食源性致病菌可以直接引起人们食物中毒[1],常见的食源性致病菌有致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等[2-4]。近年来,食源性致病菌所引起的食源性疾病在各个国家暴发,并造成了严重的后果[5]。因此对食源性致病菌采取一定的杀菌处理,在保障食品卫生和维护消费者安全方面,起着至关重要的作用。
食品杀菌技术可分为热杀菌技术和非热杀菌技术。常见的热杀菌技术有杀菌温度小于100 ℃的常压杀菌法,杀菌温度为100～121 ℃的加压杀菌法,杀菌温度为135～150 ℃、杀菌时间为2～8 s的超高温瞬时杀菌法等。但热杀菌会对杀菌对象造成一定程度的热损伤,尤其是对某些热敏性的维生素破坏较大。非加热杀菌则无需对物料进行加热,利用其他灭菌原理杀灭微生物,如通过破坏微生物的遗传物质造成微生物死亡的紫外杀菌法[6-7]。这能够在一定程度上更好地保留食物的成效、成分以及色香味,目前正受到越来越多科研工作者的关注。
紫外线来自于太阳辐射,紫外线杀菌的原理主要是通过一定剂量的紫外线辐射,使微生物细胞中的遗传物质相邻嘧啶分子之间形成嘧啶二聚体,从而干扰DNA或RNA的正常复制,最终造成微生物的死亡[8-9]。其中波长为200～280 nm的紫外线被称为深紫外线,由LED灯所发射出的深紫外线即LED深紫外线。LED深紫外线技术是近年开发出来的新型技术,LED深紫外灯相比于传统紫外杀菌设备汞灯,具有寿命更长、波长更集中、无需预热、无毒无害等一系列的优点[10-15]。但影响LED深紫外线杀菌效果的因素复杂[16-17],林萍等[18]发现可通过增加照射强度和减少照射距离的方式提高杀菌效果。方方等[19]发现,不同LED深紫外灯具的杀菌效果需要综合考虑波段、紫外线剂量、发光效率、应用领域以及紫外线穿透性等因素的影响。
因此探究LED深紫外灯的最佳组合方式以及对不同菌种的杀菌效果是非常有必要的。另外草莓由于果皮薄,贮藏性差,在贮藏过程中很容易受到环境的影响,导致食用与商业价值降低[20-21]。本研究发现使用LED深紫外线杀菌可以减少对草莓品质的损伤,同时延长贮藏期,为紫外杀菌技术在食品领域中的应用提供方案和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌取自江南大学食品学院生物技术中心微生物实验室;草莓购自江苏无锡翠娟草莓园;酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂、乙醇,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
深紫外LED灯珠(发光角度120°、辐射功率6 mW、波长275 nm)、恒压直流电源,安徽毅昌科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 LED深紫外灯数目与位置对杀菌率影响的测定
取一个长宽高为18 cm×16 cm×16 cm的密闭容器,在密闭容器的顶部与底部贴入反光板,以增强紫外光的反射作用。控制深紫外LED照射时间为15 s,以紫外灯数目和紫外灯位置为变量设计6种不同深紫外灯组合(图1):正上方LED灯数目为1;正上方LED灯数目为2(2个灯间距8.6 cm);正上方LED灯数目为3(3个灯呈正三角形,边长为9 cm);侧方LED灯数目为1(侧面灯距离底面直线距离6 cm);侧方LED灯数目为2(分别位于2个侧面);侧方LED灯数目为3(分别位于3个侧面)。将待灭菌的大肠杆菌平板放置于中心线的位置,分别用6种不同的LED深紫外灯组合对6个小组进行杀菌,杀菌后盖上皿盖,置于37 ℃下避光培养18 h。
图1 六种不同的LED深紫外灯组合
Fig.1 Six different LED deep ultraviolet lamp combinations
1.3.2 LED深紫外灯照射时间对3种致病菌杀菌率影响的测定
在LED深紫外灯杀菌设备中分别对染大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的平板进行不同时长的深紫外杀菌处理。处理后立即盖上皿盖,置于37 ℃下避光培养18 h。其中对大肠杆菌的紫外照射时间分别为0、5、10、15、20 s,铜绿假单胞菌紫外照射时间分别为0、10、20、30、40 s,金黄色葡萄球菌紫外照射时间分别为0 s、15 s、30 s、1 min、2 min。每次操作结束分别对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌进行计数并拍照。
1.3.3 LED深紫外线照射处理草莓
