鲫鱼(Carassius auratus)是一种典型的淡水鱼,具有生长速度快、营养价值高等优点,是我国重要的淡水鱼之一[1]。但由于其水分含量较高、肌肉组织柔软、蛋白质丰富,在鱼体内微生物及内源酶的作用下,鲫鱼在贮藏期间极易腐败变质[2]。传统上主要通过感官评价、理化指标及微生物指标对鱼类新鲜度进行判断。感官评价主要包括外观、质地、气味、颜色等方面,该方法主观性较强,具有一定局限性[3]。鲫鱼贮藏期间理化指标如挥发性盐基氮含量(total volatile base nitrogen,TVB-N)、pH值、质构特性以及菌落总数均会变化,因此利用理化和微生物指标也能在一定程度上评价鲫鱼的新鲜程度。例如GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》中限定了各种水产品中TVB-N的含量,SUN等[4]发现鳜鱼在冷藏期间硬度、内聚力、弹性等质构特性随着贮藏时间延长显著下降,TAN等[5]研究了鲟鱼冷藏期间菌落总数变化并找到了导致鲟鱼鱼片腐败的优势菌,但是测定理化指标及微生物指标均需要对样品进行破坏,步骤繁琐,耗时较长。挥发性化合物通常在鱼类从新鲜到腐败过程中变化显著[6],已有很多研究将挥发性化合物作为评估鱼类新鲜程度的潜在指标[7]。目前,固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)结合气相色谱串联质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)是检测鱼类挥发性物质的有效方法[8]。然而,几乎所有研究中的方法都是将样品粉碎,再通过SPME对挥发性物质进行富集[9],这种测定方法得出的结果与实际贮藏过程中鲫鱼的挥发性物质种类和数量并不一致,无法为冷藏期间通过分析挥发性物质的无损监测判断其新鲜度变化提供准确的指导。因此,使用原位SPME方法可以更好地反映冷藏过程中鲫鱼挥发性物质的实际情况。结合多元统计方法[10],将原位检测得到的挥发性物质与理化指标、微生物指标相关联,对挥发性物质进行筛选,选择出能够反映鲫鱼冷藏期间新鲜度变化的关键挥发性物质,为判断其新鲜度提供参考。然而,目前这方面的研究仍然比较缺乏。
本文以鲫鱼为研究对象,测定其4 ℃贮藏期间理化指标变化,并利用原位的SPME方法对鲫鱼冷藏期间挥发性物质进行富集,并通过GC-MS对挥发性物质进行定性定量分析。利用理化指标及菌落总数通过层次聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)将鲫鱼分为3类,再通过主成分分析(principal component analysis,PCA)对检测出的挥发性物质进行初步筛选,随后将鲫鱼贮藏期间释放的特征挥发性物质与理化指标进行相关性分析,筛选出最能反映鲫鱼新鲜度变化的挥发性物质,利用Fisher线性判别分析(Fisher’s linear discriminant analysis,FDA)建立鲫鱼新鲜度变化判别模型。为设计相关气体传感器用于原位实时测定挥发性物质成分从而判断冷藏状态下鲫鱼新鲜度提供了新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活鲫鱼,北京某超市,规格为150～250 g/尾,去除鱼鳞、鱼鳃及内脏后迅速置于4 ℃冰箱内贮藏。2-辛醇(色谱级),上海麦克林生化科技有限公司;甲醇(色谱级),百灵威科技有限公司。其他试剂均为分析级,北京化工厂。
1.2 仪器与设备
PB-10型pH计,赛多利斯科学仪器有限公司;CT3物性分析仪,美国Brookfield公司;K9840凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司;7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;57348-U SPME纤维组件、57330-U SPME手柄,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;α6300数码相机,日本索尼公司;BS200S-WEI超纯水仪,美国MILL-PORE公司;BCD-520 WLCFPAFA5U1型冰箱,海尔智家股份有限公司;FSJ-A03E1电动研磨器,小熊电器股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 贮藏及取样方法
