鸽蛋是我国传统滋补佳品,具有益气补血、补肝壮肾、清热解毒等多种生理功效,鸽蛋销量逐年升高[1],但关于鸽蛋中功能性蛋白质的开发研究较少。卵转铁蛋白(ovotransferrin,OVT)是鸽蛋清中主要蛋白质之一,分子质量范围在78 k～80 kDa,属于转铁蛋白家族。OVT可通过结合Fe3+,控制细胞内铁的摄入量,调节铁离子平衡,同时具有抗菌、抗氧化性、抗病毒活性及增强机体免疫力等多种生物学特性[2]。IBRAHIM等[3]发现,OVT结合Fe3+、Cu2+、Zn2+等金属离子后,抗氧化能力可增强10%～60%。国内外对鸡蛋清OVT的结构、转铁机理等方面均有报道[4],但鸽蛋清中OVT的相关研究较少。

蛋白质的结构与其功能密切相关,分子结构变化会导致其生物活性改变。来源于鸡蛋的OVT结构磷酸化可以提高蛋白的热稳定性、乳化性和抑菌活性[5];氧化处理会导致OVT溶解度下降,总巯基含量减少,羰基含量显著升高,影响其自由基清除作用[6];高温处理能够改变OVT的二级结构,降低其溶解性[7],明确鸽蛋来源OVT结构与生物活性关系有助于后续开发。体外模拟消化是快速评价蛋白质消化率、产物多肽分子质量及其生物活性的方法[8]。鸡蛋清OVT的小分子肽具有良好的生物活性,如降血压、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗癌[9-11]等,而鸽蛋清OVT消化产物及其小分子肽的生物活性尚不清楚。

本文采用分步醇沉法从鸽蛋清中提取OVT,利用LC-MS、红外光谱、圆二色谱、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)等方法对OVT进行结构表征,探究OVT的热稳定性和pH稳定性,将鸽蛋OVT进行体外模拟消化,确定其消化产物分子质量分布,并比较鸽蛋、鸡蛋来源OVT小肠消化产物的抗氧化性。本文为鸽蛋的深加工和鸽蛋OVT功能的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FeCl3·6H2O、NaHCO3、NaCl、乙醇、三氟乙酸、盐酸,均为分析纯级,国药集团化学试剂有限公司;鲜鸽蛋,江苏翠谷鸽业有限公司提供。α-淀粉酶(37 U/mg)、猪胃蛋白酶(250 U/mg)、胰脂肪酶(15 U/mg),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Mikro220R台式高速冷冻离心机,德国Hettich公司;LGJ - 12立式真空冷冻干燥机,北京松源华兴生物有限公司;1260 Infinity II Prime高效液相色谱仪,美国Agilent公司;Nicolet iS20红外光谱仪、Verios XHR SEM电子显微镜、Easy - nLC1200液相色谱仪、QEactive质谱仪,美国Thermo Fisher公司;NanoWizard 4 XP原子力显微镜,德国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 OVT的提取

鸽蛋清20 g按体积比1∶1加入去离子水,振荡60 min后,8 000 r/min离心10 min取上清液。随后加入FeCl3·6H2O、NaHCO3、NaCl(质量比为1∶0.78∶1.622,试剂总质量为上清液质量的5%),磁力搅拌60 min后,加入无水乙醇,使乙醇体积分数达到43%。充分混匀后静置60 min,离心,进一步加入无水乙醇,使乙醇体积分数达到59%,静置过夜,离心后取沉淀复溶于43%(体积分数)乙醇溶液中,搅拌2 h后8 000 r/min离心10 min,沉淀即为OVT[12],用于后续实验。鸡蛋清OVT提取方法与鸽蛋清相同。

1.3.2 SDS-PAGE电泳

将1.3.1节中制备的OVT配制成OVT蛋白溶液(1.0 g/mL),使用质量分数4%～12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳,分别取20 μL的鸽蛋清(0.5 g/mL)、OVT蛋白溶液与5 μL上样缓冲液混合,100 ℃加热5 min,冷却后取20 μL上样,进行电泳,电泳条件为电压90 V,30 min,随后调至120 V直至结束。使用考马斯亮蓝染色液染色30 min,脱色后观察电泳条带,使用Image J软件计算OVT纯度。

