近年来随着人们环保意识的增强以及出于对食品质量安全的考虑,安全无毒且可生物降解的食品包装材料越来越受到关注[1]。胶原蛋白是动物体内含量最多的蛋白质,约占总蛋白质含量的1/3,主要存在于皮肤、肌腱及骨骼等部位中[2]。目前商业化生产的胶原蛋白肽大多是可溶性胶原蛋白肽,它们是通过酶解动物皮肤或骨骼的方法得到,具有优良的胶体保护性、表面活性、成膜性和稳定性[3]。胶原蛋白肽可在特定条件下进行体内自组装,形成有序且结构稳定的胶原蛋白纤维网络结构,极大提高热稳定性和机械性能,因此可广泛应用于生物材料、成膜基质和缓释制剂中[4]。但是,胶原蛋白肽成膜后机械性能、抑菌效果较差,且对湿度敏感。为改善这些缺点,常用化学、物理、酶法等方法对胶原蛋白进行改性处理,或加入其他高分子聚合物(如蛋白质、多糖、淀粉、纤维素等)来提高其复合材料性能[5-6]。

纤维素来源广泛,是自然界中最易获取的天然高分子[7]。纤维素通过化学、物理、生物手段处理可得到直径小于100 nm,长度可到微米的纳米纤维素(cellulose nanocrystals,CNC)[8]。由于其优异的特性,如丰度、高纵横比、更好的机械性能、可再生性和生物相容性,可作为增强复合材料应用到药物载体、纸浆造纸、包装等领域[9-10]。刘忠明等[11]将CNC添加到壳聚糖膜中,当复合膜中CNC质量分数为5%时,纳米纤维素-壳聚糖(CNC-chitosan,CNC-CS)的拉伸强度比纯CS膜提高了30%,CNC-CS的透湿量比纯CS膜降低了24%。然而,CNC并不具有抑菌性,为了解决这一问题,通常会在CNC复合材料中加入具有广谱效力、耐热性和耐久性等优点的无机抗菌剂[12]。纳米银(Ag NPs)是天然无机抗菌剂,对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都有较好的抑制作用,但Ag NPs制备时易发生团聚,降低其抑菌活性[13]。通常将Ag NPs负载到CNC上,降低团聚,可实现持久稳定抑菌[14]。

然而,以载银纳米纤维素(Ag/CNC)强化自组装胶原蛋白复合膜罕有报道。本研究以胶原蛋白肽为基材,Ag NPs为抑菌剂,CNC为增强剂,旨在制备一种新型的纳米复合膜,为牛皮胶原蛋白肽的利用提供一种新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛皮胶原蛋白肽,广州东姿生物科技有限公司;微晶纤维素、过硫酸铵、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸,上海源叶生物科技有限公司;AgNO3,国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

PHS-3C电子分析天平,沃特世有限公司;CMT-8102微机控制电子万能试验机,深圳市新三思材料检测有限公司;JSM-7800F扫描电子显微镜,日本电子株式会社捷欧陆科技有限公司;FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪,天津港东科技发展股份有限公司;ULTIMA IV X射线衍射仪,日本理学公司。

1.3 Ag/CNC的制备

1.3.1 CNC制备

参考WANG等[15]的方法略作修改,称取5.00 g的微晶纤维素,按1∶100加入现配的1.0 mol/L过硫酸铵溶液,在室温放置3 h,然后在70 ℃水浴条件下持续搅拌反应14 h;待溶液冷却,将溶液在6 000 r/min下离心10 min,重复离心洗涤直至上清液开始泛蓝光,收集上清液并将悬浮液倒入透析袋(12 000～14 000)中,在去离子水中放置6 d,直至内外pH值保持不变。取出悬浮液超声30 min,制得分散均匀稳定的泛蓝光CNC悬浮液。将一部分CNC悬浮液浓缩备用,另一部分冻干储存于干燥器中用以后续的检测表征。

1.3.2 Ag/CNC的制备

参考樊丽[16]的方法并略作修改,称取一定量的AgNO3,溶于蒸馏水中,制得0.1 mol/L的AgNO3水溶液,避光保存备用。向50.00 mL 1.0%(质量分数)的CNC悬浮液中加入0.30 g聚乙烯吡咯烷酮,加入NaOH溶液,调整溶液的pH值至8.0,加入3.00 g的抗坏血酸,迅速升温至80 ℃,在转速为250 r/min条件下滴加定量的AgNO3溶液,继续反应3 h,得到含银CNC溶液。

