我国有着得天独厚的地理环境和世代相传的酿酒技术,造就了举世闻名的中国白酒。浓香型白酒是中国白酒最古老的四大香型之一,因其“窖香优雅,余味悠长”而深受消费者喜爱。浓香型白酒采用自发的、开放的固态泥窖发酵模式,糟层中的微生物群落结构受窖泥的影响显著,且延长发酵期使浓香型白酒的口感更协调、丰富,致使不同发酵期、不同糟层生产出的基酒质量存在显著差异,所以很多酒厂采用“双轮底”发酵模式,以求提高浓香型基酒的质量[1-4]。
近年来,随着检测技术在酒类领域的不断发展[5-8],着重于酒类不同发酵期、不同糟层的研究越来越多。如LIU等[9]研究紫薯酒发现,紫薯酒中的花青素含量和酒精度在发酵第7天时达到最大,在第8天时出现了下降趋势;YUAN等[10]研究青枣酒发现,青枣酒中部分挥发性物质如醛类、酮类、杂环类和芳香族化合物的相对含量在发酵后期显著降低;HAO等[11]研究山栏米酒发现,3年发酵期的山栏米酒含有的挥发性物质种类最多(38种),这些物质为山栏米酒贡献了独特的香气,但发酵45 d和1年的山栏米酒中仅观察到19种挥发性物质。舒代兰等[12]研究浓香型白酒糟醅风味和基酒风味发现糟醅中乙酸、乳酸、丁酸及己酸的变化趋势与对应的乙酯生成趋势大体一致。高玲等[13]研究浓香型白酒糟醅自然发酵11周时发现,糟醅中乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯在发酵前期含量很少,在第2周逐渐上升并在第6周达到最大,之后略有下降,而乳酸乙酯含量在整个发酵过程中都不断增加。针对于糟层的研究,主要是对于浓香型白酒的研究居多,如段明松等[2]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分析不同空间层次糟醅基酒中的香气成分,发现上层基酒中风味物质含量最低,中层含量略高,下层的含量最高。卫春会等[14]采用GC-MS分析浓香型白酒糟醅中主要风味物质及其糟层分布的差异,发现上层糟醅主要风味物质也明显少于中层和下层。以上研究均表明,基酒的质量与发酵期和糟层密不可分。
目前,有很多针对于不同发酵期、不同糟层的研究,但对于浓香型白酒中不同发酵期对不同糟层的风味影响还鲜有报道。为探究不同发酵期浓香型基酒在不同糟层的风味成分,本实验在酒厂取样,采用HPLC检测乙酸、乳酸、丁酸及己酸,气相色谱法-氢火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)定性定量检测含量较多的挥发性物质,HS-SPME-GC-MS定性定量检测微量挥发性物质,再通过韦恩图分析、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)、香气活度值(odor activity value, OAV)分析、聚类热图分析等方法对不同发酵期、上中下3层糟醅所产基酒中的风味物质进行解析,可以为生产上将不同发酵期不同糟层所产基酒品质及用途的区分提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究所用基酒样品均取自四川泸州某代表性浓香型白酒酒厂,选取同一个车间内12口窖池,其中6口窖池发酵周期短,另外6口窖池发酵周期长。将每口窖池除去窖帽糟醅后,分为上中下3层糟醅摘酒,在摘酒过程中,选取二段酒作为研究对象,其流酒温度25～35 ℃,流酒速度3～4 kg/min。取6口窖池两种不同发酵期的糟醅酒样共36个样品(共6组对照,每组对照6个平行),其酒精度在72%vol左右,其中发酵期短的上中下3层糟醅所取基酒分别标记为SU(Short Upper)、SM(Short Middle)和SL(Short Lower),统称为S(Short)类基酒,发酵期长的上中下3层糟醅所取基酒分别标记为LU(Long Upper)、LM(Long Middle)和LL(Long Lower),统称为L(Long)类基酒。
NaCl(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;NaH2PO4,上海麦克林生化科技股份有限公司;2-辛醇、甲醇、乙酸、乳酸、丁酸、己酸(色谱纯),上海安谱璀世标准技术服务有限公司;乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、己酸丙酯、己酸丁酯、己酸戊酯、己酸异戊酯、己酸己酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、丙醇、正丁醇、2-丁醇、异丁醇、异戊醇、1-戊醇、2-戊醇、正己醇、丙酮、乙醛、2-甲基丁醛、异戊醛,以上29种标品均购自北京中科质检生物技术有限公司,纯度均≥97.0%。
1.2 仪器与设备
DF-101S集热式磁力加热搅拌器,江苏金怡仪器科技有限公司;100 μm PDMS萃取头,上海安谱实验科技股份有限公司;LC-20AT HPLC、QP2020 NX GCMS、2010PLUS GC-FID,日本岛津有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 4种有机酸的测定
1.3.1.1 样品预处理
将5 mL基酒酒样稀释10倍并混匀,经0.22 μm的水系滤膜过滤后取1.5 mL进行乙酸、乳酸、丁酸和己酸检测。
1.3.1.2 标准曲线绘制
取一定量的乙酸、乳酸、丁酸和己酸标品用水定容至1 000 mL容量瓶中,获得4.0 g/L的混标,然后将混标进行梯度稀释获得2.0、1.0、0.5、0.1、0.05 g/L的混合标准品建立标准曲线。
1.3.1.3 高效液相色谱法条件