将鲫鱼样品置于2.6 L保鲜盒中恒温(4 ℃)保存10 d,在贮藏第0、2、4、6、8、10天分别取样分析,收集挥发性物质,并拍摄照片。随后,将部分鱼肉切块用于测定硬度以及菌落总数,另一部分切片后立即浸入液氮中,研磨成粉末,用于测定pH值和TVB-N含量。
1.3.2 外观变化
使用数码相机在小型摄影棚中对鲫鱼样品外观及切面进行拍照记录。
1.3.3 硬度
取鲫鱼背肌组织切成2 cm×2 cm×1 cm大小的鱼块,利用全质构面剖析法测定其硬度,选取TA11/1000探头(直径6 mm),测定参数设置如下:压缩距离10 mm;触发点负载10 g;测试速度1.00 mm/s。
1.3.4 pH值
参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》,称取2 g(精确至0.01 g)样品粉末,加入20 mL 0.1 mol/L KCl溶液,振荡,静置30 min后过滤,用pH计测定滤液的pH值。
1.3.5 挥发性盐基氮含量
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法并稍作修改。称取5 g(精确至0.01 g)样品粉末,加入蒸馏水,定容至25 mL,振荡,浸渍30 min后过滤。吸取20 mL滤液加入消化管中,并加入1 g氧化镁,使用半自动凯氏定氮仪蒸馏5 min,蒸馏液用25 mL 20 g/L硼酸溶液吸收,再用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定至pH=4.65。试样中挥发性盐基氮含量的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:X,试样中挥发性盐基氮的含量,mg/100 g;V1,试液消耗盐酸标准滴定溶液的体积,mL;V2,试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积,mL;c,盐酸标准滴定溶液浓度,mol/L;m,试样质量,g。
1.3.6 菌落总数
参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》对贮藏期间鲫鱼的菌落总数进行测定。
1.3.7 挥发性物质
1.3.7.1 挥发性物质原位采集
采用SPME法采集鲫鱼挥发性化合物。萃取纤维在使用前于250 ℃下老化30 min。气体萃取具体装置如图1所示。将SPME手柄放置于保鲜盒内空白处,推出萃取纤维,随后吸取10 μL 2-辛醇内标[0.1%(体积分数)甲醇溶液]于盖玻片上,并立即扣紧盒盖,移于4 ℃冰箱中静置,平衡吸附12 h。吸附完成后,迅速取出萃取纤维,将其插入气相色谱仪的进样口,在250 ℃下解吸附5 min。
图1 SPME装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of SPME
1.3.7.2 挥发性物质测定
色谱条件:色谱柱为Agilent DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为高纯氦气(He>99.999%),流速1 mL/min;进样口温度为250 ℃。程序升温如下,初始温度45 ℃,维持2 min;以3 ℃/min升至80 ℃,维持2 min;以3 ℃/min升至140 ℃,维持2 min;以5 ℃/min升至200 ℃。进样方式为不分流进样。
质谱条件:离子源为电子轰击源,电离电压为70 eV,离子源温度为230 ℃,四级杆温度为150 ℃,辅助通道温度为250 ℃;电子倍增器电压为350 V;扫描时间为0.5～50.0 min;质量分析范围(m/z)为40～600。
1.3.7.3 挥发性物质定性及定量分析
通过质谱数据与NIST 14.0谱库进行比较,对鲫鱼贮藏过程中的挥发性化合物进行定性鉴定。根据各挥发性化合物相对于内标(2-辛醇)的峰面积,对其进行半定量分析,计算如公式(2)所示:
(2)
式中:X,单位质量鲫鱼释放的挥发性物质的含量,μg/kg;A样,样品中挥发性物质的峰面积;C标,内标物质量浓度,μg/mL;V标,加入内标物溶液的体积,mL;A标,内标物的峰面积;m,样品质量,kg。