1.3.3 LC-MS鉴定

1.3.3.1 胶内酶解

将OVT电泳条带切胶后进行质谱鉴定,前处理参考KATAYAMA等[13]的方法进行。使用体积分数50%乙腈(含25 mmol/L NH4HCO3)将条带脱色至透明,加入10 mmol/L二硫苏糖醇溶液,56 ℃孵育50 min后,加入55 mmol/L碘乙酰胺溶液,室温下避光反应15 min。使用50 mmol/L NaHCO3溶液清洗,纯度为100%乙腈脱水至胶块变为白色,加入0.01 μg/μL胰蛋白酶于冰上充分反应,加入25 mmol/L NH4HCO3(含体积分数10%乙腈),37 ℃过夜酶解,反应结束后离心收集液体,冻干备用。

1.3.3.2 质谱分析及数据库检索

将前处理后的样品复溶于流动相A(含体积分数0.1%甲酸,5%乙腈的水溶液),使用C18反相色谱柱(75 μm × 15 cm C18,ChromXPEksigent)进行分析,梯度洗脱条件为:0～10 min流动相B(含体积分数0.1%甲酸,95%乙腈的水溶液)由5%升高至40%。

质谱采用QEactive系统(Thermo Scientific)结合纳升喷雾III离子源(Thermo Scientific),喷雾电压为2.3 kV,气帘气压为30 Psi,雾化气压为14 Psi,加热温度为150 ℃,质谱扫描方式为IDA。蛋白鉴定采用Mascot(V2.3.02)软件和Uniprot-Fungi数据库对采集到的数据进行检索。

1.3.4 OVT结构表征

1.3.4.1 紫外光谱测定

将OVT配制成1 mg/mL溶液,紫外分光光度计在190～350 nm的波长范围内扫描。

1.3.4.2 红外光谱测定

取适量OVT与KBr按质量比1∶400混合,研磨压片,红外光谱仪在400～4 000 cm-1范围内扫描,光谱分辨率为4 cm-1。

1.3.4.3 圆二光谱测定

将OVT溶于去离子水中配制成0.5 mg/mL待测溶液,以去离子水为空白,使用0.1 cm的石英比色皿,在190～240 nm远紫外区对蛋白溶液进行圆二光谱扫描。带宽为1 nm,扫描速度为500 nm/min,使用DichroWeb网站分析蛋白二级结构。

1.3.4.4 扫描电镜分析

取适量OVT固体样品,经喷金制样后,使用电子显微镜扫描加速电压为15 kV,观察OVT表面形态,分别采集放大倍数为1 000和10 000倍的图片。

1.3.4.5 原子力显微镜分析

将10 μL OVT蛋白溶液(10 μg/mL)滴加至新解离的云母片上,干燥后使用原子力显微镜轻敲模式扫描,范围分别为1 μm × 1 μm、2.5 μm × 2.5 μm,使用Nanoscope 1.9分析软件对图像进行处理。

1.3.5 OVT的热稳定性和pH稳定性测定

1.3.5.1 热稳定性测定

将OVT溶于去离子水配制成1 mg/mL待测溶液,分别在20、40、60、80 ℃水浴加热30 min。冷却至室温后离心(6 000 r/min,5 min),取上清液进行SDS-PAGE电泳和圆二色谱分析[14],参照1.3.2节和1.2.4.3节方法进行。

1.3.5.2 pH稳定性测定

将OVT溶于去离子水中配制成1 mg/mL待测溶液,分别将pH值调至5.0、7.0、9.0、11.0,室温下静置1.5 h后将pH值调回7.0,离心(6 000 r/min,5 min)后取上清液,进行SDS-PAGE电泳和圆二色谱分析[14],参照1.3.2节和1.3.4.3节方法进行。

1.3.5.3 内源荧光测定

将不同温度、pH处理后的上清液用去离子水稀释至0.5 mg/mL,取1 mL加入光程20 mm的石英比色皿中,使用荧光分光光度计在25 ℃扫描,激发波长为280 nm,发射光谱范围为250～480 nm。狭缝宽度为2.5 nm,扫描速度为120 0 nm/min。

1.3.6 体外模拟消化

参考INFOGEST 2.0进行静态体外模拟消化,并略作改动[15]。配制5 mg/mL的样品溶液,加入等量模拟唾液(含37 U/mg α-淀粉酶),37 ℃恒温振荡10 min,在反应5、10 min时取样,沸水浴5 min终止反应。剩余口腔消化液调节pH值至3.0,加入模拟胃液(含250 U/mg猪胃蛋白酶),37 ℃恒温振荡1 h,在反应5、10、20、30、60 min时取样,沸水浴5 min终止反应。将剩余胃消化液pH调至7.0后加入模拟肠液(含15 U/mg胰脂肪酶、250 U/mg胰蛋白酶),37 ℃恒温振荡1 h,在反应5、10、20、30、60 min时取样,沸水浴5 min终止反应。消化产物的电泳参照1.3.2节的方法进行。