1.3.3 紫外可见光谱分析

参考YU等[17]的方法略做修改,量取2 mL的悬浮液于小试管用20 mL去离子水稀释至一定浓度,将该溶液放在超声波装置中超声30 min,之后量取一定分散后的溶液和纯水空白组置于石英比色皿中,紫外扫描波长范围200～800 nm。

1.3.4 透射电子显微镜分析

参考DONG等[18]的方法并略作修改,将Ag/CNC悬浮液分散于无水乙醇中并进行超声处理,吸取一滴Ag/CNC悬浮液涂在铜网上并让水蒸发,制备Ag/CNC的透射电子显微镜样品。在80 kV的电压运行下进行观察。

1.4 复合膜的制备

1.4.1 制膜工艺流程

称取6 g牛皮胶原蛋白肽溶于30 mL水中,向其中加入一定量的NaCl,调节溶液pH值。在一定温度下水浴加热1 h,再加入一定量的CNC和25%(以牛皮胶原蛋白肽质量计)的甘油,搅拌加热0.5 h。将膜液静置消泡后流延于PE塑料平板中(13 cm×13 cm),置于45 ℃电热恒温培养箱中干燥24 h,揭膜,存放于干燥器中。

1.4.2 单因素试验

设置反应NaCl添加量为5%(以牛皮胶原蛋白肽质量计,下同),溶液pH值为7,水浴温度40 ℃,CNC添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%;设置CNC添加量为3%,溶液pH值为7,水浴温度40 ℃,NaCl添加量分别为1%、3%、5%、7%、9%;设置NaCl添加量为5%,水浴温度40 ℃,CNC添加量为5%,溶液pH值分别为5、6、7、8、9;设置NaCl添加量为5%,CNC添加量为5%,溶液pH值为7,水浴温度分别为20、30、40、50、60 ℃。

1.4.3 响应面试验

使用Design-Expert.12 进行响应面试验设计,探究pH、反应温度、CNC和NaCl的添加量对CNC-胶原蛋白复合膜拉伸强度的影响。

1.5 复合膜性能测定

1.5.1 机械性能

参考GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的测定第1部分:总则》和GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分:薄膜和薄片的试验条件》。将所有待测复合膜裁剪成150 mm×20 mm,测试参数:实际测量长度70 mm,测试速率200 mm/min。拉伸强度计算如公式(1)所示,断裂伸长率如公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:T,拉伸强度,MPa;F,样品膜断裂时的负荷,N;h,样品膜厚度,mm;b,样品膜宽度,mm;E,断裂伸长率,%;L1,样品膜测量初始标距,mm;L2,样品膜断裂时的标距,mm。

1.5.2 不透明度

参照SOLTANI等[19]方法。将所有待测复合膜裁剪成100 mm×40 mm,测试参数:Abs=600。不透明度的计算如公式(3)所示:

样品膜不透明度

(3)

式中:Abs600,样品膜在600 nm处的吸光度;d,样品膜的厚度,mm。

1.5.3 水蒸气透过系数

参考GB/T 1037—2021《塑料薄膜与薄片水蒸气透过性能测定 杯式增重与减重法》并稍作修改。在室温下,将样品膜覆盖在装有20 mL蒸馏水的锥形瓶上,置于干燥器中,每3 h称重1次,直到相邻测量之间的质量差不超过5%。样品膜的水蒸气透过系数的计算如公式(4)所示:

样品膜水蒸气透过系数

(4)

式中:Δm,锥形瓶前后质量变化,g;d,样品膜厚度,mm;A,样品膜面积,m2;Δt,时间间隔,h;Δp,样品膜两侧水蒸气气压差,2.915 kPa,25 ℃。

1.6 复合膜结构表征

1.6.1 傅立叶变换红外光谱分析

参考ZHANG等[20]的方法并略有改进,测定参数:波段范围400～4 000 cm-1,分辨率2 cm-1。

1.6.2 扫描电镜分析

参考赵喜亚等[21]的方法,测定参数:喷金时间30 s,平面放大倍数×2 000,截面放大倍数×200。

1.6.3 X-射线衍射分析

参考张昊等[22]的方法。将所有待测复合膜裁剪成20 mm×20 mm,测试参数:铜靶,扫描速度为5 °/min,扫描范围5～90 °,管内电流为40 mA,管内压力为40 kV。

1.7 数据分析

利用Origin 2018、Design-Expert 12、SPSS进行数据处理,使用方差分析(ANOVA)对结果进行显著性分析,试验数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 Ag/CNC性能表征