1.4 数据分析
每个取样点所有指标均测定3次,测定结果取均值。数据用SPSS 27.0软件进行方差分析(analysis of variance,ANOVA)与Fisher判别分析,数据显著性采用最小显著性差异(least significant difference,LSD)法进行评估,显著性水平为P<0.05,结果以“平均数±标准差”表示。使用Origin 2023软件绘制图像。
2 结果与分析
2.1 鲫鱼贮藏期间新鲜度变化
2.1.1 外观
鱼类在贮藏期间,鱼眼、体表、肌肉等部位的颜色及纹理等外观特征会随着鱼品质下降而发生显著变化[11]。鲫鱼在贮藏期间外观及截面变化如图2所示。随着贮藏时间的延长,鲫鱼鱼眼由饱满突出且角膜清澈变为浑浊塌陷,鱼皮色泽逐渐暗沉,体表黏液附着减少,鱼肉颜色逐渐变黑。
图2 鲫鱼贮藏期间外观变化
Fig.2 Changes in the appearance of crucian carp during storage
2.1.2 理化及菌落总数分析
硬度是体现鱼肉本身的软硬程度,抵抗压力和破坏的能力,是使鱼肉达到一定形变所需要的力[12],是鲫鱼重要的品质特性之一。如图3-a所示,随着贮藏时间的延长,鲫鱼的硬度逐渐下降。第0天鲫鱼的硬度为1 440.5 g,贮藏至第10天,鲫鱼的硬度下降为606.8 g。贮藏0～4 d,硬度下降较为缓慢,而在贮藏4 d后鲫鱼的硬度明显下降。鱼肉中内源性蛋白酶对胶原蛋白的降解密切相关,从而导致鱼肉变软,硬度显著下降[13]。
a-硬度;b-pH;c-TVB-N;d-菌落总数
图3 鲫鱼贮藏期间理化指标及菌落总数变化
Fig.3 Changes of physicochemical indexes and total viable count of crucian carp during storage
pH是反映鱼新鲜程度的重要指标之一。由图3-b可知,贮藏过程中鲫鱼pH总体呈上升趋势,贮藏0～6 d pH值上升较快,而贮藏6 d后,pH逐渐趋于平稳。鱼肉中的内源性蛋白酶或微生物随着贮藏会产生碱性的代谢物(例如氨和三甲胺),导致pH值上升[14]。
TVB-N指鲫鱼鱼片在酶和细菌的作用下,使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质[15],是评价鱼肉新鲜度的重要指标。如图3-c所示,鲫鱼的TVB-N呈现上升趋势。在贮藏初期,TVN-B含量上下波动,而在贮藏后期,TVB-N含量明显升高,在第10天达到18.19 mg/100 g。
微生物是造成鲫鱼腐败的主要因素[16]。贮藏期间鲫鱼中的微生物不断繁殖,细菌总数越多,鱼肉腐败越严重,如图3-d所示,随着贮藏时间的延长,鲫鱼的菌落总数呈现上升趋势,从贮藏初期的2.76 lg CFU/g,到第10天上升至6.69 lg CFU/g,此时鲫鱼出现一定程度的腐败。
2.1.3 聚类分析
鲫鱼质量与理化指标与微生物指标密切相关,但仅凭单一指标无法对鲫鱼新鲜度进行全面评价,因此,利用HCA方法,对不同贮藏时间下与鲫鱼新鲜度密切相关的硬度、pH值、TVB-N、菌落总数进行分析,通过聚类对鲫鱼新鲜度进行分类,结果如图4所示。
图4 基于鲫鱼贮藏期间理化指标及菌落总数变化的HCA图
Fig.4 HCA plot based on the changes of physicochemical indexes and total viable count of crucian carp during storage
注:n-1、n-2、n-3代表第n天的3个平行(下同)。
当欧氏距离为0.6时,可以将鲫鱼样品分为3类,第1类为0～4 d,第2类为6～8 d,第3类为10 d,这种分类结果能在一定程度上说明鲫鱼的新鲜程度。第1类鲫鱼的硬度为1 310.8～1 440.5 g,pH值为6.76～6.94,TVB-N为7.83～8.57 mg/100 g,菌落总数为2.76～4.12 lg CFU/g,该阶段的鲫鱼品质最高,较为新鲜。第2类鲫鱼各项指标较第1类均明显变化,硬度降至860.3～891.8 g,pH值升为7.11～7.14,TVB-N升至9.75～12.88 mg/100 g,菌落总数为5.41～5.68 lg CFU/g。随着存放时间延长,第3类鲫鱼的新鲜程度较前两类显著下降,硬度降为606.8 g,pH值达到7.13,TVB-N为18.19 mg/100 g,菌落总数为6.69 lg CFU/g,此时鱼肉品质从感官上判断已明显劣变。基于HCA的分类结果可以利用理化指标和菌落总数对鲫鱼质量进行更客观的评价。