1.3.7 小肠消化产物组成测定

小肠消化产物组成参考ZHONG等[16]的方法,使用HPLC串联紫外检测器和Inertsil WP300 C18(5 μm,4.6×250 mm)色谱柱进行分析。流动相为乙腈(A)和含体积分数0.1%三氟乙酸的水溶液(B),梯度洗脱程序为:0～15 min,3%～53% A;15～20 min,53%～3% A;20～30 min,3% A。流速为1 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为280 nm。

1.3.8 小肠消化产物抗氧化性测定

1.3.8.1 ABTS阳离子自由基清除率测定

将鸽蛋清OVT小肠消化产物(GOVT-D)和鸡蛋清OVT小肠消化产物(JOVT-D)分别配成5 mg/mL的待测溶液,其中JOVT-D按1.3.6节的实验方法制备。将ABTS二铵盐(0.35 mL,7.4 mmol/L)与过硫酸钾(0.35 mL,2.6 mmol/L)混合,混合物在暗室中静置15 h后,稀释40倍,作为ABTS阳离子溶液使用。将0.1 mL待测溶液与1 mL ABTS阳离子溶液混合,静置20 min,734 nm测定吸光度(A样品)。以去离子水分别代替ABTS阳离子溶液和待测溶液,作为空白(A空白)和对照(A对照),样品清除能力的计算如公式(1)所示:

ABTS阳离子自由基清除率

(1)

1.3.8.2 DPPH自由基清除率测定

配制0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,将待测溶液与DPPH乙醇溶液按照1∶1体积比混合,反应30 min后在517 nm处测量吸光值(B样品),以无水乙醇为对照(B对照),去离子水为空白(B空白),DPPH自由基清除率的计算如公式(2)所示:

DPPH自由基清除率

(2)

1.3.9 数据分析与处理

所有实验均重复3次,数据结果以“平均值±标准差”(Mean±SD)表示,采用SPSS 26进行显著性分析(P<0.05),利用Origin 2018软件对数据进行分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 OVT的提取和鉴定

图1为鸽蛋清和OVT的SDS-PAGE电泳图。由图可知鸽蛋清主要由卵转铁蛋白和卵白蛋白组成,OVT在鸽蛋清中的含量为(20.70±0.42)%,高于在鸡蛋清中的含量(12%)[17]。本研究所得OVT条带清晰,无其他杂蛋白,OVT回收率为(13.53±0.11)%,纯度为(98.60±1.96)%。

分析质谱原始数据,共鉴定到64条肽段。将所得肽段与数据库中的蛋白氨基酸序列进行比对,发现鉴定到的氨基酸序列与XP_005501624.1(Ovotransferrin,Columba livia)蛋白相比序列覆盖率达55%,因此确定该蛋白是卵转铁蛋白。蛋白相关信息如表1所示,蛋白登录号为XP_005501624.1,分子质量79 kDa,等电点为7.95。鸽蛋清OVT与鸡蛋清OVT(蛋白登录号CAA26040.1)的分子质量相差不大,但鸽蛋清OVT具有更高的等电点,同时疏水性氨基酸含量更多,鸽蛋清OVT可能具有更强的抗氧化活性[18]。

2.2 OVT 性质分析

2.2.1 结构表征

OVT的紫外光谱图(图2-a)具有典型的蛋白质特征。OVT的红外光谱图(图2-b)表明,OVT由酰胺A带和酰胺Ⅰ、Ⅱ带组成,其中3 303 cm-1的强吸收峰是由酰胺A带的N—H伸缩振动所引起的,是蛋白质特殊吸收峰;1 652 cm-1处的强吸收峰是由酰胺I带的CO伸缩振动所引起的,1 534、1 400 cm-1处的吸收峰是由酰胺I带的C—N伸缩振动、N—H弯曲振动和CH2弯曲共同引起的[19]。1 232、1 065 cm-1处是蛋白的酰胺Ⅱ带,主要是N—H弯曲振动和C—H伸缩振动所引起的[20]。OVT的圆二色谱图见图2-c,远紫外区是肽键的吸收范围,能够反映肽链结构[21]。分析OVT的圆二色谱可知常温下OVT二级结构组成(表2),OVT的α-螺旋和无规则卷曲含量低,主要由β-折叠和β-转角组成,柔性结构占比较多,OVT可能具有较好的乳化性能[22]。

