香气是评价茶叶品质的重要指标[1],由茶叶中各种挥发性物质以不同比例构成。其含量虽只占茶叶总干质量的0.01%～0.05%,但种类却多达600余种[2]。南川大树茶是重庆特色茶树资源,主要分布在海拔700～1 350 m的金佛山以南及柏枝山以东、三界山以北的地区[3],南川野生型大树茶为乔木和半乔木型,大叶种适制红茶,且浓强度高、品质好[4];其红茶整体风味特征为甜香浓郁、香气醇厚,具有丰富的花果香、植物香、烘烤香和发酵香,口味协调,余味悠长[5]。欧阳珂等[6]研究发现,二甲基硫为玉米香型南川大茶树工夫红茶的特征香气成分;张博闻[7]发现,β-紫罗酮可能是南川大树茶红茶中最关键的香气物质。可见,南川大茶树红茶因品种、地域或管理方式等不同,其香气品质风格不同。

海拔是影响茶树生长发育的重要环境因素[8-9],不仅对茶叶生化成分有显著影响[10-12],对香气的形成亦影响巨大。如唐颢等[13]研究发现,凤凰单丛茶中醇类、烯烃类、醛类、烷烃类、酯类等香气物质含量与海拔高度呈正相关。WANG等[14]研究发现,岭头单丛乌龙茶的香气特征和关键贡献者及其差异受海拔的影响。JIANG等[15]也研究发现,在海拔较高的铁观音茶树叶片中,苯甲醇、苯乙醇、苯乙酮等挥发性芳香族化合物最为丰富;1-己醇、1-丁醇和壬酸作为脂肪族香气的一种,在低海拔茶园中更为普遍。而南川大树茶普遍生长在高海拔区域,野生型大树茶难采摘、生长地域复杂且部分古茶树受保护等原因造成其原料稀少,价格偏高,制约着该特色品种的高质量发展。因而部分地区对其进行扦插繁殖,并进行标准化管理,使其树体有所矮化,但依然保持生长势强、芽叶肥壮、抗寒性与抗病性强等特征,所制茶叶品质优异。然而不同海拔茶园的该类南川大树茶品质特征及其差异未见报道。因此,本研究特选择现有不同海拔茶园的南川大树茶为研究对象,采用顶空固相微萃取联用气相色谱-质谱技术(headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC/MS)并结合多元统计分析方法,比较分析不同海拔南川大树茶所制工夫红茶挥发性物质特征及香气品质差异,以为不同海拔南川大树茶品质特征的区分提供参考,同时加大海拔、温度、光照等因素对品质变化影响机理机制的探索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用大树茶鲜叶原料分别于2023年4月采自重庆南川区南城街道(107°115 E, 29°141 N;海拔, 593 m,简称LA)及德隆镇茶树村(107°247 E, 28°893 N;海拔, 1 357 m,简称HA);采摘标准为一芽3～4叶。

NaCl(分析纯), 国药集团化学试剂有限公司;正己烷(色谱纯), 德国Merck公司;内标物质3-己酮(色谱纯), 加拿大CDN公司;建库标准品,云南西力生物技术股份有限公司和美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

8890-7000E GC-MS/MS仪、DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱、120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头,美国 Agilent公司;MM400球磨仪, 德国Retsch公司;MS105DU电子天平, 瑞士METTLER TOLEDO公司;SPME Arrow固相微萃取装置、Fiber Conditioning Station 老化装置、Agitator样品加热箱, 瑞士Analytics AG公司。

1.3 试验方法

1.3.1 南川大树茶鲜叶样品采集

取鲜叶200～300 g,经微波高火杀青1 min后重新摊铺,继续杀青1 min,杀青后叶样经80 ℃烘干,取样重复3次,该鲜叶样品分别命名为LA-FL1～LA-FL3,HA-FL1～HA-FL3。

1.3.2 南川大树茶红茶加工方法

不同海拔的南川大树茶鲜叶分别采用工夫红茶加工工艺进行加工,加工工艺及参数如下:

鲜叶→萎凋(18～20 h)→揉捻(约2 h)→发酵(约4 h)→烘干(100 ℃, 20 min;80 ℃, 15 min)

制得的红茶样品分别命名为LA-CB1～LA-CB3,HA-CB1～HA-CB3。

1.3.3 香气成分分析

1.3.3.1 香气组分的萃取

采用全自动HS-SPME进行样本萃取。样品经液氮研磨,涡旋混合均匀后准确称取0.5 g研磨茶样置于固相微萃取瓶中,加入饱和NaCl溶液,20 μL(10 μg/mL)内标溶液,在60 ℃恒温条件下,振荡5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS 萃取头插入样品顶空瓶,顶空萃取15 min,于250 ℃下解析5 min,然后进行GC-MS分离鉴定。采样前萃取头在Fiber Conditioning Station中 250 ℃下老化5 min。(注:新萃取头在萃取前在Fiber Conditioning Station中老化2 h。)

1.3.3.2 香气组分的解析

色谱柱:DB-5MS 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯He(≥99.999 %),恒流流速1.2 mL/min,进样口温度250 ℃,不分流进样,溶剂延迟3.5 min。程序升温:40 ℃ 保持3.5 min,以10 ℃/min 升至100 ℃,再以7 ℃/min 升至180 ℃,最后以25 ℃/min 升至280 ℃,保持5 min。

质谱条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,质谱接口温度280 ℃,电子能量70 eV,扫描方式为选择离子检测模式(SIM),定性定量离子精准扫描。

1.3.3.3 数据处理及质谱检索

定性分析:基于自建数据库,各试样经气相色谱-质谱分析后,所得总离子色谱图用MassHunter定量软件进行质谱定性定量分析[16],并采用内标半定量法计算样品中挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)的相对含量。

代谢物相对气味活度值(relative odor activity value,rOAV)分析:rOAV是结合化合物的感觉阈值建立的确定食品关键风味化合物的方法,用于阐明每种香气化合物对样品整体香气特征的贡献。VOCs的阈值,是指VOCs可嗅物质浓度到达一定的气味强度后,才会有明显的味道,相关物质阈值参考文献[17～19]。一般来说rOAV≥1,表明该化合物对样品风味有直接的贡献。参考文献[20-21]进行rOAV分析,按公式(1)计算:

(1)

式中:Ci,化合物的相对含量,μg/g;Ti,化合物的阈值,μg/g。

VOCs香气描述来源于:http://www.chemicalbook.com或http://perflavory.com/ 或http://www.thegoodscentscompany.com或http://www.odour.org.uk/odour/index.html 或 http://foodflavorlab.cn/#/home。

1.3.4 感官审评方法

由5位高级评茶员按GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》对茶叶香气品质进行因子审评,包括甜度、浓度、纯度、丰富性和持久性,每个因子评分范围为0～10,各因子表现越突出得分越高。

1.4 数据统计与分析

采用主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)等方法进行数据统计分析,两组间代谢物差异的过滤标准为:VIP值>1,差异倍数(fold change,FC)变化>2或<0.5;筛选出的差异代谢物在KEGG物质数据库(https://www.kegg.jp/kegg/compound/)中进行了注释,同时将注释代谢产物映射到KEGG通路数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathment.html)进行代谢途径富集分析。相关性聚类分析热图及其他采用Tbtools、Origin 2019、Graphpad Prism 9.5等软件进行数据分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 不同海拔南川大树茶挥发性物质特征

对不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶香气物质进行分析,鲜叶中检测出15类,574种物质,红茶较鲜叶多检测出1类物质(醚类),共检测出16类,575种物质。鲜叶和红茶中物质种类较丰富的主要是萜类、酯类、杂环化合物、烃类、酮类等,各类物质种类占比见图1-a、图1-b。