选取表面红色均匀,无病虫害,无机械伤口、大小与成熟度相对一致的草莓果实,随机分为5组。在LED深紫外线杀菌设备中分别照射0、1、3、5、10 min。处理结束后,从每组里选取6个草莓放入塑料盒中(11 cm×9 cm×6.5 cm)分装,将塑料盒置于常温阴凉处避光放置,每隔12 h或24 h测量所需的果实指标。每组其余的草莓用无菌均质袋单个密封包装,放入4 ℃的冰箱中贮藏,每隔1 d观察并记录草莓感官状态,以探究LED深紫外线处理与密封冷藏对草莓保鲜的效果。
1.3.4 果实坏果率的测定
果实坏果率的计算如公式(1)所示:
坏果率
(1)
1.3.5 果实腐败指数的测定
果实腐烂情况是衡量果实新鲜程度的重要指标,果实腐烂的判断依据为草莓果实表面是否出现了水渍状病斑。草莓果实按照果实腐败的面积可分为0级、1级、2级、3级,腐败面积逐渐增加。其中0级无腐烂现象发生;1级果实里有1～3个小的腐烂斑点即腐烂面积小于25%;2级果实腐烂面积为25%～50%;3级腐烂面积大于果实面积的50%。腐烂指数的计算如公式(2)所示[22]:
腐烂指数
(2)
1.3.6 果实失重率的测定
果实贮藏过程失重率的计算如公式(3)所示:
失重率
(3)
2 结果与分析
2.1 LED深紫外灯数目与位置对大肠杆菌杀菌率的影响
通过调整LED深紫外灯的数目与位置研究其对大肠杆菌的杀菌率,具体如图1所示,分别为正上方一灯、正上方两灯、正上方三灯、侧方一灯、侧方两灯与侧方三灯。其中的反光板可增加深紫外线强度并扩大紫外线照射范围。以大肠杆菌为试验对象,控制LED深紫外灯杀菌时间为15 s,用6种不同的LED深紫外灯组合对一定浓度的大肠杆菌进行深紫外线照射,试验结果如图2所示。
图2 不同数目与位置的LED深紫外灯对大肠杆菌照射15 s的试验结果
Fig.2 Experimental results of E.coli exposure to different numbers and positions of LED deep ultraviolet lamps for 15 s
比较LED深紫外灯数目与位置对大肠杆菌杀菌率的影响(表1)发现,随着染菌平板正上方的LED灯数目从1逐个增加到3时,大肠杆菌杀菌率上升,分别为(51.76±0.87)%、(70.93±2.93)%、(79.83±0.86)%。与正上方类似,随着染菌平板侧方的LED深紫外灯数目从1逐个增加到3时,大肠杆菌杀菌率分别为(65.79±0.07)%、(85.10±0.89)%、(91.26±0.85)%。
表1 不同LED深紫外灯数目与位置对大肠杆菌的杀菌率 单位:%
Table 1 Bactericidal rate of E.coli by different numbers and positions of LED deep ultraviolet lamps
位置LED灯数目123正上方51.76±0.8770.93±2.9379.81±0.86侧方 65.79±0.0785.10±0.8991.26±0.85
由表1可见,大肠杆菌杀菌率随LED深紫外灯灯数增加,上升幅度减小且减小程度较为明显,说明无论是在正上方还是侧方,当LED深紫外灯数目为3个时,进一步增加灯数对大肠杆菌的杀菌效果提升有限。因此设计正上方与侧方各有3个灯的LED深紫外灯组合以提高杀菌率(图3),试验发现用此设备对大肠杆菌照射15 s,杀菌率可大幅提高至(99.18±0.82)%。这表明LED深紫外的杀菌效果与紫外强度和照射方向相关,这种组合方式增加了深紫外照射的覆盖面,故采用正上方与侧方各有3个灯的LED深紫外灯组合对大肠杆菌具有最好的杀菌效果。
图3 正上方与侧方各有3个灯的LED深紫外灯组合
Fig.3 LED deep ultraviolet lamp combination with three lights on the top and side
2.2 LED深紫外灯照射时间对细菌杀菌率的影响
采用正上方与侧方各有3个灯的LED深紫外灯组合,对一定浓度的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌进行不同时间的深紫外线照射处理,试验结果如图4所示。
A-大肠杆菌;B-铜绿假单胞菌;C-金黄色葡萄球菌
图4 LED深紫外灯对3株菌照射不同时间的试验结果
Fig.4 Experimental results of three strains of bacteria exposed to LED deep ultraviolet lamp for different time