2.2 鲫鱼贮藏期间挥发性物质分析
2.2.1 挥发性物质含量变化
利用原位SPME富集,GC-MS分析鲫鱼贮藏期间的挥发性物质变化,结果如表1所示。共检测出66种挥发性物质,包括醇类、醛酮类、烯烃、酯类、酸类等。其中醇类的产生涉及氨基酸降解以及酮类、醛类的还原等多个代谢通路[17],包括2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、丁醇、己醇、异戊醇等在鲫鱼贮藏期间均被检出,含量在鲫鱼腐败变质后均显著上升,其中含量较高的异戊醇从第0天的0.344 μg/kg到第10天升至10.607 μg/kg。醛类化合物主要是由鱼类肌肉中的脂质氧化产生的,如壬醛在贮藏后期含量显著增加,是鲫鱼贮藏后期产生油腥味的来源之一[18]。酮类化合物中,3-羟基-2-丁酮、2-丁酮等是假单胞菌的生长代谢产生的特征性气体,鲫鱼贮藏期间3-羟基-2-丁酮含量显著上升,到变质时达到23.544 μg/kg,与MIK
-KRAJNIK等[7]的研究结果类似。贮藏期间,乙酸丁酯、正己酸甲酯、正己酸乙酯、乙酸己酯等酯类化合物含量显著增加,异戊酸等短链脂肪酸含量明显上升,这是由于微生物产生的脂肪酶可分解肌肉中的脂肪,产生短链挥发性脂肪酸和酯类[19]。为找到与鲫鱼新鲜度分类相关的关键挥发性物质,利用PCA从66种挥发性物质中进行筛选。
表1 鲫鱼贮藏期间挥发性物质含量变化
Table 1 Changes in volatiles of crucian carp during storage
序号名称CAS号含量/(μg/kg)0 d2 d4 d6 d8 d10 d1二甲基硫75-18-3-0.328±0.018b0.209±0.032c-0.195±0.041a-22-乙酰基-2-甲基四氢呋喃32318-87-9-3.238±0.183b1.141±0.184a1.352±0.697a--3三乙胺121-44-8-----0.144±0.004a42-甲基戊醛123-15-9-----1.391±0.039a5乙酸乙酯141-78-61.127±0.064a3.474±0.266b2.759±0.316b3.088±1.646b2.885±0.138b-62-丁酮78-93-3-----5.274±0.541a7丙酸乙酯105-37-3----0.430±0.090a1.031±0.177b81-乙烯基氮丙啶5628-99-9-0.481±0.027a0.43±0.069a0.859±0.316b0.359±0.075a-92-甲基丁酸乙酯7452-79-1----0.253±0.047a1.389±0.111b10乙酸丁酯123-86-4-0.588±0.023a0.475±0.245a0.654±0.233a0.501±0.016a0.992±0.143b11异丁醇78-83-1--0.189±0.024a0.479±0.105c0.384±0.06b0.320±0.009b12乙酸-2-甲基丁酯624-41-9-4.763±0.48bc2.521±0.513a5.584±1.164b3.774±0.743b5.816±0.819b131-十一碳烯821-95-4-----5.893±0.049a141-丁醇71-36-3-0.223±0.013a0.208±0.034a0.356±0.099b--15月桂烯123-35-3---0.640±0.221a1.066±0.222b1.092±0.118b16正己酸甲酯106-70-7----0.092±0.019a1.935±0.293b17D-柠檬烯5989-27-50.769±0.135a2.991±0.132a2.422±0.427a13.387±3.923b31.658±6.767c38.448±2.496d18异氰酸甲酯624-83-90.119±0.019a----1.591±0.045b19烯丙胺107-11-9---2.001±0.439