明,8号样品的蛋白降解程度增加幅度最大,完整酪蛋白含量下降显著,因此导致其析油增加最多;7号样品的完整酪蛋白下降不明显,因此其析油最少;4号样品的蛋白降解程度相对较低,其拉伸性最佳。关龙等[18]报道了类似的再制干酪蛋白降解程度与其拉伸性和析油性的相关性。

2.4 干酪贮藏过程中蛋白酶活力的变化

干酪中存在的蛋白酶如纤溶酶、Cath-B和Cath-D等对于贮藏过程中干酪的品质具有重要影响[23]。纤溶酶以活力的本体或者无酶活力的纤溶酶原为主,附着于乳中酪蛋白胶束和乳脂球膜;纤溶酶原耐热性极强,很容易被激活转为有活力的纤溶酶[23]。Cath-B广泛水解β-酪蛋白(含32个裂解位点)和αs1-酪蛋白(含35个裂解位点),倾向于水解包含氨基酸Leu、Val、Gln、Pro和Ser的肽键[24]。Cath-D易于水解αs1-、αs2-和β-酪蛋白,能够部分耐受商业巴氏杀菌处理。

图4显示马苏里拉干酪样品贮藏(4 ℃,-18 ℃)期间蛋白酶活力的变化。多数马苏里拉干酪样品的纤溶酶活力呈逐渐增加趋势,-18 ℃下变化较大,其中变化幅度最大的是4号样品,天然马苏里拉干酪(5号,9号)的变化相对较小(图4-A)。Cath-B活力呈现先下降后增加的趋势,且在-18 ℃下变化较大,而天然马苏里拉干酪的变化相对稳定(图4-B);Cath-D活力在4 ℃下变化较大,且总体上呈下降趋势,而-18 ℃下变化不大(图4-C)。因此,总体上所有干酪样品贮藏期间均存在不同程度的蛋白酶活力包括纤溶酶、Cath-B和Cath-D活力,其在4 ℃冷藏条件下可以缓慢降解干酪中的蛋白质,不同程度影响干酪品质包括拉伸性和析油性的贮藏稳定性。而冻藏(-18 ℃)条件可能不利于蛋白酶的降解蛋白作用,这与上述各马苏里拉干酪样品冻藏期间拉伸性和析油性变化较小的实验结果一致。

2.5 干酪贮藏过程中微观结构的变化

了解干酪内部微观结构,是研究干酪及验证其宏观指标的重要手段。使用扫描电子显微镜和激光共聚焦成像技术对马苏里拉干样品酪贮藏过程中微观结构的变化进行观察分析,可以进一步了解马苏里拉干酪理化性质的变化机制。选择3号(析油最多)和7号(析油最少)的干酪样品进行扫描电镜实验。由图5可知,3号样品中多为酪蛋白团,由于析油导致其中油脂含量较少;7号样品酪蛋白及油脂结构紧密且分布均匀。在马苏里拉干酪内部,酪蛋白胶束之间相互作用而连接聚集在一起,形成连续、不定向的缕状蛋白网络结构[16]。其中酪蛋白和矿物质的结合聚集可形成团状固体颗粒堆积结构,而不规则空洞是马苏里拉干酪经过脱水作用而留下的空穴[11]。

马苏里拉干酪贮藏过程中内部乳化体系的变化可能与其中的水分迁移有关,随着贮藏时间的延长,水分被蛋白质分子吸收并导致其体积膨胀,从而挤压蛋白质网络结构中的脂肪,使脂肪变形,析油现象加重[15]。激光共聚焦成像技术可以通过蛋白质和脂质特异性染色来可视化和化学区分马苏里拉干酪成分,监测其中乳化体系随着时间延长的变化,如蛋白质和脂肪结构的变化[15]。

通过比较再制(7、8号)和天然(5、9号)马苏里拉干酪样品的激光共聚焦成像图(图6),结果表明,7号样品的蛋白密度大,脂肪密度小,一定程度上有利于将脂肪包裹,这与其前述此样品析油少的结果相吻合;8号样品的蛋白结构较松散,不利于有效包裹油脂,导致其析油比较严重;5号和9号天然马苏里拉干酪样品的蛋白结构相对紧密且有一定连续性,呈现较好的乳化体系,这与前述天然干酪良好的拉伸性和析油性的结果一致。

2.6 干酪贮藏过程中感官品质的变化

为了研究冷藏条件下各干酪样品感官品质的变化,对其4 ℃贮藏90 d及180 d的感官品质进行了评价分析,结果如图7所示,天然马苏里拉干酪与再制马苏里拉干酪的感官评分结果无明显差异。干酪评分体系中气味的感官占比值较大,在所有样品中,90 d时仅7号样品基本无异味,且外观均匀光滑,无明显析油。得分最低的是6号样品,其异味较大,色泽变化明显,呈现微红状态,组织状态疏松、易碎、无弹性、无纤维结构。此外2号及3号样品表面油脂较多且几乎完全结块,产品原本的条状干酪碎状态完全丧失。180 d时各马苏里拉干酪样品感官评分有一定程度降低,7号样品气味得分依旧较高,其余样品均有明显哈喇味。且所有样品均已结块,除7号样品外,其余样品表面均可见明显油脂析出,这一现象与上述析油性结果一致,该样品气味得分较好可能是由于油脂稳定存在于干酪中,导致其不易析出氧化、酸败。