比较不同LED深紫外灯照射时间下大肠杆菌死亡率发现(表2),利用该LED深紫外杀菌设备对大肠杆菌照射5、10、15 s,大肠杆菌的杀菌率逐渐上升,分别为(89.06±0.46)%、(96.08±1.08)%、(99.18±0.82)%,当LED深紫外灯照射时间为20 s时,即可将大肠杆菌全部杀灭。对于铜绿假单胞菌在照射10、20、30 s后,铜绿假单胞菌的杀菌率逐渐上升,分别为(64.56±2.42)%、(91.11±1.84)%、(97.89±0.22)%,当LED深紫外线照射时间为40 s时,即可将铜绿假单胞菌全部杀灭(表3)。对于金黄色葡萄球菌,照射15、30、60 s后的死亡率逐渐上升,分别为(24.14±1.30)%、(45.84±0.67)%、(89.16±2.50)%,当LED深紫外灯照射时间为120 s时可将金黄色葡萄球菌全部杀灭(表4)。由此可见,大肠杆菌和铜绿假单胞菌对LED深紫外线敏感性要优于金黄色葡萄球菌。
表2 不同LED深紫外灯照射时间下大肠杆菌的杀菌率
Table 2 Bactericidal rate of E.coli under different LED deep ultraviolet lamp irradiation time
照射时间/s5101520杀菌率/%89.06±0.4696.08±1.0899.18±0.82100.00
表3 不同LED深紫外灯照射时间下铜绿假单胞菌的杀菌率
Table 3 Bactericidal rate of P.aeruginosa under different LED deep ultraviolet lamp irradiation time
照射时间/s10203040杀菌率/%64.56±2.4291.11±1.8497.89±0.22100.00
表4 不同LED深紫外灯照射时间下金黄色葡萄球菌的杀菌率
Table 4 Bactericidal rate of S.aureus under different LED deep ultraviolet lamp irradiation time
照射时间/s153060120杀菌率/%24.14±1.3045.84±0.6789.16±2.50100.00
总体来说,随着LED深紫外灯照射时间的延长,大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌的杀菌率均逐渐升高。其中对LED深紫外线的敏感性:大肠杆菌>铜绿假单胞菌>金黄色葡萄球菌。大肠杆菌与铜绿假单胞菌同为革兰氏阴性菌,其对LED深紫外线敏感度差别并不大。而作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌,对LED深紫外线敏感性要明显弱于另外2株革兰氏阴性菌,这也与一些研究者们的观点相符[16,23],这可能是由于革兰氏阳性菌与阴性菌的细胞壁结构和组成不同,从而导致它们对外界环境的抵抗能力不同。另外可能也与细菌的形状大小有关,金黄色葡萄球菌为较小尺寸的球状菌,而大肠杆菌和铜绿假单胞菌为较大一点的杆状菌,因此金黄色葡萄球菌在相同时间内接触的紫外线量可能不及其他2株菌。试验发现,利用正上方与侧方各有3个灯的LED深紫外灯组合只需2 min即可将大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌杀灭,这比已知的相同功率的汞灯具有更好的杀菌效果,因此在食源性致病菌的杀菌处理方面具有很好的应用前景。
2.3 常温贮藏下LED深紫外线处理对草莓保鲜的效果
2.3.1 草莓果实腐败程度的测定结果及分析
坏果率与腐烂指数是衡量草莓果实腐败程度的重要指标,草莓在常温下贮藏极易发生病变。分别在24、48、60 h,对不同时长LED深紫外线照射的草莓的坏果率与腐烂指数进行调查统计,结果如图5、图6所示。无论是照射组还是对照组,草莓坏果率与腐烂指数均随着贮藏时间的延长而增加。在常温下贮藏24 h时,所有组均有草莓发生了腐败,对照组的坏果率与腐烂指数分别为71.43%与42.85%,而LED深紫外线处理5 min的照射组的坏果率与腐烂指数分别为42.85%与21.43%,显著低于对照组。此外,所有LED深紫外线照射组的腐烂指数和坏果率均小于对照组,LED深紫外线处理5 min对草莓的保鲜效果最好,其坏果率与腐烂指数分别为71.43%,33.33%。在48 h后,草莓的腐败速度加快,在60 h时,所有草莓果实均产生了腐败,且照射组与对照组的腐烂指数的差别不再明显。
图5 LED深紫外灯照射时间对草莓贮藏期间坏果率的影响
Fig.5 Effect of LED deep ultraviolet lamp irradiation time on the bad fruit rate of strawberry during storage
图6 LED深紫外灯照射时间对草莓贮藏期间果实腐败指数的影响
Fig.6 Effect of LED deep ultraviolet lamp irradiation time on fruit decay index of strawberry during storage