根据文献[15]修改,使用色谱柱为Atlanis T3(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相0.02 mol/L NaH2PO4水溶液(用磷酸调节 pH 2.7)(流动相A)-甲醇(流动相B),进样量为10 μL,柱温为40 ℃,紫外检测波长设置为210 nm,流速为0.6 mL/min,梯度洗脱:0～7 min,5% A,95% B;7～21 min,27% A,73% B;21～45 min,50% A,50% B;45～50 min,1% A,99% B;50～60 min,4% A,96% B。
1.3.2 GC-FID测定含量较多的挥发性物质
1.3.2.1 样品预处理
参考文献[16]的方法,以体积分数50%的乙醇为基体,配制含叔戊醇和乙酸正戊酯的内标混合液,然后用水稀释样品至酒精度50% vol,准确吸取10 mL酒样,添加0.1 mL内标液混匀取1.5 mL进样,进样量1.0 μL。
1.3.2.2 GC-FID条件
GC条件:DB-WAX交联石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),起始柱温35 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至80 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升至100 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至160 ℃,保持2 min,最后以10 ℃/min升至230 ℃,保持18 min。载气为高纯N2,全部采取分流进样,分流比为1∶40,色谱进样量1 μL。FID检测器,温度250 ℃。
1.3.2.3 风味物质定性与定量
参考文献[2,17]选取浓香型白酒中挥发性物质含量较高(大于10 mg/L)且常见的29种物质,如1.1节标品所示,将标品依次稀释成一系列梯度,以目标化合物与内标质量浓度比为横坐标,峰面积比为纵坐标,建立标准曲线,通过标准曲线定量酒样中含量较高的挥发性物质。
1.3.3 HS-SPME-GC-MS测定微量挥发性物质
1.3.3.1 样品预处理
参考文献[15]的方法,用水稀释样品至酒精度10% vol,吸取5.0 mL至20 mL顶空瓶中,加入2.0 g NaCl和2-辛醇内标液20 μL。在60 ℃的集热式磁力加热搅拌器中水浴平衡5 min,其转速为200 r/min,随后插入萃取头顶空吸附45 min,最后插入GC进样口,在250 ℃下热解析5 min,进行GC-MS定性及定量分析。
1.3.3.2 气相色谱-质谱条件
色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱(60 m×0.25 um,0.25 mm);升温程序:40 ℃保持5 min,以4 ℃/min 升至100 ℃,再以6 ℃/min升温至230 ℃,保持10 min;载气(He)流速1.0 mL/min,采用不分流模式进样,压力112.0 kPa。质谱条件为离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃,检测电压绝对值0.9 kV,质量数扫描范围m/z 45.00～450.00。
1.3.3.3 定性定量分析
通过NIST谱库进行定性分析,通过各化合物峰面积与内标物质峰面积比较,计算出各微量风味物质的相对含量。
1.3.4 OAV计算
OAV是指某物质的质量浓度与该物质的嗅觉阈值的比值,可用来表示酒体中香气物质对主体香气成分的贡献,当OAV>1时,表明该香气成分对样本香气有直接贡献[18]。
1.3.5 感官品评
参考GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求 第1部分:浓香型白酒》以及GB/T 33404—2016 《白酒感官品评导则》的感官要求,由10 名企业品酒师通过明酒明评法对酒样进行评定,总分100分,评分标准参考《泸型酒技艺大全》[19]。
1.4 数据及图像处理
所有试验均进行3次,利用IBM SPSS Statistics 25对数据进行单因素方差分析、Z-score标准化,并采用SIMCA 14.1对挥发性风味物质进行PLS-DA分析,计算预测变量重要性投影(variable importance in projection, VIP);Origin 2018绘制柱状图、聚类热图。
2 结果与分析
2.1 感官评定
对不同发酵期不同糟层所取基酒进行感官品评,品评结果如表1所示。相同糟层在不同发酵期之间具有显著性差异,且L类基酒评分要显著高于S类基酒的评分;从不同糟层所产基酒分析,不论是S类基酒还是L类基酒,其上层基酒评分与中层和下层基酒之间都出现了显著性差异,且中层和下层基酒都要显著高于上层基酒的评分。在香气上,S类基酒粮香比较突出,而L类基酒浓香较为突出,且从上层至下层基酒窖香逐渐增强;在口感上,S类基酒和L类基酒口感的演变趋势都有一定的相似性,上层至下层基酒从单薄、味短、苦涩,演变到酒体干净、略涩,其酒体逐渐形成,涩味逐渐减弱。宋瑞滨等[4]研究表明,延长发酵期可使醇、酯、酸、醛等各类产物更协调丰富,使酒香气浓郁、爽口味长,是极好的精华酒。故在勾调时可以向缺失某些香气或味道的基酒中添加因糟层不同或发酵时间长而具有相应风味的基酒,使成品酒品质提高。
表1 不同发酵期不同糟层所产基酒感官评价