3 讨论

干酪的拉伸性是指干酪经过烘烤熔化后,在被施加拉伸应力时,能够表现出纤维丝状结构且不易于断裂的特性[9]。此特性的形成主要是由于干酪体系内酪蛋白分子之间的相互作用,包括钙交联作用、静电相互作用、氢键作用等[12,25]。影响再制干酪拉伸性的主要因素包括干酪的完整酪蛋白含量、乳化盐种类及用量、淀粉的使用等[26-27]。研究表明,再制马苏里拉干酪拉伸性形成的主要原因之一是酪蛋白分子之间基于胶体磷酸钙形成的钙桥连接,使干酪在外加应力作用下呈现拉丝特性[19]。本研究发现,随着再制马苏里拉干酪贮藏时间的延长,其中的完整酪蛋白含量减少(图3-C),同时观察到干酪的拉伸性降低(图1)。例如8号样品的完整酪蛋白含量相对较高(图3-C),其整体拉伸性较好(图1),表明在再制马苏里拉干酪中,完整酪蛋白的存在有利于其分子之间通过钙桥连接而表现出更优的拉伸性,这一结果与李红娟等[28]的研究结果相似。乳化盐作为再制干酪的重要原料,其主要作用是通过置换酪蛋白分子中结合的钙离子,使酪蛋白具有良好的乳化性从而形成再制干酪稳定的乳化体系,同时被置换出的钙离子仍以结合钙形式存在于酪蛋白分子之间而发挥其促进干酪体系拉丝的形成[28]。再制马苏里拉干酪常用的乳化盐为磷酸盐和柠檬酸盐,前者对钙的螯合作用更强,其与钙离子结合后使钙离子不易被释放出来;而柠檬酸盐与钙离子结合后,其中钙离子还可释放出来,因此磷酸盐常用来提高再制干酪的乳化性而使体系更稳定,柠檬酸盐则常用来提升再制干酪的拉伸性[17]。本研究发现3号样品的拉伸性居较低水平(图1),这可能与其未添加柠檬酸钠有关(表1)。此外,添加不同种类的变性淀粉也影响再制马苏里拉干酪的拉伸性[27]。本研究中2号和4号样品添加了羟丙基淀粉,两者的拉伸性相对较佳且在贮藏过程中较稳定。据报道,羟丙基淀粉受热后呈现较高的黏度,产品中添加了羟丙基淀粉通常具有良好的黏度和冻融稳定性[29]。乙酰化双淀粉己二酸酯则常作为食品的增稠剂,一定程度上也可以提升再制干酪的黏度和拉伸性。3号样品添加了乙酰化双淀粉己二酸酯,而未添加有利于干酪拉伸的柠檬酸钠(表1),此样品仍具有较好的拉伸性(图1)。沈建洋等[19]也有相似的结果,其发现向再制干酪添加一定量的醋酸酯淀粉可以明显提升干酪的拉伸性。

干酪经过加热熔化后形成的液态脂肪从干酪中析出的现象称为干酪的析油性[6]。影响再制干酪析油性的主要因素包括生产过程中添加的胶体、物料的乳化程度等[30]。再制马苏里拉干酪的制作主要包括混料、升温、乳化和冷却,其中乳化过程是最重要的环节之一。乳化程度越高,则干酪中蛋白质与脂肪之间以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用更强,对干酪的拉伸性、析油性和稳定性影响越大[28]。影响干酪乳化性的主要因素包括乳化时间、乳化温度、乳化盐的种类及添加量等。研究表明,在乳化时间较长、温度较高的情况下,产品体系稳定,脂肪分布均匀,酪蛋白网络结构紧密,产品硬度较高,外表光滑无粉感,融化性低[28]。本研究中3号样品析油性较严重(图2),其表面粗糙,粉感较重,贮藏过程中易于结块(图7),表明其乳化状况不佳。7号样品析油性较轻微(图2),外观细腻光滑,且在贮藏过程中不易结块(图7),酪蛋白及脂肪分布均匀,脂肪球大小均一(图6),表明其乳化效果好,可能与其配料中含有微晶纤维素相关。据报道,微晶纤维素作为乳液体系的悬浮稳定剂及乳化剂,可以完全分散在体系中形成三维稳定结构,防止体系中的其他物质聚集[31]。

4 结论

本研究比较了7种再制和2种天然马苏里拉干酪,分别测定其于4 ℃及-18 ℃条件下贮藏180 d期间的拉伸性、析油性、3种蛋白酶活力、总氮含量、pH 4.6可溶性氮含量、完整酪蛋白含量、干酪微观结构和感官品质的变化。总体上,天然马苏里拉干酪拉伸性相对优于再制马苏里拉干酪,而二者的析油性接近。在-18 ℃条件下贮藏的干酪样品更稳定,劣变更慢。4 ℃冷藏条件下,随着贮藏时间的延长,天然及再制马苏里拉干酪均有拉伸性降低、析油性升高、完整酪蛋白含量降低的趋势。干酪贮藏过程中,各样品均检测到不同含量的蛋白酶活力,包括纤溶酶、Cath-B和Cath-D,由蛋白酶作用导致的酪蛋白降解及完整酪蛋白含量降低对于冷藏干酪品质的劣变具有重要影响。再制干酪中完整酪蛋白含量越高,酪蛋白与油脂结合更紧密,分布更均匀,则干酪品质越好。未来需进一步研究再制马苏里拉干酪中蛋白质结构特性和分子形态的变化对其拉伸和析油性等品质的影响机制。

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