2.1.1 Ag/CNC紫外光谱分析

图1为Ag/CNC中Ag NPs粒子理论质量占CNC不同质量分数的紫外光谱图。Ag NPs粒子在420 nm左右有一特征吸收峰,由图1可知,当m(Ag)/m(CNC)=2%,吸收峰强度较低,且半峰宽较宽,表明CNC表面吸附的银纳米粒子较少,且粒径分布较广。当m(Ag)/m(CNC)=6%,吸收峰最大吸收波长位于404 nm,发生明显蓝移,且半峰宽变窄,表明Ag NPs粒子粒径减小,且粒径分布更为集中。因为对于金属胶体,其特征吸收峰半峰宽越窄,说明粒子粒径分布范围越小。当m(Ag)/m(CNC)=8%,吸收峰最大吸收波长位于446 nm,发生明显红移,且半峰宽变宽,说明Ag NPs粒子发生团聚,使粒径增大[23]。

2.1.2 Ag/CNC透射电镜分析

由图2-a可知,所制备CNC粒径大概在100～200 nm,呈短棒状。m(Ag)/m(CNC)=4%,Ag NPs粒子直径在15～50 nm,且分布不均匀。m(Ag)/m(CNC)=6%,Ag NPs粒子直径在25 nm左右,且粒径分布均匀。m(Ag)/m(CNC)=8%,Ag NPs粒子发生一定团聚,直径在50～100 nm,且分布不均匀。这与紫外光谱研究结果相一致。

2.2 单因素试验

2.2.1 CNC添加量

由图3可知,当CNC添加量为3%时,复合膜拉伸强度最大,为11.97 MPa,断裂伸长率为68.58%。随CNC添加量持续增大,拉伸强度开始降低。这可能是因为CNC与胶原蛋白发生相互作用从而增强整体的网络结构,但过多的加入并不能持续增强膜的拉伸强度,可能归因于CNC的团聚产生了应力集中点[24]。综上,选择CNC添加量为3%。

2.2.2 NaCl添加量

由图4可知,当NaCl添加量为5%时,复合膜拉伸强度最大,为11.98 MPa,断裂伸长率为68.76%。随NaCl添加量的持续增大,拉伸强度开始降低。这可能是因为适量Na+强度在胶原蛋白肽自组装过程中起到屏蔽电荷作用,使得胶原蛋白肽自组装结合成为紧密的纤维,但过度的Na+加入会入引入了静电斥力,静电斥力阻隔了胶原蛋白肽分子之间进一步谛合,从而形成较为松散的胶原蛋白肽凝胶结构,因此复合膜机械性能降低[25]。综上,选择NaCl添加量为5%。

2.2.3 溶液pH

由图5可知,当溶液pH值为7时,复合膜拉伸强度最大,为11.85 MPa,断裂伸长率为67.98%。表明过酸或过碱的条件下都不利于牛皮胶原蛋白肽自组装的进行,说明牛皮胶原蛋白肽的等电点在7左右,由于胶原蛋白肽在等电点附近所带电荷趋向于零,使得胶原分子端肽的电荷达到最大程度的屏蔽,胶原肽分子之间的排斥力最弱,更容易使牛皮胶原蛋白肽发生自组装[26],因此复合膜机械性能最佳。综上,选择溶液pH值为7。

2.2.4 温度

由图6可知,当温度为40 ℃时,复合膜拉伸强度最大,为12.28 MPa,断裂伸长率为68.02%。然而,随后复合膜的机械强度随处理温度的提高反而降低。这可能是因为适宜的温度条件可以增强胶原肽分子的运动能力,使其突破水合层,有助于纤维间氢键、二硫键等次级结构的进一步形成,提高组装效率的同时,还能提高结构的紧密性,而温度过低不利于与胶原组装体的形成,过高的温度则会使纤维崩解,因此复合膜机械性能降低[27]。综上,选择处理温度为40 ℃。

2.3 响应面试验

2.3.1 试验结果

依据单因素试验结果,选取各因素合适水平进行响应面试验,结果如表1和表2所示。

对模型进行方差分析及显著性检验,结果如表3所示,回归模型P<0.000 1,表明模型差异极显著;失拟项P=0.076 1>0.05,表明失拟不显著。本试验模型的决定系数R2=0.985 6,说明该模型与实际试验拟合程度较好,因此该模型能够很好地对响应值进行分析和预测。回归方程为:Y=12.04+1.37A+0.78B+0.60C+0.50D-0.38AB-0.27AC-0.48AD-0.11BC-0.60BD-0.32CD-1.82A2-1.65B2-2.02C2-1.05D2。由表3可知,各因素对拉伸强度影响主次顺序为:CNC添加量>NaCl添加量>pH>加热温度。回归方程各项显著性表明,一次项A、B、C、D,交互项AD、BD,二次项A2、B2、C2、D2对复合膜拉伸强度影响极显著(P<0.01);交互项AB对复合膜的拉伸强度影响显著(P<0.05)。试验预测结果:CNC添加量3.34%、NaCl添加量5.35%、pH为7.12、温度40.96 ℃时,复合膜拉伸强度为12.40 MPa。