Table 1 Sensory evaluation of crude Baijiu produced by different layers in different fermentation cycles
酒样编号评分感官描述SU82.50±0.50Bb粮香,后味短,后味苦涩,酒体单薄SM85.00±0.87Ab粮香,香味弱,较干净,后味涩SL85.17±1.04Ab粮香,香味浓,比较干净,后味略涩LU87.33±0.29Ba较浓香,甜,窖香较差,味短LM88.50±0.87ABa浓香,甜,有窖香,较干净,后味涩LL88.83±0.76Aa浓香,甜,窖香突出,较干净,后味略涩
注:上标大写字母表示同一发酵期不同糟层的基酒存在差异显著(P<0.05);上标小写字母表示同一糟层不同发酵期的基酒存在差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 乙酸、乳酸、丁酸和己酸含量分析
乙酸、乳酸、丁酸和己酸是浓香型白酒中四大主体酸,简称“四大酸”,其总含量占总有机酸含量的90%以上,是形成浓香型白酒四大酯(乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯)的前体物质,对浓香型白酒主体风格的形成具有重要作用[20]。不同的酸类物质对酒体的影响不同,乙酸具有刺鼻的酸味,起呈味抑香作用,适量则爽口[21];乳酸是4种酸中最难挥发的有机酸,具有淡淡的酸牛奶味[22],适量的乳酸可使酒体柔和醇厚;丁酸和己酸是形成窖香的重要酸类物质,适量的丁酸呈愉快的水果香、大曲香和糟香,己酸呈甜香、水果香,两者过量都会呈现汗臭味和酸臭味[23-24]。不同发酵期不同糟层所产基酒的4种酸总量和4种酸含量都存在显著性差异(图1)。
a-4种酸总量;b-4种酸含量
图1 不同发酵期不同糟层所产基酒4种酸含量分析
Fig.1 Analysis of four acids in crude Baijiu produced by different layers of grains in different fermentation cycles
从4种酸总量分析(图1-a),由于下层糟醅直接与下沉的黄水和窖泥接触,黄水和窖泥中具有丰富可以代谢产酸的微生物,且下层糟醅溶氧系数低,更利于产酸菌代谢产生各种有机酸[25],此外,有机酸会随着发酵时间的延长不断积累富集至相对稳定[26],所以不论是S类基酒还是L类基酒,其含量从上层至下层基酒都呈现逐渐增加的趋势,且L类基酒4种酸总量都要高于S类基酒,与余松柏等[27]研究结果一致。
从4种酸单个的含量分析(图1-b),除乳酸外,S类基酒和L类基酒乙酸、丁酸和己酸下层基酒含量都显著高于上层基酒含量,且下层基酒含量与中层基酒含量较为相近;随着发酵时间的延长,3种有机酸也呈现逐渐增加的趋势,与总酸呈现的趋势相同。乳酸则随着发酵时间的延长出现下降的趋势,在S类基酒中,SU与SL乳酸含量出现显著性差异,与尹倩倩等[28]研究结果一致;但在L类基酒中,3个糟层乳酸含量未出现显著性差异,且比S类基酒各个糟层乳酸含量都有下降趋势。此外,S类基酒4种酸含量关系为乙酸>乳酸>己酸>丁酸,但随着发酵时间的延长,L类基酒己酸含量明显高于乙酸含量,含量关系也变为己酸>乙酸>丁酸>乳酸。
2.3 挥发性物质结构特征
采用直接进样结合GC-FID定性定量基酒中含量较高的乙酸乙酯、己酸乙酯等29种挥发性物质,HS-SPME结合GC-MS定性定量其余微量物质,其色谱图如图2所示。除2.2节分析过的4种酸和乙醇外,共检测出167种挥发性物质,其中酯类物质88种,醇类物质20种,酸类物质7种,醛类物质17种,酮类物质10种和其他类物质25种。
a-GC-FID;b-GC-MS
图2 总离子流图
Fig.2 Total ion flow diagrams
a-种类个数;b-种类占比
图3 不同发酵期不同糟层所产基酒挥发性物质种类
Fig.3 Types of volatile substances in crude Baijiu produced by different layers of grains in different fermentation cycles
对SU检测出154种、SM检测出153种、SL检测出157种、LU检测出157种、LM检测出158种以及LL检测出158种挥发性物质作种类数量条形图(图3-a)。从总量分析,不同发酵期不同糟层所产基酒挥发性物质种类数量未出现显著性差异。本研究出现SU种类数量大于SM的现象,一方面是由于本试验采用气相和气质联用检测糟醅中蒸馏出酒样的挥发性成分,其中有糟醅通过蒸馏冷凝到酒样中的,并且上层糟醅发酵相对于下层不完全,所以上层种类数量也有大于下层的时候,可从牟薏等[29]的研究中得到佐证;另一方面是可能是多个窖池样品导致的。
从分类情况分析,酯类物质种类最多,随着发酵时间的延长,L类基酒中种类数量出现增加,且各层趋于平稳;在种类占比上,不论是S类基酒还是L类基酒,都达到了50%以上(图3-b)。醇类和酸类物质在各层、各发酵期之间都相对平稳,酸类和酮类物质种类随发酵时间的延长则有少量增加;醛类物质随发酵时间的延长则出现明显的减少,其他类物质随发酵时间的延长有少量减少。各类物质在各糟层之间种类及其占比都相对平稳。
对不同发酵期、不同糟层检测出的挥发性物质作韦恩网络图(图4),发现S类基酒和L类基酒共同有138种挥发性物质,S类基酒共同有149种挥发性物质,L类基酒共同有153种挥发性物质,S类和L类上层基酒共同有146种挥发性物质、中层基酒共同有144种挥发性物质、下层基酒共同有148种挥发性物质。其中S类基酒中含有而L类基酒中没有的挥发性物质为:椰子醛、苯乙烯、4-十一醇、2-十一烯醛、(E)-壬烯醛和反式-2-癸烯醛,多数为醇类、醛类物质,L类基酒中含有而S类基酒中没有的挥发性物质为:庚酸异丁酯、己酸-2-丁烯酯、(Z)-十五碳-6-烯-2-酮、癸酸丁酯、4-甲基苯酚,多数为酯类物质。
