番茄红素是一种天然色素,属于类胡萝卜素的一种。番茄红素淬灭单线态氧的能力强,具有高效的抗氧化性[1],有抗癌[2]、保护皮肤[3]、抗炎[4]、增加免疫力[5]等功效。目前,番茄红素不同生产工艺产生的原料主要分为天然来源[6]、微生物发酵来源[7]、人工合成来源[8]。天然来源的番茄红素提取方式为直接萃取、超临界CO2萃取等,该方式成本高,价格昂贵;微生物发酵法主要以淀粉、玉米淀粉、葡萄糖为原料利用菌落三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora[9]、基因改造的酵母[10]和大肠杆菌[11]生产而成,发酵效率较高、成本和价格相对较低[12];人工合成番茄红素则使用柠檬醛、紫罗兰酮与乙炔为原料通过Wittig反应合成,价格廉价、反应效率高、副产物少,目前已在工业领域大规模应用[13]。由于3种来源的番茄红素的成本和价格差异,可能存在一些不法商家使用人工合成或发酵来源番茄红素冒充天然番茄红素的问题,进而导致消费者利益受损。因此,有必要建立一种鉴别天然番茄红素的分析方法。
刘沐霖等[14]根据番茄红素前体(八氢番茄红素)、后体(β-胡萝卜素)、番茄红素顺式异构体在天然番茄红素中的存在比例的特征[15],使用二极管阵列检测器-高效液相色谱法,区分天然来源与人工合成番茄红素。但高效液相色谱法存在灵敏度低、检测时间长、缺乏与来源直接相关的指标等局限性,使得鉴别准确率有待完善。稳定同位素技术在食品掺假、产地溯源等领域具有显著优势,已广泛应用于咖啡饮料[16]、肉类[17]等产品的掺假辨别中。KROLL等[18]利用元素分析仪-稳定同位素比质谱(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers, EA-IRMS)与高温裂解元素分析-稳定同位素比值质谱仪(temperature conversion/elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers, TC/EA-IRMS)区分天然与人工合成α/β-胡萝卜素和叶黄素等δ13C、δ2H稳定同位素比值。目前,尚无方法采用稳定同位素技术对不同工艺来源番茄红素进行真假辨别的区分研究。
因此,本研究利用高温裂解元素分析-稳定同位素比值质谱仪建立了番茄红素中的氢同位素比值测定方法。实验针对番茄红素的同位素特征,建立离线前处理方法与同位素比值质谱法测定番茄红素原料样品中δ2H值,对方法进行优化和验证并应用到原料样品的测定中,初步探究天然番茄红素、发酵番茄红素和人工合成番茄红素δ2H值差异。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
番茄红素粉末状原料样品10种[天然来源的样品原料4种(均来源于新疆番茄)、微生物发酵法的样品原料4种、人工合成的样品原料2种],由番茄红素保健品厂家提供,其真实性有保障(纯度80%);天然来源(新疆番茄)的番茄红素标准品(纯度≥ 96%)、微生物发酵法的番茄红素标准品(纯度≥ 96%)、人工合成的番茄红素标准品(纯度≥ 96%),由番茄红素保健食品厂家提供,其真实性有保障。
氘代氯仿(色谱纯),上海安谱科技有限公司;乙酸乙酯(色谱纯),上海安谱科技有限公司;对苯二甲酸二甲酯(纯度99%),北京伊诺凯科技有限公司;咖啡因USGS-62[δ2HV-SMOW=(-156.1±0.2)‰]、NBS-22[δ2HV-SMOW=(-120.0±1.0)‰],购自国际原子能机构。
1.2 仪器与设备
高温裂解元素分析-稳定同位素比值质谱仪,德国Elementar公司;核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)波谱仪,德国Bruker Biospin公司;Bruker Sample Jet 5 mm高通量核磁管,德国Bruker Biospin公司;十万分之一天平,瑞士 Mettler-Toledo 公司;恒温水浴锅,北京科伟永兴仪器有限公司;EQ2200DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;旋转蒸发器RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;银囊4.5 mm×6 mm,洽诺斯科技有限公司;微量砂芯抽滤装置,普瑞奇实验室有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理方法
取粉碎后的番茄红素试样(或标准品)0.3 g,加入10 mL乙酸乙酯溶液,在水浴条件下加热至50 ℃,使溶液饱和,迅速过滤,收集滤液置于15 mL离心管中,-20 ℃条件下冷却结晶3 h。取出冷冻结晶后的样品溶液,过0.25 μm有机滤膜抽滤,收集番茄红素结晶,于真空下干燥24 h,备用。
1.3.2 仪器条件
1.3.2.1 稳定同位素仪器条件