2.2.2 微观结构分析

原子力显微镜观察OVT溶液的微观结构(图3-a、图3-b)发现鸽蛋清OVT呈球状,空间分布均匀,统计得分子平均高度为(2.55±0.08) nm,平均直径为(10.47±0.31) nm,而鸡蛋清OVT直径小于10 nm[23]。大多数食物蛋白质和植物蛋白都是球状蛋白质,肽链通过非极性疏水作用或二硫键被包含在蛋白质内部。球状蛋白的生理功能多种多样,例如降低胆固醇、抗肿瘤和改善心血管功能等[24]。对比分子直径发现,鸽蛋清OVT的分子直径大于鸡蛋清OVT,表明鸽蛋清OVT溶液可能具有较大的蛋白质黏度,有利于食品体系的稳定及产品口感的改善[25]。从图3-c可知,OVT经冷冻干燥脱水形成不规则片状,表面较平整,提高放大倍数至10 000×时,观察到片状固体表面有较多圆形的突起,结合AFM图像可以推测是部分OVT分子脱水时保持球状聚集后形成。

2.3 蛋白稳定性分析

2.3.1 热稳定性分析

从图4-a可知,温度从20 ℃升高到80 ℃过程中,OVT条带保持稳定,无新的条带生成。芳香族氨基酸,如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸可吸收荧光,通过荧光强度可以有效反映出蛋白三级结构的变化。OVT由20 ℃加热至40 ℃后,荧光强度减弱,温度继续升高至60 ℃和80 ℃时,荧光强度逐渐增强。这表明OVT在加热温度较低时,蛋白结构可能发生部分聚集,导致发色基团被包埋,荧光强度有所下降。而高温加热后,OVT分子结构逐渐伸展,蛋白内部的疏水区域暴露,荧光强度明显增强[26]。

图4-d的圆二色谱结果表明,热处理使OVT的二级结构发生明显变化(表2)。从20 ℃加热到40 ℃时,β-折叠和β-转角相对含量减少,无规则卷曲相对含量增多,加热至60 ℃时,β-折叠和β-转角含量进一步降低,无规则卷曲含量增多,同时出现少量α-螺旋结构,加热至80 ℃时,无规则卷曲含量有所降低,β-折叠和β-转角含量有一定恢复,加热过程中的二级结构变化可能有助于提升OVT的乳化性能[27]。

2.3.2 pH稳定性分析

从图5-a可知,pH值为5.0、7.0、9.0、11.0时,OVT条带保持稳定。结合蛋白质加工及应用的常用条件,本研究选取pH值为5.0～11.0范围的OVT内源荧光及二级结构变化进行分析,由图5-b可知,pH值为5.0、7.0时荧光强度相近,pH值升高至9.0和11.0时,荧光强度下降。碱性环境时,OVT可能发生部分变性聚集,导致暴露的荧光基团变少,同时有部分蛋白质结构伸展,内部疏水基团暴露于酸性环境中,使蛋白质侧链中的荧光基团淬灭,导致荧光强度下降[28]。

从圆二色谱图可知,pH值由7.0向酸、碱变化时,CD曲度下降,蛋白构象发生改变。与pH值7.0时相比,在酸性环境下,β-折叠和β-转角含量下降,出现无规则卷曲,且α螺旋结构含量增加,pH值9.0时,同样出现了无规则卷曲和α螺旋结构。pH值继续升高至11.0时,无规则卷曲含量下降,β-折叠含量有所恢复。β-折叠含量升高有利于增加蛋白质的柔韧性和扩展性,使分子结构更具柔性化,同时降低OVT的表面疏水性[29]。

2.4 OVT体外模拟消化

如图6-a可知,口腔消化阶段OVT未被降解。胃消化阶段,原有OVT条带消失,新的条带集中在5 k～15 kDa,且条带颜色随消化时间增加而变浅,说明OVT在胃消化阶段逐渐被降解。小肠消化阶段,泳道无条带,表明OVT消化产物分子质量小于5 kDa,因此采用液相进一步分析产物分子质量,结果如图6-b所示,发现10.97 min处的峰面积随时间增长逐渐减小,16.20、18.48 min处的峰面积随时间增加逐渐增大,表明OVT在小肠中的消化程度随时间增加而提高,消化1 h时降解已经基本完成,产物分子质量集中在600～1 000 Da。