图4 挥发性物质韦恩网络图
Fig.4 Venn network diagram of volatile substances
2.4 挥发性物质差异分析
2.4.1 不同发酵期挥发性物质差异分析
为找出不同发酵期关键性差异物质,对S类和L类上中下3层糟醅所产基酒分别进行差异分析。PLS-DA如图5-a～图5-c所示,不同发酵期相同糟醅所产基酒挥发性物质组成特点差异明显,S类基酒都位于第二、三象限,平行组之间相对分散,L类基酒位于第一、四象限,平行组之间相对集中,说明随着发酵时间的延长,各窖池之间的差异在逐渐减小。且经200次置换检验验证后Q2<0,说明该模型可以用于不同发酵期相同糟层所产基酒之间的差异物质判别分析。根据模型筛选VIP>1的挥发性物质,上中下分别发现71、86、86种差异性物质,再根据文献查找香气阈值[23, 30-33],各筛选出22、26和23种OAV>1关键性差异物质,对这28种关键性差异物质作韦恩网络图(图5-d),筛选出18种上中下3层糟醅所产基酒共有的关键性差异物质,最后使用Z-score标准化每种关键性差异物质的含量并绘制聚类热图(图5-e)。
a-上层基酒PLS-DA图;b-中层基酒PLS-DA图;c-下层基酒PLS-DA图;d-3层基酒关键性差异物质韦恩网络图;e-3层基酒共同关键性差异物质聚类热图
图5 不同发酵期相同糟层PLS-DA图、关键性差异物质韦恩网络图及聚类热图
Fig.5 PLS-DA diagram, Venn network diagram and cluster heatmap of the same layer of grains at different fermentation cycles
在18种关键性差异物质中,L类基酒含量高的9种物质均为酯类物质。其中己酸乙酯呈甜香、水果香、青瓜香、窖香,己酸丁酯呈菠萝香,己酸异戊酯和己酸己酯都呈苹果香[23],以上4种酯类均以梭菌属为主的己酸菌合成己酸为主要的前体物质合成[34],与2.2节己酸随着发酵时间的延长而增加的趋势相符。丁酸乙酯属于四大酸之一,辛酸乙酯虽然不属于四大酯的范畴,但其OAV是仅次于己酸乙酯的第二大酯类,这两种酯类皆是浓香型白酒中具有重要影响的香气物质[35],与余下3种脂肪酸乙酯类物质都呈现不同程度的花香、水果香和甜香[23],这5种脂肪酸乙酯类物质含量都随着发酵时间的延长出现增加,使基酒香气增强,与2.1节感官品定基酒具有浓香、甜香和窖香息息相关。
S类基酒含量高的9种物质中,乙酸乙酯为四大酯之一,具有菠萝香、苹果香、水果香[23],可通过生香酵母将糖分解成乙酸和乙醇经胞内酯化酶合成、在胞外酶作用下利用残存乙酸与乙醇酯化合成以及其他微生物在生物代谢时合成[36],其含量与大曲质量和酿酒工艺有关[37],从本研究来看,随着发酵时间的延长出现下降现象,与彭奎等[38]的研究结果一致。异戊醛、苯乙醛和乙缩醛都呈花香、水果香[25],前二者被认为是白酒中的香气物质,且苯乙醛已被证实对粮香有贡献作用[39];乙缩醛则由乙醛和醇产生,有助白酒放香,但过多则会出现涩口燥辣感[40];异戊醇适量时可使酒体醇厚,赋予白酒花香、水果香,过量也会使酒体苦涩并使人“易醉”,其合成途径有两条分别是氨基酸分解代谢途径(异戊醛为中间物质)和氨基酸合成代谢途径[41-42];壬醛呈肥皂、青草、水腥味[23],这4种醛类和1种醇类物质随着发酵时间的延长会被酯化成酯类物质,含量减少,可提高饮用白酒的舒适度和提升白酒健康成分[40]。萘和3-苯丙酸乙酯为芳香族化合物,两者在L类基酒中含量都下降,前者呈樟脑丸味,后者呈蜜菠萝、水果甜香[23]。棕榈酸乙酯呈微弱蜡香和奶油香气,适量可增加酒体醇厚感,主要来源于原料中脂肪分解棕榈酸和乙醇在酯酶作用下合成,在酸性条件下被降解[43],随着发酵时间的延长窖内酸性会增强,故在L类基酒中含量减少。
在这几种差异物质中,宋瑞滨等[4]研究发现,己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯和庚酸乙酯随着发酵时间的延长增加,乙缩醛、异戊醛和异戊醇随着发酵时间的延长减少,与本研究相同。但他们发现乙酸乙酯和棕榈酸乙酯随着发酵时间的延长含量增加,与本研究随着发酵时间的延长含量减少的现象不同。
2.4.2 不同糟层所产基酒挥发性物质差异分析
为找出不同糟层关键差异物质,对S类和L类基酒分别进行糟层间的差异分析。PLS-DA如图6-a和图6-b所示,S类基酒不同糟醅所产基酒挥发性物质组成特点差异明显,上中下呈逐渐过渡关系,而L类基酒上层在第一、四象限,中层在第三象限,下层在第二象限,说明随着发酵时间的延长,下层基酒与中层基酒组间差异缩小。且经200次置换检验验证后Q2<0,说明该模型可以用于同一发酵期不同糟层所产基酒之间的差异物质判别分析。根据模型筛选VIP>1的挥发性物质,S类和L类基酒分别发现48和50种差异物质,再根据文献查找香气阈值[23, 30-33],各筛选出26和20种OAV>1关键性差异物质,对这29种关键性差异物质作韦恩网络图(图6-c),筛选出17种S类和L类基酒共同的关键性差异物质,最后使用Z-score标准化每种关键性差异物质的含量并绘制聚类热图(图6-d)。
a-S类基酒PLS-DA图;b-L类基酒PLS-DA图;c-关键性差异物质韦恩网络图;d-共同关键性差异物质聚类热图
图6 同一发酵期不同糟层PLS-DA图、关键性差异物质韦恩网络图及聚类热图