a1.892±0.237a2.050±0.058a201,3,4-噁二唑288-99-3-----2.060±1.944a21异戊醇123-51-30.344±0.008a1.709±0.122ab2.876±0.701b8.266±1.459c7.077±0.867c10.607±1.225d22丁烯酮78-94-40.207±0.033a0.705±0.040b----23丁酸丁酯109-21-7-0.379±0.043b0.21±0.034a0.549±0.120c-0.549±0.092c243-甲基-2-丁烯酸乙酯638-10-8-----0.774±0.056a252-甲基丁酸丁酯15706-73-7-0.405±0.07bc0.247±0.057ab0.616±0.22cd0.835±0.353de1.080±0.156e26正己酸乙酯123-66-0----0.258±0.054a0.973±0.061b275-甲基-1-苯基-1-己酮25552-17-40.125±0.02b-0.135±0.022b0.010±0.002a0.174±0.036c0.328±0.009d28γ-松油烯99-85-4--0.054±0.025a0.149±0.033b0.172±0.053b0.137±0.004b293,4-二甲基噻吩632-15-50.128±0.032b0.224±0.006d0.181±0.029c-0.064±0.018a-303-辛酮106-68-30.661±0.079b-0.305±0.049a-0.593±0.123b1.542±0.043c314-甲基苯戊酮1671-77-80.027±0.005a0.011±0.001a0.087±0.051b0.027±0.006a0.032±0.006a0.100±0.003b32乙酸己酯142-92-7-0.528±0.126b0.341±0.094a0.909±0.149c0.788±0.168c0.806±0.023c333-羟基苯乙酮121-71-1---0.023±0.005a0.034±0.007b0.023±0.000a343-羟基-2-丁酮513-86-05.391±1.512a10.415±0.094bc8.154±0.117ab14.270±4.021c12.772±2.248c23.544±3.294d352-辛酮111-13-72.304±0.533a1.376±1.376a----36己酸丙酯626-77-7--0.046±0.011ab0.114±0.114bc0.179±0.093c0.16±0.011c376-甲基-5-庚烯-2-酮110-93-0-0.071±0.004a0.115±0.02a0.299±0.109b0.273±0.124b0.326±0.024b38正己醇111-27-30.338±0.023a0.445±0.005a0.360±0.059a1.015±0.281b0.873±0.118b0.950±0.146b392,4-二甲基苯胺95-68-1-----0.023±0.004a40二丙基二硫醚629-19-60.026±0.008a0.023±0.003a----41壬醛124-19-6-0.045±0.003a0.053±0.015a0.095±0.021b0.038±0.008a0.177±0.005c42己酸丁酯626-82-4-0.248±0.089ab0.164±0.063ab0.260±0.212ab0.314±0.286ab0.413±0.003c43异丁酸己酯2349-07-7---0.076±0.017b0.066±0.02ab0.055±0.003a44辛酸乙酯106-32-1----0.045±0.009a0.152±0.027b45醋酸64-19-70.088±0.004a0.109±0.026a11.057±10.978b0.102±0.003a0.123±0.054a0.410±0.031a461-辛烯-3-醇3391-86-40.183±0.004cd0.157±0.009bc0.067±0.020a0.185±0.001d0.139±0.033b0.528±0.012e475-羟基-2,7-二甲基-4-辛酮6838-51-3----0.022±0.005a0.190±0.003b