由图2-a可知,不同海拔南川大树茶鲜叶中LA-FL总量(49.09 μg/g)较HA-FL稍高(44.68 μg/g),但差异不显著;含量较高的物质类型是烃类、杂环类、酯类、萜类、醛类、酮类化合物等,其中LA-FL中烃类(11.14 μg/g)、杂环类(7.76 μg/g)、酯类(7.54 μg/g)、萜类(5.52 μg/g)均稍高于HA-FL,但差异均不显著(图2-b)。而南川大树茶红茶中LA-CB总量(148.67 μg/g)极显著高于HA-CB(104.27 μg/g)(图2-a,P<0.05);含量较高的物质类型依次是酯类、杂环类化合物、萜类、醛类、醇类等,同样在LA-CB中含量较高,较HA-CB分别高8.12、13.04、8.72、3.59、3.27 μg/g,差异显著(P<0.05)(图2-c)。综上,不同海拔鲜叶之间的总挥发性物质没有显著差异,但是成品茶却差异显著,其原因可能是由于香气前体物质的含量差异及加工环境与工艺引起的转化程度所导致,如萜烯醇类物质的生物合成,它们在茶树体内通常以葡糖苷形式存在[22],在转化的过程中由葡糖苷水解酶水解形成,受相关酶类活性的影响[23]。

从鲜叶加工成红茶,LA-CB各类挥发性物质较LA-FL含量均明显增加,其中LA-CB较LA-FL总量增加99.59 μg/g,HA-CB较HA-FL总量增加59.58 μg/g,说明LA-CB红茶香气更丰富。红茶中含量增加较多的挥发性物质种类基本一致,分别是酯类、萜类、杂环类化合物、醇类、醛类。而HA-CB中烃类及其他类物质较鲜叶呈减少的趋势(图2-d)。

2.2 不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶差异挥发性代谢物筛选

采用PCA对不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶非挥发性物质进行鉴别。结果表明,不同海拔2组鲜叶和成茶样本之间的总体差异明显,样本的3次重复被聚类在一起,前2个主成分累积贡献度占比90.30%(PC1=69.98%,PC2=20.32%)(图3-a)。进一步采用OPLS-DA分别对不同海拔(HA-LA)2组鲜叶和成茶样本差异成分进行有监督的判别分析。结果表明,HA-LA鲜叶组OPLS-DA模型Q2值达0.865,R2Y=0.999(图3-b),LA-HA红茶组OPLS-DA模型Q2值达0.955,R2Y=1(图3-c),说明两预测模型稳定可靠,可用此模型筛选差异代谢物。同时以显著差异标准VIP>1,FC≥2或FC≤1/2筛选差异代谢物,HA-FL vs LA-FL筛选出113种差异代谢物,HA-CBvs LA-CB筛选出179种差异代谢物,其中共同含有的差异代谢物40种(图3-d),可以看出经加工后的红茶香气物质种类明显增多;而共同含有的40种差异代谢物极大可能是由海拔高度变化引起的。

2.3 不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶挥发性差异代谢物分析

从不同海拔南川大树茶鲜叶挥发性差异代谢物热图(图4-a)可见,LA-FL中差异代谢物含量较高且数量占比较重(72.5%),HA-FL中主要差异代谢物包含萜类代谢物9种,含量较高有α-松油醇、3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯、β-罗勒烯、γ-芹子烯等;杂环类代谢物5种,含量较高有乙酰吡嗪、1H-吡咯-2-腈、1H-吡咯-3-腈等;酯类代谢物4种,分别是(4,6,8,9-四甲基-3-氧杂双环[3.3.1]非6-烯-1-基)乙酸甲酯、己酸己酯、酒石酸二乙酯、己酸-2-苯乙酯;醇类代谢物3种,分别是3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇、脱氢芳樟醇、乙酸-2-甲基丁-2-烯-1-醇。