Fig.6 PLS-DA diagram, Venn network diagram and cluster heatmap of different grains layers in the same fermentation cycle
在17种关键性差异物质中,正丁醇、异戊醛、丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯和癸酸乙酯这6种物质无论是在S类基酒中,还是L类基酒中,皆在下层基酒含量最高,且从上至下逐渐增加,乙缩醛皆在上层基酒中含量最高。乳酸乙酯在L类基酒中上层含量最低,中下层基酒含量高,在S类基酒中上层含量最高,中下层基酒含量低,且L类基酒中含量普遍比S类基酒中的含量低,其余9种物质都在中上层基酒或中下层基酒含量较多,如乙醛、乙酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸丁酯、己酸异戊酯和苯乙酸乙酯在中下层基酒中含量居多,苯乙醛和月癸酸乙酯在中上层基酒中含量居多,这些都是具有花香、甜香、水果香等香气物质[23]。
在这些关键性差异物质中,可以发现不同糟层对浓香型基酒和不同发酵期对浓香型基酒的风味物质含量影响有很多相似之处。如庚酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、己酸丁酯、己酸异戊酯、苯乙酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯和乙酸苯乙酯,随着发酵时间的延长,其各层含量都呈逐渐增加趋势,这10种酯类物质对白酒香气都有助益作用。此外,也有随着发酵时间的延长出现下降的物质,如乙醛、葵酸乙酯、异戊酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醛、乙缩醛、正丁醇、异戊醛、乙酸乙酯、乳酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、壬醛、棕榈酸乙酯和萘这14种挥发性物质。乙酸乙酯和乳酸乙酯含量过高会出现放香不足、香气不正、典型性差、后味涩杂等方面问题[44-45],在本研究中随着发酵时间的延长而下降,说明延长发酵期也可达到“增己控乙”、“增己降乳”的作用。
但发酵期并不是越长越好,其也有很多弊端。宋瑞滨等[4]研究发现,浓香型白酒最佳发酵期为180～300 d,如发酵600 d的基酒质量远不如发酵60 d的基酒质量。赵荣寿等[46]研究浓香型白酒时发现,随着发酵时间的延长,其基酒的出酒率最高下降9.04%,虽然很多酒企在长发酵期中增加了回酒发酵、回酒蒸馏、翻沙发酵等工艺来增加窖池的生产能力和优质酒比率,其单轮出酒率和优质率有所上升,但其投入的时间成本、劳动成本增加,会很大程度上提高白酒的生产成本。此外,长发酵期糟醅利用更加彻底,若再利用其进入多轮次发酵出酒率就会显著下降,难以持续多轮次发酵[19]。
3 讨论
本实验以两种发酵期的3个糟层所产基酒作为研究对象,利用HPLC、GC-FID和HS-SPME-GC-MS技术对其进行检测分析,发现不同发酵期对浓香型基酒不同糟层的风味影响不同。4种酸(乙酸、乳酸、丁酸和己酸)除乳酸随着发酵时间减少外,其他3种有机酸下层基酒含量都显著高于上层基酒含量,且随着发酵时间的延长,显著增加,与4种酸总量呈现的趋势相同。除4种酸和乙醇外,共检测出167种挥发性物质,其中SU检测出154种、SM检测出153种、SL检测出157种、LU检测出157种、LM检测出158种以及LL检测出158种挥发性物质,不同发酵期对浓香型基酒不同糟层的风味数量影响不同,随着发酵时间的延长,中上层风味物质种类数量显著性增加,下层种类数量未出现显著性差异。
为找出不同发酵期关键性差异物质,对两种发酵期上中下3层糟醅所产基酒分别进行差异分析,经偏最小二乘判别分析和香气活度值筛选出关键性差异物质,在这些关键性差异物质中,可以发现不同糟层对浓香型基酒和不同发酵期对浓香型基酒的风味物质含量影响有很多相似之处。如庚酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、己酸丁酯、己酸异戊酯、苯乙酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯和乙酸苯乙酯,随着发酵时间的延长,其各层含量都呈逐渐增加趋势。此外,也有随着发酵时间的延长出现下降的物质,如乙醛、葵酸乙酯、异戊酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醛、乙缩醛、正丁醇、异戊醛、乙酸乙酯、乳酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、壬醛、棕榈酸乙酯和萘这14种挥发性物质。
该实验通过对不同发酵期浓香型基酒在不同糟层的风味成分对比分析,建议将短发酵期基酒作为基础酒,将成本更高昂的长发酵期基酒作为调味酒,根据各个层次风味物质含量差异所体现的香气强弱不同,作不同品质的调味酒,使企业的成品酒质量由差转优或优中更优,对进一步优化浓香型白酒生产、勾调、提升成品酒品质具有一定的指导意义。但本次研究也存在一定不足:对不同发酵期不同糟层基酒的感官评定不够细致,未能将差异性物质和感官作关联性分析,对微环境和微生物的关系以及一些挥发性物质的增加或减少的机理还有待进一步探究。
[1] 沈才萍, 李喆, 敖宗华, 等.泸型酒生产中不同层糟醅微生物与白酒风味的关系[J].四川理工学院学报(自然科学版), 2013, 26(5):14-18.