各因素三维响应曲面图如图7所示。由图7-a、图7-c和图7-e可知,CNC添加量与NaCl添加量、CNC添加量与温度、NaCl添加量与温度的三维响应曲面坡度陡峭,且等高线分布呈椭圆形,表示CNC添加量、NaCl添加量和温度两两交互作用显著(P<0.05)。而图7-b、图7-d和图7-f中,等高线椭圆形不明显,表明pH与CNC添加量、NaCl添加量和温度有一定交互作用,但交互作用不显著(P>0.05)。

2.3.2 验证试验

按试验预测结果制备CNC-胶原蛋白肽复合膜,实际试验按CNC添加量3.5%、NaCl添加量5.5%、pH值为7.1、加热温度41 ℃操作,重复3次操作。测得复合膜的拉伸强度为(12.25±1.43) MPa,与12.40 MPa基本相似。

2.4 Ag NPs对CNC胶原蛋白膜物理性质的影响

如表4所示,复合膜拉伸强度随Ag NPs含量增多,呈先上升后下降的趋势。这是因为Ag NPs不断填补复合膜间隙,使膜质地更加紧密,从而拉伸强度增大,但过多Ag NPs会发生团聚,在复合膜中形成应力集中点,容易使膜断裂,拉伸强度降低。不透明度随Ag NPs含量增多而增大,水蒸气透过系数随Ag NPs含量增多而减小,这是因为CNC与Ag NPs填充了胶原纤维间隙,使复合膜结构更加紧密,从而影响光与水蒸气通过,造成不透明度增大,水蒸气透过系数减小[28]。

2.5 复合膜红外光谱分析

如图8所示,CNC在3 334.32 cm-1和1 054.38 cm-1处有O—H和C—O伸缩振动产生的特征吸收峰。胶原蛋白膜有5个特征吸收峰,3 270.68 cm-1处为酰胺A的N—H和O—H伸缩振动,2 920.66 cm-1和2 875.26 cm-1处为酰胺B的CH2不对称伸缩振动和CH2对称伸缩振动,1 632.99 cm-1处为酰胺I的CO伸缩振动,1 536.50 cm-1处为酰胺II的N—H弯曲振动、C—H伸缩振动,1 241.54 cm-1处为酰胺III的C—N伸缩振动[29]。当添加CNC后,胶原蛋白肽膜对应吸收峰波数转移至3 272.12、2 925.96、2 879.68、1 632.44、1 536.50、1 241.93 cm-1处,这些峰发生位移可能是因为CNC的羟基和胶原纤维的羧基发生强烈的反应,生成氢键使伸缩振动谱带强度加强。而不同Ag NPs含量复合膜吸收峰位置没发生位移,说明Ag NPs未与官能团发生反应。

2.6 复合膜扫描电镜分析

由图9-a～图9-f可知,胶原蛋白肽膜表面光滑平整,加入CNC后膜变粗糙,而随Ag NPs添加量的增多,复合膜表面出现小白点,即为Ag NPs,m(Ag)/m(CNC)=8%时,复合膜表面出现不均匀白点,可能是团聚的Ag NPs。由图9-A～图9-F可知,胶原蛋白肽膜断面致密光滑,而随CNC的加入,也变得粗糙。随Ag NPs添加量的增大,断面越来越不平整,出现斑点状痕迹,可能是因为Ag/CNC上负载的Ag NPs过多,造成团聚,在膜中出现应力集中点。这也是造成拉伸强度降低的原因。

2.7 复合膜X射线衍射分析

如图10所示,CNC的特征衍射峰在2θ=15.3°、22.6°、34.6°处,分别对应纤维素(101)、(002)、(040)晶面的衍射峰,图中还显示Ag/CNC在2θ=38.1°、44.3°、64.5°、78.5°、81.5°处有5个明显的衍射峰,这与JCPDS卡编号04-0783上数值描述相符,其分别对应Ag(111)、Ag(200)、Ag(220)、Ag(311)和Ag(222)晶面的衍射峰[30]。Ag-CNC曲线Ag NPs衍射峰尖锐,表明Ag NPs的结晶度较好。而与胶原蛋白肽混合后,m(Ag)/m(CNC)=2%的复合膜未出现Ag NPs的特征衍射峰,可能是Ag NPs添加量太低所导致,而m(Ag)/m(CNC)=8%的复合膜在2θ=38.1°、44.1°、64.5°、77.5°处有较弱的Ag NPs衍射峰,表明复合膜中含有Ag NPs。