从不同海拔南川大树茶红茶挥发性差异代谢物热图(图4-b)可见,LA-CB与LA-FL表现一致,差异代谢物含量较高且数量占比达81.01 %,主要包括萜类代谢物43种,含量较高的有3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯、萜品油烯、紫苏烯、芳樟醇、β-罗勒烯等;酯类代谢物29种,含量较高的有(E)-3-辛烯基乙酸酯、辛酸戊-2-基酯、己酸己酯、苯甲酸苄酯、(4-甲基-1-丙烷-2-基-3-双环[3.1.0]己基)乙酸酯、对乙氧基苯甲酸乙酯等;杂环类代谢物27种,含量较高的有顺式芳樟醇吡喃氧化物、2(1H)-吡啶酮、1,2,4,5-四嗪-3-胺、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪等;醛类代谢物9种,苯甲醛、可可醛、3,6-壬二烯醛、3-甲基苯甲醛、4-甲基-苯甲醛等。

2.4 不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶挥发性差异代谢物KEGG分析

KEGG数据库可以将代谢物和表达信息作为一个整体网络进行研究。为了更全面地了解高低海拔的地域特性对大树茶生长发育及次生代谢物含量的影响,本文对鉴定到的差异代谢物进行了KEGG注释和富集分析。结果显示,HA-FL vs LA-FL挥发性差异代谢物中有30种被注释到,其中6种上调,24种下调(图5-a);并映射到8个代谢通路中,其中单萜类生物合成途径差异代谢物富集程度最高(P值<0.01)且被注释到的化合物较多(6种),其次是次生代谢产物的生物合成途径,2种途径代谢物表达整体变化均呈下调趋势(图5-b)。而HA-CB vs LA-CB挥发性差异代谢物中有46种被注释到,其中13种上调,33种下调(图5-a);并映射到9个代谢通路中,其中异喹啉生物碱生物合成、叶酸合成途径富集程度较高,代谢物表达整体变化均呈上调趋势(图5-c)。

2.5 不同海拔南川大树茶红茶香气品质特征及差异代谢物风味组学分析

香气是由茶叶中不同含量及不同比例的挥发性物质组合而被人体嗅觉感官感知形成的一种综合感受。现阶段,茶叶的香气品质主要由具有丰富经验且掌握审评技能的专业人才判别。经5位专业人员感官审评,南川大树红茶香气品质主要表现为果甜香。其中HA-CB表现出甜香高锐的特征,LA-CB则更表现为甜香浓郁、丰富而持久(图6)。然而其具体的物质组成则更为复杂。而通过对挥发性代谢物的感官分析可以更客观地反映不同样本的感官风味特征。因此,本文对HA-CB、LA-CB鉴定得到的179种差异代谢物的感官风味特征进行注释,得到各风味特征的差异代谢物风味轮(图7)。可见,注释到的前10种代谢物数量最多的感官风味特征分别为果香(26种)、甜香(20种)、生青(16种)、花香(16种)、木香(14种)、药草香(10种)、坚果(9种)、樱桃(8种)、柑橘(7种)、杏仁(7种)。这些风味物质的组合与含量差异造就了不同海拔大树红茶风味特征的变化。

2.6 不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶差异挥发性代谢物rOAV分析

分别对不同海拔南川大树茶鲜叶中113种差异代谢物及红茶中179种差异代谢物进行rOAV分析。从图8可知,制成红茶后具有高rOAV的化合物均较同一海拔鲜叶多,且含量突出,说明加工工艺对特征香气的形成有重要作用。其中LA-CB中有1种挥发性代谢物rOAV突出,2种化合物rOAV亦较高;而HA-CB中具有较高rOAV的挥发性代谢物也较多。根据rOAV大小排序(表1),鲜叶中有重要贡献的香气物质依次是5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮、反,顺-2,6-壬二烯醛、二乙基二硫醚、苯甲硫醇等,而红茶中有重要贡献的香气物质依次是2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮、苯甲硫醇、6-壬烯醛、二乙基二硫醚等。其中5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮具有甜味、果味、奶油糖果等风味特征,rOAV为4.36E+04～1.47E+05;反,顺-2,6-壬二烯醛具有青黄瓜的风味特征,rOAV为8.04E+03～1.69E+04;二乙基二硫醚、苯甲硫醇均具有成熟洋葱较刺激的风味,rOAV分别为5.69E+03～1.46E+04、7.07E+03～1.48E+05;推测这些物质是南川大树茶重要的特征风味物质。而2-异丙基-3-甲氧基吡嗪具有坚果、豆、巧克力的风味,在LA-CB和HA-CB中rOAV分别达6.96E+05、1.84E+05;且较LA-FL和HA-FL中分别高271倍和96倍,推测其可能是其红茶香气品质区别于鲜叶的重要挥发性物质。