SHEN C P, LI Z, AO Z H, et al.Relationship between liquor flavor and fermented grain microbes in different depths in the same pit in Luzhou Laojiao[J].Journal of Sichuan University of Science &Engineering (Natural Science Edition), 2013, 26(5):14-18.
[2] 段明松, 胡晓龙, 曾田, 等.不同空间位置的浓香型原酒中香气成分的差异性分析[J].酿酒科技, 2019(1):126-130;135.
DUAN M S, HU X L, ZENG T, et al.Difference in flavoring components in Nongxiang base liquor from different positions of fermented grains in pit[J].Liquor-Making Science &Technology, 2019(1):126-130;135.
[3] 李大和, 李国红.提高浓香型白酒质量的技术措施(四)[J].酿酒科技, 2020(12):71-82.
LI D H, LI G H.Technical measures for improving the quality of Nongxiang Baijiu(Ⅳ)[J].Liquor-Making Science &Technology, 2020(12):71-82.
[4] 宋瑞滨, 邵泽良, 宋军, 等.多粮浓香型白酒连续超长发酵期生产工艺探讨[J].酿酒, 2020, 47(1):105-112.
SONG R B, SHAO Z L, SONG J, et al.Discussion on production technology of multi-grain Luzhou-flavor liquor during continuous and super-long fermentation period[J].Liquor Making, 2020, 47(1):105-112.
[5] WANG G N, JING S, WANG X L, et al.Evaluation of the perceptual interaction among ester odorants and nonvolatile organic acids in Baijiu by GC-MS, GC-O, odor threshold, and sensory analysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2022, 70(43):13987-13995.
[6] WANG G N, SONG X B, ZHU L, et al.A flavoromics strategy for the differentiation of different types of Baijiu according to the non-volatile organic acids[J].Food Chemistry, 2022, 374:131641.
[7] NIU Y W, YANG Y L, MAO C T, et al.Effects of Gallic acid on the release of aroma compounds in Moutai Baijiu[J].Food Research International, 2024, 176:113655.
[8] ZHANG X J, MENG L J, LU Z M, et al.Identification of age-markers based on profiling of Baijiu volatiles over a two-year maturation period:Case study of Lu-flavor Baijiu[J].LWT, 2021, 141:110913.
[9] LIU Z H, GUO J.Preparation and antioxidant activity of purple potato wine[J].The Open Biomedical Engineering Journal, 2015, 9:282-287.
[10] YUAN L, LI G F, YAN N, et al.Optimization of fermentation conditions for fermented green jujube wine and its quality analysis during winemaking[J].Journal of Food Science and Technology, 2022, 59(1):288-299.
[11] HAO Y F, LI J X, ZHAO Z H, et al.Flavor characteristics of Shanlan rice wines fermented for different time based on HS-SPME-GC-MS-O, HS-GC-IMS, and electronic sensory analyses[J].Food Chemistry, 2024, 432:137150.
[12] 舒代兰, 张丽莺, 张文学, 等.浓香型白酒糟醅发酵过程中香气成分的变化趋势[J].食品科学, 2007, 28(6):89-92.
SHU D L, ZHANG L Y, ZHANG W X, et al.Variation of flavor components in Zaopei of Luzhou-flavor liquor during fermentation[J].Food Science, 2007, 28(6):89-92.
[13] 高玲, 许冠生, 张磊, 等.浓香型白酒糟醅发酵过程中主要参数的跟踪研究[J].酿酒科技, 2018(1):47-53.
GAO L, XU G S, ZHANG L, et al.Tracing study of main parameters in the fermentation process of Nongxiang fermented grains[J].Liquor-Making Science &Technology, 2018(1):47-53.
[14] 卫春会, 郑自强, 李浩, 等.浓香型白酒酒醅发酵过程中风味物质时空差异分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(5):240-246.