3 结论

本试验研究了CNC添加量,NaCl添加量,pH,反应温度对CNC-胶原蛋白肽复合膜机械性能的影响,并探讨了CNC中Ag NPs的含量对Ag/CNC-胶原蛋白肽复合膜性能的影响。结果表明:CNC-胶原蛋白肽复合膜的最佳制备工艺为CNC添加量3.34%、NaCl添加量5.35%、pH 7.1、加热温度41 ℃,在此条件下复合膜拉伸强度为12.25 MPa。通过对Ag/CNC-胶原蛋白肽复合膜物理性质测定,当m(Ag)/m(CNC)=6%时,复合膜拉伸强度达到最大值18.17 MPa,断裂伸长率为46.62%,不透明度为21.37%,水蒸气透过系数为0.55 g·mm/(m2·h·kPa)。红外光谱结果表明,CNC与胶原蛋白肽之间存在氢键,这可能是改善膜性能的原因之一,而随Ag NPs添加量增多,红外光谱图基本没有变化,说明Ag NPs不与官能团发生反应。扫描电镜结果表明,随CNC的加入,复合膜变粗糙,而随Ag NPs添加量的增多,复合膜表面出现白色点状Ag NPs颗粒。X射线衍射结果表明,复合膜X射线衍射图谱中有Ag NPs衍射峰,证明复合膜中含有Ag NPs。综上,Ag/CNC能有效改善胶原蛋白肽膜的综合性能。这对于评估Ag/CNC-胶原蛋白肽复合膜在食品包装领域的适用性十分重要。

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Preparation and characterisation of silver-loaded nanocellulose-collagen peptide composite films

SUN Baolong, LI Caiyun, ZHANG Yubin*, ZHANG Li

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

ABSTRACT To develop a composite membrane with bacteriostatic effect and biodegradable,in this experiment, a silver-loaded nanocellulose prepared by ammonium sulfate hydrolysis of microcrystalline cellulose was added to silver nitrate solution as a reinforcement, and silver-loaded nanocellulose as a reinforcing agent with collagen peptide as the substrate, and a silver-loaded nanocellulose-collagen peptide composite membrane with good comprehensive performance was prepared.Response surface methodology was used to optimise the effects of different nanocellulose additions, sodium chloride additions, pH and reaction temperature on the mechanical properties of nanocellulose-collagen peptide composite membranes.Physical parameters such as tensile strength of composite films with different silver nanoparticles content were determined and their structures were characterised by Fourier infrared spectroscopy analysis and scanning electron microscopy.Results showed that the tensile strength of the resulting composite film was 12.25 MPa when nanocellulose was added at 3.34% (mass fraction), sodium chloride was added at 5.35% (mass fraction), pH was 7.1, and the heating temperature was 41 ℃.When the theoretical mass of nanosilver accounted for 6% of the mass of nanocellulose, the tensile strength of the composite film was 18.17 MPa, which increased the tensile strength by 64.28% compared with that of nanocellulose-collagen peptide composite film, and at the same time, the elongation at break decreased by 31.58%, the opacity increased by 95.15%, and the water vapour transmission coefficient decreased by 40.86 %.In conclusion, silver-loaded 6% nanocellulose can effectively enhance the comprehensive performance of silver-loaded nanocellulose-collagen peptide composite membrane.

Key words bovine collagen peptide;silver nanoparticles;nanocellulose;silver-loaded nanocellulose;biodegradable membranes

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038323

引用格式：孙保龙,李彩云,张玉斌,等.载银纳米纤维素-胶原蛋白肽复合膜的制备及性能表征[J].食品与发酵工业,2024,50(23):114-122.SUN Baolong, LI Caiyun, ZHANG Yubin, et al.Preparation and characterisation of silver-loaded nanocellulose-collagen peptide composite films[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(23):114-122.

第一作者：硕士研究生(张玉斌教授为通信作者,E-mail:zhangyb@gsau.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(32360610);国家现代农业(肉牛牦牛)产业技术体系建设专项(CARS-37);国家“十四五”重点研发计划课题子项目(2021YFD2100503-2-2)

收稿日期：2023-12-20,改回日期：2024-02-05