3 结论与讨论

香气是由其茶叶中不同含量和比例的挥发性物质组合而被人体嗅觉感官感知形成的一种综合感受。本文通过对不同海拔南川大树茶鲜叶及工夫红茶挥发性物质进行分析,鲜叶中检测出15类,574种物质,红茶较鲜叶多检测出1类物质(醚类),共检测出16类,575种物质。不同海拔鲜叶中挥发性代谢物总量差异不显著。但经萎凋、发酵、干燥等工序加工成红茶后,其香气较鲜叶明显丰富,LA-CB挥发性物质含量148.67 μg/g,显著高于HA-CB(104.27 μg/g)。说明低海拔茶园的大树茶在加工成红茶后香气更丰富。此外,LA-CB、HA-CB分别较其鲜叶增加99.59、59.58 μg/g,进一步证明红茶加工工艺对茶叶中香气物质的影响较大[24-25]。

采用PCA、OPLS-DA对不同海拔南川大树茶鲜叶及红茶非挥发性物质进行鉴别,发现鲜叶和成茶样本之间的总体差异明显,并分别从鲜叶组筛选出113种差异代谢物,红茶组筛选出179种差异代谢物,共同含有40种差异代谢物。其中HA-FL vs LA-FL有30种被KEGG注释到,其中6种上调,24种下调,主要富集在单萜类生物合成途径,该途径在各种生物过程中起着重要作用,包括抵御病原体和虫害的防御、调节生长和发育以及调节生物间相互作用[26-27];HA-CB vs LA-CB有46种被注释到,其中13种上调,33种下调,主要富集在异喹啉生物碱生物合成、叶酸合成途径,该两种途径中3,4-二羟基-苯甲醛和4-氨基苯甲酸出现显著上调,其中3,4-二羟基-苯甲醛是一种具有多种生物活性和药理作用的天然产物[28],有研究还表明,其对维持线粒体网络健康有积极作用,可改善脑缺血再灌注损伤[29]。而4-氨基苯甲酸是重要的芳香类氨基酸之一,是机体细胞生长和分裂所必需的重要组成部分,研究还发现,它与黄酮醇的酯类合成后可明显提高黄酮醇类化合物的抗癌活性[30]。可见,红茶加工不仅有利于茶叶风味的形成,还可能会增加茶叶中有益于健康的天然代谢产物。

挥发性代谢物风味组学及rOAV分析有助于我们更加客观地了解化合物的风味特征及其贡献度大小。经感官审评,不同海拔茶园的南川大树红茶香气品质主要表现为果甜香,与差异代谢物的风味轮分析结果及曾亮等[5]研究结果一致,其中HA-CB表现出甜香高锐的特征,LA-CB则更表现为甜香浓而持久,可能是源于其挥发性物质的高含量。但同时差异代谢物风味轮分析也可以更具体地看出不同海拔南川大树红茶含有如花香、木香、药茶香等复合香气的风味特征。而经rOAV分析发现,2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮、苯甲硫醇、6-壬烯醛、二乙基二硫醚等物质可能是南川大树红茶独特香气品质的重要贡献物质,其中2-异丙基-3-甲氧基吡嗪具有坚果、豆、巧克力的风味,可能是区别于鲜叶香气的重要物质基础。而引起高低海拔南川大树红茶香气品质的差异原因,可能是高海拔茶园的南川大树茶由于光照和温度差异大,气温较低的生长环境不利于茶叶中芳香类前体化合物转化的积累。综上,本文揭示了不同海拔南川大树茶鲜叶及工夫红茶挥发性物质特征及香气风味差异,并筛选出了显著差异代谢物及重要贡献物质。为不同海拔南川大树茶品质特征的区分及大树茶香气品质形成成因提供理论参考,同时高低海拔温度、光照等因素引起的品质变化机制也值得进一步探索。

