大口黑鲈(Micropterus salmoides)又称加州鲈,是产于美国加利福尼亚州的一种肉食性淡水鱼类,20世纪80年代从国外引进并取得养殖、繁殖的成功,现已成为中国淡水鱼养殖的主要品种之一,2020年,农业产量达到61.95万t,比2019年增长29.66%[1]。大口黑鲈生长速度快、肉质嫩、味道鲜美,具有止咳润肺、健脾益气的作用,深受消费者欢迎[2]。近年来,随着市场需求的增大,大口黑鲈的产量也在逐年递增,但由于其特殊的营养成分及特征,宰杀后鱼体极易发生多种品质变化,导致其出现色泽变差、口感降低、保质期缩短等问题[3]。因此,在运输、贮藏及销售过程中,采取切实有效的保藏技术延缓产品的品质劣变成为亟需解决的问题。
冷藏保鲜又称冷却保鲜,是一种在0～4 ℃对鱼类进行保鲜的方法,因其操作简便,温度易控制,在家庭、市场范围内应用十分广泛[4]。微冻保鲜一般是将温度控制在生物体冰点±0.5 ℃内进行贮藏,此时鱼体内部5%～30%的水开始结冰,微生物的胞浆浓度增加,微生物生命活动、酶分解速率受到抑制,从而使水产品可在较长时间内保持原有的品质[5]。前人[6-9]的研究成果表明微冻可有效延缓鱼肉新鲜度的降低及品质的劣变。
目前,关于鲈鱼的保鲜研究主要集中在海鲈鱼,关于淡水鲈鱼的保鲜研究则相对较少。本实验以大口黑鲈为原料,先对大口黑鲈进行微冻贮藏,当鱼肉达到二级鲜度时转移至4 ℃进行冷藏,以持续冷藏和微冻贮藏为对比,通过测定贮藏过程中pH值、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)、菌落总数、肌动球蛋白、巯基、Ca2+-ATPase活性等指标并观察鱼肉的质构特性,研究大口黑鲈在微冻与冷藏条件下的品质变化,以期为大口黑鲈鱼保鲜技术的研究提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
活体大口黑鲈,上海市浦东新区芦潮港海鲜批发市场,体重(0.5～0.8) kg/条,体长(25～30) cm/条。
NaCl,上海麦克林生化科技有限公司;轻质MgO,国药集团化学试剂有限公司;PCA琼脂培养基,广州天骏生物科技有限公司;总蛋白定量测定试剂盒(BCA法),南京建成正浩科技有限公司;总巯基测定试剂盒,北京峰格生物技术有限公司;超微量Ca2+-ATP酶试剂盒,柏吉生物科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备
pH计,奥豪斯仪器(上海)有限公司;TMS-Pro质构仪,美国FTC公司;BS-210型电子天平,德国Sartorius Instruments有限公司;Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪,丹麦FOSS公司;SPARK型酶标仪,瑞士TECAN仪器公司;H-1850离心机,湖南湘怡实验室仪器开发有限公司;JK-24U多路温度测试仪,常州市金艾联电子科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料处理及贮藏
活体大口黑鲈洗净宰杀,去皮、去头尾、去内脏,取背部肌肉切成约4 cm×4 cm×2 cm的均一鱼块,擦干表面水分后,随机装入已经灭菌的食品保鲜袋中,每袋封装300 g左右。将封装好的鱼肉分为A、B两组,A组放在4 ℃冰箱进行冷藏保鲜;B组鱼肉置于密闭保鲜袋中使用冰盐混合微冻法隔水进行保鲜,微冻温度为-2 ℃,冰盐质量分数为4%。待B组鱼肉达到二级鲜度后取部分鱼肉转移至4 ℃冰箱进行冷藏保鲜,记为C组。每3 d测定一次各组鱼肉的物化指标。
1.2.2 冰点的测定
参考刘欢等[10]的方法稍加改动,将多点温度记录仪连接到电脑,设定参数,每30 s记录一次数据,时间为3 h。参数设定好后,将温度探头插入到鱼背肌肉中,置于-18 ℃冰箱中冻结,自动记录温度随时间变化的曲线,分析即可得出大口黑鲈鱼的冰点。
1.2.3 pH的测定
参考CROPOTOVA等[11]的方法,称取5 g大口黑鲈鱼背部肌肉,剪碎后加入50 mL去离子水,均质30 s浸提1 h后过滤,取上清液测定pH值,每个样品重复测定3次,取平均值。
1.2.4 TVB-N值的测定
依照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》测定。
1.2.5 菌落总数的测定
依照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定。
1.2.6 感官鉴定
挑选10名经过专业训练的人员,组成感官鉴定小组,每次取50 g样品,按照表1对大口黑鲈鱼肉肌肉弹性、汁液流失和组织结构等5个方面进行综合评价,每项满分为20分,总分为100分,60分以下表明鱼肉已经腐败。