WEI C H, ZHENG Z Q, LI H, et al.Time and spatial distribution difference of flavor compounds during the fermentation of fermented grains of Luzhou-flavor Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(5):240-246.
[15] 张榆俊, 张宿义, 张楷正, 等.浓香型白酒发酵过程中黄水与酒醅的相关性[J].中国酿造, 2023, 42(5):35-40.
ZHANG Y J, ZHANG S Y, ZHANG K Z, et al.Correlation of the Huangshui and Jiupei of strong-flavor Baijiu[J].China Brewing, 2023, 42(5):35-40.
[16] 俞飞, 周健, 明红梅, 等.机械化与传统酿造方式的浓香型原酒风味成分对比[J].食品与发酵工业, 2021, 47(23):233-239.
YU F, ZHOU J, MING H M, et al.Characteristics of flavor components in strong-flavor Baijiu fermented by mechanization and traditional methods[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(23):233-239.
[17] 胥佳, 何朝玖, 马浩, 等.不同贮存年份的五粮浓香型白酒挥发性风味物质对比分析[J].食品与发酵科技, 2023, 59(3):23-29.
XU J, HE C J, MA H, et al.Preliminary analysis of volatile flavor substances in Wuliang strong fragrant Baijiu of different storage years[J].Food and Fermentation Science &Technology, 2023, 59(3):23-29.
[18] DONG W, GUO R N, LIU M, et al.Characterization of key odorants causing the roasted and mud-like aromas in strong-aroma types of base Baijiu[J].Food Research International, 2019, 125:108546.
[19] 张宿义, 许德富.泸型酒技艺大全[M].北京:中国轻工业出版社, 2011.
ZHANG S Y, XU D F.A Complete Collection of Lu-type Liquor Techniques[M].Beijing:China Light Industry Press, 2011.
[20] 张竞一, 柴丽娟, 高涛, 等.不同季节浓香型白酒基酒风味物质差异分析[J].食品科学, 2023, 44(12):164-171.
ZHANG J Y, CHAI L J, GAO T, et al.Seasonal variation of flavor substances in Chinese strong-flavor Baijiu base liquor[J].Food Science, 2023, 44(12):164-171.
[21] GIMÉNEZ-G
MEZ P, GUTIÉRREZ-CAPIT
N M, R
OS J M, et al.Microanalytical flow system for the simultaneous determination of acetic acid and free sulfur dioxide in wines[J].Food Chemistry, 2021, 346:128891.
[22] ESCOTT C, VAQUERO C, LOPEZ C, et al.Effect of acidification biotechnologies on the production of volatile compounds, lactic acid and colour in red wines after the use of pulsed light pretreatment in grapes[J].European Food Research and Technology, 2022, 248(10):2497-2507.
[23] 范文来, 徐岩.白酒79个风味化合物嗅觉阈值测定[J].酿酒, 2011, 38(4):80-84.
FAN W L, XU Y.Determination of odor thresholds of volatile aroma compounds in Baijiu by a forced-choice ascending concentration series method of limits[J].Liquor Making, 2011, 38(4):80-84.
[24] 吴文睿, 董琪, 刘露, 等.基于GC-MS和嗅闻仪联用浓香型白酒中窖泥臭味成分分析[J].中国酿造, 2021, 40(3):162-165.
WU W R, DONG Q, LIU L, et al.Analysis of pit mud odor substance in strong-flavor Baijiu by GC-MS combined with olfactometry[J].China Brewing, 2021, 40(3):162-165.
[25] 雷学俊, 杨康卓, 张建敏, 等.多粮浓香型白酒糟醅中香气成分的空间分布规律[J].食品与发酵工业, 2020, 46(21):48-54.
LEI X J, YANG K Z, ZHANG J M, et al.Spatial distribution of aroma compounds in fermented grains of multi-grains strong-aroma Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(21):48-54.
[26] 刘小刚. 浓香白酒糟长发酵期代谢机理解析及抗氧化醇溶肽的制备与鉴定[D].无锡:江南大学, 2023.
LIU X G.Analysis of metabolic mechanism of Luzhou-flavor liquor distiller’s grains in long fermentation period and preparation and identification of antioxidant gliadin peptides[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.
[27] 余松柏, 赵兴蓉, 邵燕, 等.浓香型白酒酒醅发酵过程中30种有机酸空间与时间的分布规律[J].食品与发酵工业, 2024, 50(14):297-307.
YU S B, ZHAO X R, SHAO Y, et al.Spatial and time distribution of 30 organic acids during fermentation in fermented grains of nongxiangxing Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(14):297-307.
[28] 尹倩倩, 刘双平, 秦辉, 等.浓香型白酒上下层原酒风味特征及影响因子分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(18):53-59.
YIN Q Q, LIU S P, QIN H, et al.Flavor characteristics and its influencing factors of original liquor of Luzhou-flavor Baijiu in the upper and lower layers of the cellar[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(18):53-59.
[29] 牟薏, 卫春会, 曾波, 等.基于黄水线上下层酒醅及基酒的风味特征分析[J].食品与发酵工业, 2024,50(19):321-330.
MOU Y, WEI C H, ZENG B, et al.Analysis of flavor characteristics of fermented grains and base liquor based on the huangshui fluid line[J].Food and Fermentation Industries, 2024,50(19):321-330.