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Analysis of volatile compound characteristics in Camellia nanchuanica black tea at different altitudes

YANG Juan1,2, CHEN Shanmin1,2, WANG Jie1,2, ZHANG Yulai1,2, ZHANG Ying1,2, LUO Hongyu1,2, YUAN Linying1,2*

1(Tea Research Institute, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 402160, China) 2(Chongqing Engineering Research Center for Tea, Chongqing 402160, China)

ABSTRACT To explore the characteristics of volatile compounds in Camellia nanchuanica black tea cultivated at various altitudes, a combination of headspace solid phase microextraction (HS-SPME) and GC/MS, along with multivariate analysis techniques, were employed to analyze the volatile metabolites in fresh leaves and the processed tea.The results revealed 574 substances out of 15 categories from the fresh leaves and a total of 575 substances of 16 categories in the congou black tea.And there was no significant difference in the total amount of volatile metabolites among fresh leaves picked at different altitudes.The aroma of processed black tea(processed by withering, fermentation, and drying)was significantly enriched compared to that of fresh leaves, with higher levels of esters, heterocycles, terpenes, aldehydes, and alcohols contributing to the flavor.Furthermore, the volatile substance of LA-CB (148.67 μg/g) was significantly higher than that of HA-CB(104.27 μg/g).Through orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA), 113 and 179 differential metabolites were identified from the fresh leaf group and black tea group, respectively.A differential metabolite flavor wheel was established by annotating the flavors of the different metabolites of the black tea group,showing that fruity sweetness was the main aroma characteristic of C.nanchuanica black tea from tea gardens of different altitudes, while the high level of volatile metabolites in LA-CB prolonged its aromatic smell.This result was consistent with sensory evaluation.Further analysis of the relative odor activity values of the metabolites suggested that substances such as 2-isopropyl-3-methoxypyrazine, 5-ethyl-3-hydroxy-4-methyl-2(5H)-furanone, benzyl mercaptan, 6-nonenal, and diethyl disulfide play a pivotal role in the formation of the unique aroma profile of C.nanchuanica black tea.Notably, 2-isopropyl-3-methoxypyrazine, with its distinct flavors of nuts, beans, and chocolate, was hypothesized to be a key component that distinguished the aroma characteristics of the processed black tea from its fresh leaves.This study offers theoretical insights into the discrimination of characteristic qualities of C.nanchuanica black tea at different altitudes, as well as the underlying factors contributing to the formation of its aroma quality.

Key words Camellia nanchuanica;altitudes;volatile compounds;characteristic

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.040513

引用格式：杨娟,陈善敏,王杰,等.不同海拔南川大树茶红茶挥发性物质特征分析[J].食品与发酵工业,2024,50(23):321-330.YANG Juan, CHEN Shanmin, WANG Jie, et al.Analysis of volatile compound characteristics in Camellia nanchuanica black tea at different altitudes[J].Food and Fermentation Industries,2024,50(23):321-330.

第一作者：硕士,副研究员(袁林颖研究员为通信作者,E-mail:350129893@qq.com)

基金项目：重庆市农业科学院市级财政科研项目(cqaas2023sjczqn015);重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2022NSCQ-MSX1668)

收稿日期：2024-07-18,改回日期：2024-08-13