总之,适当的LED深紫外线处理对抑制草莓的腐败具有一定的效果,其原因一方面可能是深紫外线照射直接抑制了草莓病原菌的生长,另一方面,适当的深紫外线处理可能激活了草莓果实的防御反应[24],从而减小病原菌在草莓上的繁殖。此外,试验结果表明并不是LED深紫外线处理时间越长,对草莓的保鲜效果越好。LED深紫外线处理10 min的照射组的坏果率与腐烂指数均大于同一时间处理5 min的照射组。由于在试验过程中,LED深紫外线处理10 min的照射组出现一定的表面出汁现象,推测可能是过高的深紫外线处理对草莓果实外层的细胞产生了一定程度的损伤,加速了草莓表面的破损,最终导致腐烂程度上升[23,25]。
2.3.2 草莓果实失重率的测定结果及分析
对草莓果实进行不同时长的LED深紫外照射处理,每隔12 h记录果实的失重率如图7所示,草莓实际情况如图8。无论是照射组还是对照组,草莓失重率均随着贮藏时间的延长而增加。在前期(0～24 h)照射组的失重率均小于对照组,在同样的贮藏时间内,随着LED深紫外线照射时间的延长,失重率逐渐下降。在36 h与48 h时,仅LED深紫外线处理5 min的照射组失重率小于对照组;LED深紫外线处理1 min与3 min的照射组失重率与对照组差别不再明显;LED深紫外线处理10 min的照射组失重率反而高于对照组(分别平均比对照组高1.21%,1.03%)。这可能是过高的深紫外线处理破坏了草莓表面,导致果实汁液流失,从而增加了失重率。总体来说,适当剂量的LED深紫外线处理能有效抑制草莓果实水分的流失,降低失重率。
图7 LED深紫外线照射时间对草莓贮藏期间果实失重率的影响
Fig.7 Effect of LED deep ultraviolet irradiation time on weight loss rate of strawberry during storage
A-对照组;B-1 min;C-3 min;D-5 min;E-10 min
图8 贮藏时间为48 h时,不同时长LED深紫外线处理过后的草莓
Fig.8 Strawberries after long LED deep ultraviolet treatment at different time when stored for 48 h
2.4 密封冷藏下LED深紫外线处理对草莓保鲜的效果
经不同时长LED深紫外线处理的草莓用无菌均质袋单个密闭包装,放入4 ℃左右贮藏,每隔1 d观察并记录草莓感官状态,贮藏18 d后取出。试验发现对照组在第10天即发生腐败。在贮藏18 d时(图9),对照组表面长满了大量的白色毛霉并存在着一定程度的出水;经LED深紫外线处理1 min的草莓表面也出现了较明显的出水与长霉现象;经LED深紫外线处理3 min与5 min的草莓仍可以保持较好的感官性质,果实有光泽,色泽鲜艳,且有些许草莓特有的清香;经LED深紫外处理10 min的草莓表面出现了较严重的失水现象,并在根部附近长出了少量的白色毛霉。这说明适度的LED深紫外线处理与密封冷藏可大大延长草莓的保质期,二者对草莓的保鲜具有协同作用。
图9 在4 ℃下密封贮藏18 d时,不同时长LED深紫外线处理后的草莓
Fig.9 Strawberries after LED deep ultraviolet treatment at different time when sealed stored at 4 ℃ for 18 days
3 结论
本试验通过获得合适的LED深紫外灯组合,探索深紫外线照射时间对不同致病菌杀菌率的影响以及深紫外线照射对草莓保鲜的效果。随着染菌平板正上方或侧方的LED深紫外灯数目增加,对大肠杆菌的杀菌率上升。当染菌平板正上方与侧方各有3个LED深紫外灯时,杀菌效果最好。在一定范围内,随着LED深紫外线照射时间的延长,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的死亡率上升。这些结果表明深紫外的杀菌效率与照射强度、照射方向以及照射时长相关。同时大肠杆菌具有对LED深紫外线最高的敏感性,其次是铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。研究发现草莓在进行适当时长的LED深紫外线处理后,能够降低常温贮藏下的坏果率、腐烂指数、失重率并增加其感官评分,具有良好的应用价值。但同时需要避免过强过长的深紫外线照射破坏草莓表面的情况。另外,适度的LED深紫外线处理与密封冷藏可大大延长草莓的保质期,二者对草莓保鲜具有协同作用。
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