[30] GAO W J, FAN W L, XU Y.Characterization of the key odorants in light aroma type Chinese liquor by gas chromatography-olfactometry, quantitative measurements, aroma recombination, and omission studies[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(25):5796-5804.
[31] ZHAO D R, SHI D M, SUN J Y, et al.Characterization of key aroma compounds in Gujinggong Chinese Baijiu by gas chromatography-olfactometry, quantitative measurements, and sensory evaluation[J].Food Research International, 2018, 105:616-627.
[32] 周庆云. 芝麻香型白酒风味物质研究[D].无锡:江南大学, 2015.
ZHOU Q Y.Study on flavor substances of sesame-flavor liquor[D].Wuxi:Jiangnan University, 2015.
[33] 张倩, 李沁娅, 黄明泉, 等.2种芝麻香型白酒中香气活性成分分析[J].食品科学, 2019, 40(14):214-222.
ZHANG Q, LI Q Y, HUANG M Q, et al.Analysis of odor-active compounds in 2 sesame-flavor Chinese baijius[J].Food Science, 2019, 40(14):214-222.
[34] ZHANG M, WU X, MU D, et al.Profiling the effects of physicochemical indexes on the microbial diversity and its aroma substances in pit mud[J].Letters in Applied Microbiology, 2020, 71(6):667-678.
[35] 李志斌, 李净.浓香型白酒中的重要物质:辛酸乙酯含量及其贡献分析[J].酿酒, 2013, 40(3):33-36.
LI Z B, LI J.An important component in Luzhou flavor liquor-analysis of ethyl caprylate content and its contribution[J].Liquor Making, 2013, 40(3):33-36.
[36] HE G Q, XIE F, REN X, et al.Revealing the functional microbiota for acetic acid formation in Daqu starter for Chinese Nong-Xiang Baijiu fermentation[J].Food Bioscience, 2023, 53:102782.
[37] 刘明, 李袁林.浓香型原酒中“增己控乙” 的研究进展[J].酿酒科技, 2023(5):113-116.
LIU M, LI Y L.Research progress in increasing ethyl caproate content and controlling ethyl acetate content in Nongxiang Baijiu[J].Liquor-Making Science &Technology, 2023(5):113-116.
[38] 彭奎, 张磊, 杜鹏程, 等.延长浓香型白酒发酵周期对白酒产香的影响[J].食品研究与开发, 2023, 44(6):134-139.
PENG K, ZHANG L, DU P C, et al.Effects of prolonged fermentation period of Luzhou-flavored liquor on liquor aroma production[J].Food Research and Development, 2023, 44(6):134-139.
[39] 马宇. 基于风味组学策略研究酱香型白酒关键成分及其呈香呈味特性[D].贵阳:贵州大学, 2019.
MA Y.Study on the key components of Maotai-flavor liquor and its aroma and taste characteristics based on flavor genomics strategy[D].Guiyang:Guizhou University, 2019.
[40] 赖登燡, 罗德志, 赵文玲.乙醛、乙缩醛与白酒质量关系的研究[J].酿酒, 2001, 28(4):53-55.
LAI D Y, LUO D Z, ZHAO W L.Study on the relationship between acetaldehyde, acetal and liquor quality[J].Liquor-making, 2001, 28(4):53-55.
[41] LI W, CHEN S J, WANG J H, et al.Genetic engineering to alter carbon flux for various higher alcohol productions by Saccharomyces cerevisiae for Chinese Baijiu fermentation[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(4):1783-1795.
[42] 樊静雅, 谷欣哲, 梁清文, 等.白酒发酵过程中异戊醇合成机制与减控研究进展[J].中国酿造, 2023, 42(5):1-8.
FAN J Y, GU X Z, LIANG Q W, et al.Research progress in mechanism of isoamyl alcohol synthesis and its reduction control during Baijiu fermentation[J].China Brewing, 2023, 42(5):1-8.
[43] 马世源, 周健, 明红梅, 等.不同发酵醅层的浓香型原酒风味成分对比分析[J].酿酒科技, 2022(6):109-116.
MA S Y, ZHOU J, MING H M, et al.Preliminary study on the differences in flavor components of Nongxiang crude liquor from different layers of fermented grains[J].Liquor-Making Science &Technology, 2022(6):109-116.
[44] 刘平, 孙啸涛, 许德富, 等.浓香型白酒中主要异嗅味研究进展[J].食品与发酵工业, 2024,50(16):396-407.
LIU P, SUN X T, XU D F, et al.Research progress on main odors in Nongxiangxing Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2024,50(16):396-407.
[45] JIA W, FAN Z B, DU A, et al.Characterisation of key odorants causing honey aroma in Feng-flavour Baijiu during the 17-year ageing process by multivariate analysis combined with foodomics[J].Food Chemistry, 2022, 374:131764.
[46] 赵荣寿, 卓毓崇, 高占争, 等.浓香型白酒出酒率及主要香味成分随发酵时间的变化规律[J].酿酒科技, 2022(4):48-51.
ZHAO R S, ZHUO Y C, GAO Z Z, et al.Variation of liquor yield and main aroma components of Nongxiang Baijiu with fermentation time[J].Liquor-Making Science &Technology, 2022(4):48-51.