483,5,5-三甲基-2-己烯26456-76-80.057±0.009c-0.006±0.001a0.037±0.005b0.034±0.008b0.099±0.003d492-乙基己醇104-76-70.225±0.013abc0.217±0.068ab0.154±0.063a0.267±0.004bc0.244±0.051abc0.331±0.084c502,3-庚烷二酮1996/4/80.031±0.005a0.195±0.011c--0.132±0.027b-51苯甲醛100-52-70.022±0.005abc0.034±0.004bc0.012±0.002a0.048±0.015d0.031±0.006bc0.039±0.001cd52吡咯109-97-70.037±0.006a-0.056±0.003a0.118±0.019c0.093±0.021b0.051±0.001a532,3-丁二醇513-85-90.222±0.071a1.387±0.104b2.949±0.44c2.794±0.613c1.700±0.477b2.907±0.532c54丙酸丙酯106-36-5-0.363±0.020b0.118±0.019a---
续表1
序号名称CAS号含量/(μg/kg)0 d2 d4 d6 d8 d10 d55反式-2-辛烯-1-醇18409-17-10.094±0.002c0.048±0.003b0.028±0.007a0.081±0.004c0.075±0.025c0.158±0.009d562-甲基己酸4536-23-6-----0.657±0.039a57异戊酸503-74-2----0.026±0.005a0.376±0.016b58丙酸1979/9/4-----0.092±0.085a59对-(2-苯基-1-苯并咪唑)苯甲酸甲酯3510-24-50.023±0.007b-0.012±0.002a-0.033±0.007c0.036±0.002c60乙酰胺60-35-5--0.003±0.001a---611,4-二醛基-2-甲基苯27587-17-30.009±0.001a0.015±0.004c0.011±0.002a0.012±0ab-0.103±0.003c622-甲基苯并呋喃4265-25-20.011±0.002a0.006±0.006a0.005±0.001a0.007±0.001a0.01±0.001a0.008±0.000a63苯乙醇60-12-8---0.024±0.001a0.041±0.016b0.171±0.003c641,4-丁二醇110-63-40.017±0.001c0.027±0.002d0.010±0.002a--0.014±0.000b652-乙烯基呋喃1487-18-9-----0.024±0.004a662,4-二甲基苯乙酮89-74-7-0.018±0.001c0.006±0.001a--0.010±0.000b
注:“-”代表未检出,每行不同小写字母代表差异显著,P<0.05。
2.2.2 挥发性物质主成分分析
PCA可以从多变量中推导出最重要的因素,从而观察和比较不同样本PCA值的空间分布差异[20]。根据理化指标聚类结果,利用PCA将鲫鱼贮藏期间66种挥发性物质含量变化进行分析,结果如图5-a所示。PC1的方差贡献率为52.4%,PC2的方差贡献率为18.3%,两个主成分的方差累积贡献率共计为70.7%,说明前两个主成分可以代替所有的变量。根据PCA算得66种挥发性物质的载荷,可选出对分类贡献度较大的12种挥发性物质(异丁醇、异戊醇、正己醇、苯乙醇、2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、壬醛、正己酸甲酯、正己酸乙酯、1-十一碳烯、γ-松油烯、异戊酸)。为判断筛选出12种物质是否具有代表性,再次利用PCA进行验证分析,结果如图5-b所示,PC1的方差贡献率为75.9%,PC2的方差贡献率为20.2%,两个主成分的方差累积贡献率共计为96.1%,表明前两个主成分可代替所有的变量,且贡献率显著高于图5-a中两个主成分累计贡献率,与图5-a分类情况一致,进一步说明所筛选出的12种挥发性物质对鲫鱼新鲜度分类的代表性更好。但是PCA在划分第一类和第二类鲫鱼时出现了一定重合,因此为进一步分析筛选出最能指征鲫鱼新鲜度的挥发性物质作为判断指标,对12种挥发性物质与理化指标和菌落总数进行相关性分析。