表1 大口黑鲈鱼感官鉴定标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for M. salmoides
评价项目评价标准色泽色泽正常,光泽好,湿润度高(16～20分)浅黑色或褐色,色泽保持比较好(10～15分)色泽较差,显干燥,有明显的变色(5～9分)色泽变化明显(0～4分)组织结构肌肉组织结构紧致完整,纹理清晰(16～20分)肌肉组织结构较完整,纹理较清晰,无软烂(10～15分)组织结构不完整,纹理较模糊,脱水软烂较严重(5～9分)组织软烂、纹理模糊,脱水软烂严重(0～4分)气味有新鲜鱼肉特有的气味,无不良气味产生(24～30分)没有异味(15～23分)异味明显,有明显腥臭味(7～14分)有强烈腥臭味和其他明显腐败臭味(0～6分)弹性有恰当的弹性、韧性,无软烂(16～20分)手指按压后凹陷较快消失,弹性、韧性较好(10～15分)弹性差、表面产生黏性、黏手(5～9分)没有弹性和韧性、无肉感(0～4分)汁液流失包装袋中无明显积液(16～20分)包装袋中出现少量积液(10～15分)包装袋中出现明显积液(5～9分)包装袋中有大量积液(0～4分)
1.2.7 质构的测定
取2 cm×2 cm×1 cm大口黑鲈鱼头后的背部肌肉,采用质构仪对其硬度、弹性、咀嚼性、黏附性、胶黏性进行测定。参数设置:选用柱型探头,直径50 mm,测量模式TPA,重复测量5次,求取均值。参数设置:测前速度1 mm/s,测试速度3 mm/s,形变量55%,维持4 s,触发力5 g,返回速度4 mm/s,来回2次。
1.2.8 肌动球蛋白的测定
参考ZHOU等[12]的方法,并稍加修改。准确称取2 g大口黑鲈鱼背部肌肉于烧杯中,绞碎后加入10 mL预冷的KCl溶液(0.6 mol/L,pH 7.0),在冰浴条件下均质3 min,为防止溶液过热,每均质20 s停10 s。均质结束后,12 000 r/min、4 ℃离心20 min,收集上清液。向上清液加入3倍体积预冷的蒸馏水,12 000 r/min、4 ℃离心10 min,收集沉淀后加入等体积的预冷KCl溶液(1.2 mol/L,pH 7.0),冰浴条件下搅拌20 min,再次离心收集上清液,上清液即为肌动球蛋白。
测定方法:参照南京建成蛋白定量测试盒(BCA法)说明书,在562 nm处测定OD值。
1.2.9 总巯基的测定
以肌动球蛋白为待测样,参照北京峰格总巯基测定试剂盒说明书的方法进行测定,在412 nm处测定OD值。
1.2.10 Ca2+-ATPase活性的测定
以肌动球蛋白为待测样,参考柏吉生物超微量Ca2+-ATP酶试剂盒说明书进行测定,在636 nm处测定OD值。
1.3 数据处理
采用Excel 2019进行数据记录和整理,采用SPSS 26和Excel 2019进行图形的绘制。
2 结果与分析
2.1 大口黑鲈鱼冻结点和冰盐混合冰点的测定
冰盐混合物冰点与NaCl比重的关系如表2所示[13]。由表2可知,NaCl的添加量与冰盐混合物冰点成反比,即NaCl添加量越少冰盐混合物冰点越高。
如图1所示,鱼肉初始温度为18.4 ℃,前50 min温度迅速下降,70 min后冻结曲线出现第1个拐点,之后出现了一段相对稳定的时期,此时期鱼肉内大部分水分被冻结,释放出热量,所以温度变化较小,140 min后温度快速下降。由此可判断出大口黑鲈鱼的冰点为-1.6 ℃,微冻温度为其冻结点±0.5 ℃,因此本实验选择-2 ℃作为微冻保鲜温度。结合表2,选择NaCl质量分数为4%的冰盐混合物进行微冻。
表2 NaCl含量与冰盐混合物冰点的关系
Table 2 Relationship between sodium chloride content and freezing point of ice-salt mixture
NaCl质量分数/%冰点/℃NaCl质量分数/%冰点/℃00.005-2.981-0.666-3.722-1.217-4.313-1.688-5.114-2.259-5.81
图1 大口黑鲈鱼的冻结曲线
Fig.1 Freezing curve of M. salmoides
2.2 TVB-N值的变化