取0.25～0.45 mg目标物于银囊测定δ2H值。设定工作程序,裂解反应炉温度1 450 ℃,柱温箱85 ℃,银囊从元素分析仪进样盘放入裂解炉,高温条件下形成的水蒸气与反应管中的玻璃化碳反应物在1 450 ℃下发生还原反应生成H2,用稳定同位素比值质谱仪测定H2中δ2H值。
1.3.2.2 核磁共振波谱仪器条件
实验采用的1H-NMR的共振频率为400.13 MHz,配备5 mm BBI探头;扫描次数为16;弛豫延迟为4 s;谱宽为20.025 4;采样点数为65 536;接收增益为16。
1.3.3 校准与计算
1.3.3.1 样品重结晶后的纯度计算
参考刘清毅等[19]的定量核磁法对目标物纯度进行计算。
1.3.3.2 δ2H值计算
稳定同位素比率计算是将已知同位素比率的标准品作为参考,计算未知样本稳定同位素比率的相对值按照公式(1)对番茄红素δ2H进行计算,结果以‰表示:
(1)
式中:X为样品中重同位素与轻同位素的丰度比,即D/H;R样品为样品中重同位素与轻同位素的丰度比;R标准为国际标准物质中重同位素与轻同位素的丰度比,δ2H值的计算基于国际标准物质,用维也纳标准平均海洋水数(Vienna standard mean ocean water,V-SMOW)表示。选择标准物质咖啡因USGS-62[δ2HV-SMOW=(-156.1±0.2)‰]与NBS-22[δ2HV-SMOW=(-120±1.0)‰]作为δ2H实际测定的参考物质。
1.4 数据处理
用Excel 2016对实验数据进行分析,Origin 2021软件作图。将核磁共振谱图导入用MestReNova 12.0软件[Mestrelab Research S.L.,MestReNova(Mnova) NMR,美国]进行纯度分析。
2 结果与分析
2.1 样品前处理后纯度分析
由于高纯度番茄红素原料样品的纯度仅为80%,采用TC/EA-IRMS仅能对样品中总氢进行分析,为防止原料中除番茄红素以外的含氢化合物影响稳定氢同位素测定。因此,本研究对番茄红素原料样品采取重结晶的方式进行提纯,按照1.3.2.2节核磁共振波谱仪条件进行纯度验证。图1-a为任意抽取的番茄红素原料样品未经过前处理的核磁共振氢谱图(纯度80%),图1-b为番茄红素样品重结晶后的核磁共振氢谱(纯度94.14%),图1-c为番茄红素标准品(纯度96%)。由图1可以看出,样品经前处理过程可以有效提纯番茄红素。以对苯二甲酸二甲酯为内标,对重结晶后的番茄红素原料样品纯度进行测定(n=3),得番茄红素原料样品纯度≥94.14%,如表1所示。PERINI等[20]在测定δ2H值时要求直接进行TC/EA-IRMS测定的特定化合物纯度大于90%。本实验样品重结晶后纯度满足要求,可以直接上机测定。
表1 重结晶后番茄红素样品纯度
Table 1 Lycopene sample purity
编号纯度/%195.02295.71394.14
a-任意抽取的番茄红素原料样品未经过前处理的核磁共振氢谱图;b-番茄红素样品重结晶后的核磁共振氢谱图;c-番茄红素标准品的核磁共振氢谱图
图1 番茄红素核磁共振氢谱图
Fig.1 1H-NMR spectrum of lycopene
2.2 样品前处理方法对氢同位素比值的影响
番茄红素原料在前处理过程中使用了乙酸乙酯用于待测组分提取富集,在富集纯化过程中有机溶剂残留会影响测定值。因此,实验验证了前处理过程对番茄红素δ2H值的影响,方法将天然番茄红素标准品(标准品1,δ2H=-254.92‰)和发酵来源番茄红素标准品(标准品2,δ2H=-106.54‰)按照1.3.1节步骤进行处理后,按1.3.2.1节上机测定,结果如表2所示。经验证,在实验的条件下,番茄红素前处理后的测定值与直接测定值δ2H值的偏差为1.37‰与0.87‰,在 TC/EA-IRMS 的测定误差范围内(0.3‰),该前处理步骤不会影响番茄红素δ2H值的准确分析。
表2 验证前处理过程对番茄红素氢稳定同位素分析的影响(n=3)
Table 2 Verification of the influence of pretreatment on the hydrogen stable isotope analysis of lycopene (n=3)
指标δ2H/‰δ2H/‰标准品1平均值标准品2平均值-255.62-107.28重结晶前的测定值-254.03-254.93-105.67-106.54-255.12-106.68-252.68-103.14重结晶后的测定值-255.30-253.56-107.02-105.67-252.70-106.84
2.3 方法的重复性
选取某发酵来源的番茄红素样品采用1.3.1节纯化样品(n=6),采用1.3.2.1节测定同位素δ2H值,结果见表3。番茄红素样品的标准偏差为2.29‰,符合方法重复性验证。
表3 方法重复性分析
Table 3 Analysis of method repeatability
编号δ2H/‰1-103.522-107.283-105.674-106.685-109.136-103.14平均值-105.90标准偏差/‰2.29
2.4 方法的再现性