a-基于66种挥发性物质的PCA;b-基于筛选出的12种挥发性物质的PCA
图5 PCA得分图
Fig.5 PCA score plot
2.3 鲫鱼贮藏期间特征挥发性物质与理化指标、菌落总数相关性分析
如图6所示,异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛的含量与鲫鱼的pH值、TVB-N、菌落总数呈正相关,相关系数为0.66～0.96,且与鲫鱼硬度呈负相关,相关系数在-0.77～-0.88,说明这几种挥发性物质与鲫鱼新鲜度有很强的相关性,这与BAI等[21]关于金枪鱼变质特征气体的研究结果有一定的相似性,其中异戊醇具有发酵气味,与微生物氨基酸代谢过程有关[22],在一些鱼类和肉类变质后均有检出[23-24];壬醛具有强烈的油脂气味,是鱼类鱼腥味的主要来源之一,由脂氧合酶对n-9多不饱和脂肪酸的作用产生,随着鱼肉氧化加强该物质会呈现上升趋势[25];3-羟基-2-丁酮呈现黄油味,是鱼类腐败后所产生的最重要的酮类物质之一,主要是由假单胞菌属、乳酸菌属等微生物代谢产生[26],在细菌的酶促丙酮酸代谢通路中,丙酮酸经一系列氧化还原反应后生成3-羟基-2-丁酮[17]。因此可以选择异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛作为指征鲫鱼贮藏期间新鲜度变化的特征气体指标。
图6 理化指标、菌落总数与挥发性物质相关性分析
Fig.6 Correlation analysis between the physicochemical indexes, total viable count and volatiles
2.4 鲫鱼新鲜度判别模型建立
根据聚类分析的分类结果,选择与理化指标和菌落总数相关性较高的异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛,利用FDA建立鲫鱼新鲜度线性判别函数,3种挥发性物质的Wilk’s Lambda值均较小且之间存在显著性差异(P<0.01),说明公式的判别能力较强[27],具体判别如公式(3)、公式(4)所示:
Y1=1.419X异戊醇-0.233X3-羟基-2-丁酮-25.320X壬醛-2.679
(3)
Y2=-0.649X异戊醇+0.263X3-羟基-2-丁酮+36.001X壬醛-2.377
(4)
利用公式(3)、公式(4)可以对鲫鱼样本的新鲜度进行判别,将3种挥发性物质浓度代入判别式中,求出Y1、Y2值,与组质心进行比较,马式距离最短的点即为对应的新鲜度级别。如图7所示,3个类别的组质心能够明显区分,且对于预测组的判别效果较好。说明鲫鱼贮藏期间异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛含量可作为关键品质指标对鲫鱼品质等级进行判别预测,为原位无损测定挥发性物质分析鲫鱼新鲜度提供了一种新的方法参考。
图7 基于鲫鱼挥发性物质的Fisher 判别空间散点图
Fig.7 Fisher’s discriminant spatial scatterplot of crucian carp based on its volatiles
3 结论
鲫鱼在4 ℃贮藏过程中,随着冷藏时间延长,外观、硬度、TVB-N、pH、菌落总数均发生了不同程度的变化。pH值、TVB-N和菌落总数随着冷藏明显升高,而硬度则不断下降。采用分层聚类分析对与鲫鱼新鲜度相关的指标进行了综合分析,当欧氏距离等于0.6时,可将贮藏期间的鲫鱼根据新鲜度分为3类。同时利用原位SPME对鲫鱼样品在贮藏过程中释放的挥发性物质进行了富集,并采用GC-MS进行测定,共检测出66种挥发性物质。通过PCA和相关性分析后筛选出异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛作为指征鲫鱼贮藏期间品质变化的特征指标,再利用LDA构建了基于异戊醇、3-羟基-2-丁酮、壬醛判别鲫鱼新鲜度的模型。本研究为通过监测食材贮藏过程中挥发性物质判断其新鲜程度提供了重要的参考方法。
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