2.5 OVT小肠消化产物抗氧化性分析

从图7可知,GOVT-D对ABTS阳离子和DPPH自由基清除率最高分别达到(78.96±2.24)%和(32.29±1.60)%,均高于JOVT-D。从结构上看,鸽蛋、鸡蛋OVT的糖基化位点和糖链结构均有差异,鸽蛋清糖蛋白具有更多的糖基化位点,且末端特有的糖链Galα1-4Gal可以抑制尿路致病性大肠杆菌的黏附[30]。鸽蛋清、鸡蛋清OVT结构上的差异使其消化产物具有不同的氨基酸种类、排列方式和糖链结构,进而导致其消化产物抗氧化能力的不同,来源于鸽蛋清OVT的消化肽具有更强的抗氧化性。目前,关于鸽蛋OVT的研究还较少,尚不清楚鸽蛋OVT的结构与其生理活性的关系,鸽蛋OVT与鸡蛋OVT相比,在其他生理活性是否具有优势还需进一步深入研究。

3 结论

本研究以鸽蛋清为原料,采用分步醇沉法分离纯化OVT,回收率为(13.53±0.11)%,纯度为(98.60±1.96)%。利用超高效液相色谱-质谱联用对其进行分析,确定该蛋白为卵转铁蛋白(XP_005501624.1;Ovotransferrin),分子质量79 kDa。由AFM图像可知OVT是球状,平均高度为(2.55±0.08) nm,平均直径为(10.47±0.31) nm;SEM观察其微观结构为不规则片状,表面有圆形突起,与AFM观察的分子形态一致。常温下,OVT二级结构主要由β-折叠和β-转角构成,OVT溶液加热至80 ℃时出现无规则卷曲结构,其含量先增高后减少;OVT溶液pH由中性向酸、碱性变化时,部分构像转变为α-螺旋和无规则卷曲结构。模拟消化结果表明,OVT胃消化产物分子质量在5～15 kDa之间,小肠消化产物分子质量小于5 kDa。对比鸽蛋清、鸡蛋清来源OVT小肠消化产物的抗氧化性,发现GOVT-D对ABTS阳离子和DPPH自由基清除率最高分别达(78.96±2.24)%和(32.29±1.60)%,均高于JOVT-D。本研究为鸽蛋OVT在功能食品开发方面的应用提供理论基础。

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Purification, identification, physicochemical properties and antioxidant activity of the digestion products of ovotransferrin from pigeon egg

XIAO Yu1, XU Xiaoqi1*, ZHANG Tao2, QIU Yibin1, XU Hong1, LI Sha1, MENG Jun3

1(College of food and light industry, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China)2(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics,Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Nanjing 210023, China)3(Nanjing Weisideng Biotechnology Co.Ltd., Nanjing 211134, China)

ABSTRACT In this study, ovotransferrin (OVT) from pigeon egg white was isolated and purified, and its amino acid sequence was identified by LC-MS and UniProt database alignment.Scanning electron microscopy and atomic force microscopy show that OVT has a spherical structure.The secondary structure of OVT was mainly composed of β-sheet and β-turn.When heated from 20 ℃ to 80 ℃, the random coil appears, which content was first increased and then decreased.When the pH of OVT solution changed from neutral to acidic or alkaline, part of the conformation changes to α-helix and random coil.Further analysis of the simulated digestive products of OVT in vitro showed that the molecular weight of the oral digestive products was between 45 k-80 kDa;molecular weight of gastric digestion products was between 5 k-15 kDa;Molecular weight of intestinal digestive products was less than 5 kDa.In terms of pigeon egg OVT intestinal digestive products antioxidant activity, the highest scavenging rates of ABTS cation free radical and DPPH free radical were (78.96±2.24)% and (32.29±1.60)%, respectively, which were higher than the same concentration of OVT digestive products in chicken eggs.This study provides a scientific basis for the deep processing of pigeon eggs from the aspects of preparation technology, physicochemical properties and activity of digestion products.

Key words pigeon egg;ovotransferrin;physicochemical properties;digestion products;antioxidant activity

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038141

引用格式：肖宇,续晓琪,张涛,等.鸽蛋卵转铁蛋白的纯化鉴定、理化特性及消化产物抗氧化性研究[J].食品与发酵工业,2024,50(23):123-131.XIAO Yu, XU Xiaoqi, ZHANG Tao, et al.Purification, identification, physicochemical properties and antioxidant activity of the digestion products of ovotransferrin from pigeon egg[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(23):123-131.

第一作者：硕士研究生(续晓琪副教授为通信作者,E-mail:xiaoqi_xu@njtech.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(32372264);江苏省自然科学基金项目(BK20210674)

收稿日期：2023-12-02,改回日期：2024-01-05