选取某天然番茄红素样品,采用1.3.1节和1.3.2.1节的方法,在1 d、5 d、7 d对样品测定(n=3),结果见表4。δ2H值的标准偏差为均小于3‰,符合方法再现性分析。
表4 方法的再现性
Table 4 Analysis of method reproducibility
检测时间/dδ2H值平均值/‰标准偏差/‰1-255.802.315-253.091.087-256.502.92
2.5 方法的准确度
称取任意天然番茄红素样品原料,分别添加0%、25%、50%、75%、100%(质量分数)人工合成的番茄红素标准品(δ2H=-44.35‰),混匀后,分别按照1.3.1节的前处理方法处理后,按1.3.2节方法上机测定。在每一质量水平下,分别测定3组。结果表明,δ2H值的y=-0.473 4x-22.858(R2=0.993 1),准确度良好(图2)。
图2 方法准确度分析
Fig.2 Accuracy analysis of the method
2.6 方法应用
实验测定了3种番茄红素标准品,S1为天然来源番茄的标准品(纯度≥96%),S2为人工合成番茄红素标准品(纯度≥96%),S3为发酵来源番茄红素标准品(纯度≥96%)。T1～T4为厂家提供番茄制备番茄红素原料(80%),AR1～AR2为人工合成番茄红素原料(80%),FJ1～FJ3为淀粉发酵来源番茄红素(80%)。经测定,天然来源番茄红素稳定同位素比值为-225.76‰～-256.98‰,发酵来源的番茄红素稳定同位素比值为-81.35‰～-141.24‰,人工合成来源的番茄红素稳定同位素比值为-29.21‰～-56.22‰,如表5所示。
表5 天然来源番茄红素δ2H值测定结果(n=3)
Table 5 Results of δ2H measurement of lycopene from natural sources (n=3)
编号来源δ2H/‰S1(标准品)天然来源(新疆番茄)-253.13T1天然来源(新疆番茄)-256.98T2天然来源(新疆番茄)-231.92T3天然来源(新疆番茄)-246.80T4天然来源(新疆番茄)-225.76S2(标准品)人工合成-44.35AR1人工合成-29.21AR2人工合成-56.22S3(标准品)发酵来源-105.90FJ1发酵来源-96.98FJ2发酵来源-141.24FJ3发酵来源-115.78FJ4发酵来源-81.35
由表5和图3可知,通过δ2H值可以区分天然来源、人工合成和发酵来源番茄红素。CULP等[21]研究人工合成与天然来源的化合物δ2H值关系,天然来源化合物δ2H值始终比人工合成的氘含量更贫乏(即天然来源化合物δ2H值更加偏负,人工合成化合物δ2H值更加偏正),本实验中测定不同来源番茄红素的δ2H值差异特征与该文献报道的规律一致。天然来源的番茄红素主要从番茄中提取,本研究中测定天然来源番茄红素δ2H值为-225.76‰～-256.98‰,KROLL等[18]测定植物中类胡萝卜素(番茄红素属于类胡萝卜素)δ2H值为-180‰～-275‰,本实验结果与该研究结果相近。由于新疆经纬度跨度大,其地下水在新疆不同的地貌,稳定氢同位素特征差异明显[22],导致天然来源(新疆番茄)番茄红素之间稳定氢同位素有差异。本实验测得人工合成番茄红素δ2H值-29.21‰～-56.22‰,CAJA等[23]运用TC/EA-IRMS测定了化石产物合成的α-紫罗兰酮与β-紫罗兰酮(人工合成番茄红素前体)δ2H值为-26‰～-47‰。人工合成番茄红素通常以石化产物缩合的紫罗兰酮通过Wittig反应合成番茄红素,由于人工合成不涉及生物代谢过程,只会发生合成原料之间各元素的快速交换,因此番茄红素保留了原料的同位素特性。ZHANG等[24]研究了发酵过程中氢同位素的分馏机制和影响因素,确定了氢同位素与原料的对应关系,可根据氢的同位素特征分析发酵原料种类,证明了发酵过程会由于代谢途径、微生物多样性、底物等因素产生不同程度的同位素分馏。因此本实验中,菌株、发酵底物、工艺流程对稳定氢同位素的分布特征均存在影响,但具体的对应关系和影响程度还需进一步研究。
图3 不同来源番茄红素δ2H值分布图
Fig.3 Distribution of δ2H values of lycopene from different sources
3 结论
本文选取80%番茄红素原料作为研究对象,利用重结晶法对番茄红素原料样品进行提纯,用核磁共振技术验证其纯度大于94.14%,利用高温裂解元素分析—稳定同位素比值质谱仪建立了测定不同来源番茄红素氢稳定同位素的方法。标准品与原料遵循同等处理的原则,通过对前处理过程的优化与方法学验证,表明前处理过程未发生明显的同位素分馏,且该方法的重复性、再现性、准确性均符合要求,对结果判断无显著影响。稳定氢同位素特征可以区分天然来源、发酵来源与人工合成的番茄红素,为鉴别3种来源番茄红素原料提供技术支撑,为后续区分番茄红素保健食品提供研究基础。
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