TVB-N是对水产品质量评估的主要参数之一,鱼死亡后在微生物及内源酶的作用下体内蛋白质被分解为甲胺及其他的氨类物质被称为TVB-N[14]。TVB-N值越高表明鱼肉氨基酸被破环的程度越严重,腐败程度越高。如图2所示,新鲜大口黑鲈鱼的TVB-N值为(8.21±0.11) mg/100 g,0～3 d两组鱼肉TVB-N值的变化不明显,从第4天开始A组TVB-N值快速升高,从第6天开始B组TVB-N值增长速率加快,但低于冷藏贮藏;第9天B组鱼肉达到二级鲜度,将部分鱼肉转移至4 ℃进行冷藏。据GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》的规定,淡水鱼的TVB-N值≤20 mg/100 g。A组在第13天时TVB-N值已达(21.58±0.11) mg/100 g,已超出限量值,不能食用,C组从第9天开始TVB-N值快速上升,并始终高于B组,在第16天时TVB-N值达到(20.66±0.27) mg/100 g,失去食用价值,而此时B组仍在国标规定范围内。这可能因为低温条件下鱼肉自身酶和腐败微生物所分解的胞外酶活性受到抑制,蛋白质分解产生氨以及胺类等碱性含氮物质的速率降低[15]。可见,不同贮藏条件下大口黑鲈鱼TVB-N值的变化速率存在一定差异。
图2 大口黑鲈鱼TVB-N值的变化
Fig.2 Changes in TVB-N values in M. salmoides
2.3 pH值的变化
pH值的变化情况可在一定程度上表征大口黑鲈的新鲜程度,是评价鱼肉品质的指标之一。如图3所示,在僵直期,鱼肉的pH值呈现先下降后上升的趋势,这可能因为在大口黑鲈鱼死后体内的磷酸肌酸和ATP等物质分解产生乳酸等酸性物质,同时糖原酶解产生乳酸,使鱼肉pH值下降[16]。解僵和自溶期,鱼肉蛋白质在微生物和酶的作用下不断分解产生碱性物质,使pH值回升。A组鱼肉pH值在第3天降低到最小值6.77,B组第6天降低到最小值6.68,贮藏后期A组鱼肉pH值上升速度相较于B组更快,C组鱼肉pH值自第9天开始上升速度逐渐加快,且高于B组,这是因为微冻产生的低温条件抑制了鱼体内外微生物的生命活动、降低了鱼体内源酶的活性,蛋白质的分解速度减慢,氨等碱性物质的生成减少,因此pH上升缓慢[17]。
图3 大口黑鲈鱼肉pH值的变化
Fig.3 Changes in pH value of M. salmoides meat
2.4 菌落总数
微生物是导致水产品变质的重要原因,美国以及一些欧洲国家已经将计算总活菌数作为水产品的强制标准[18]。由图4可知,新鲜大口黑鲈的菌落总数为3.1 lg CFU/g,0～3 d微冻组菌落总数略微下降,可能是因为温度降低过快,导致鱼体表面的嗜温菌出现死亡[19]。随着贮藏时间的延长,3组鱼肉的菌落总数均呈现上升趋势,A组和C组鱼肉的菌落总数高于B组,可能是因为冷藏温度高,微生物繁殖较快,而低温可抑制微生物的生长繁殖[20]。A组在第12天时菌落总数为6.2 lg CFU/g,已超出规定限值,C组在第14天时菌落总数为6.1 lg CFU/g,已无法食用,B组直至第16天仍小于6 lg CFU/g,处于可食用范围内。
图4 大口黑鲈鱼菌落总数的变化
Fig.4 Change in total colonies in M. salmoides
2.5 感官鉴定
感官鉴定因具有操作简便、快速的优势,在水产品品质评价方面应用十分广泛[21]。从图5可以得到,新鲜鱼肉评分为95分,接近满分,未取得满分的原因可能是刚宰杀的鱼有浓烈的腥味。随着贮藏时间的延长,3组鱼肉的感官评分均呈下降的趋势,第3～6天B组和C组感官评分下降幅度较大,可能是因为鱼肉内部分水分结冰,肉质偏硬。第15天B组感官评分也出现明显下降,可能是因为冰晶对鱼肉细胞的破坏较大,使大口黑鲈鱼的品质快速下降[8]。C组自第9天开始感官评分下降速度加快,与B组的分数差距逐渐加大。整个贮藏期内,A组感官评分从第8天开始低于60分,不可食用,C组得分在第13天达到57分,已无食用价值,B组在17 d内感官评分仍高于60分,仍可食用。由此可见,微冻条件下大口黑鲈鱼的品质更高。
图5 大口黑鲈鱼感官评分值的变化
Fig.5 Changes in sensory scores for M. salmoides
2.6 肌动球蛋白含量的变化
肌动球蛋白是肌动蛋白与肌球蛋白作用形成的复合物,是构成肌原纤维的主要成分,在一定程度上可以反映鱼肉蛋白质的变性程度[22]。由图6可知,在0～3 d各组大口黑鲈鱼的肌动球蛋白含量均有所增加,这可能是因为肌动蛋白与肌球蛋白在ATP的作用下产生聚合,形成了大分子质量的分子聚集沉淀起来,这与于林[23]的研究结果相似。贮藏期内,大口黑鲈鱼的肌动球蛋白含量呈下降趋势,新鲜大口黑鲈鱼的肌动球蛋白含量为33.2 mg/g,18 d时A组肌动球蛋白含量为13.5 mg/g,是第0天的40.67%,下降了59.33%。C组从第9天开始下降速率高于B组,且逐渐加快,到第18天时肌动球蛋白含量是第0天的52.71%,下降了47.29%。而B组到第18天下降了39.46%,说明在贮藏期间,A组及C组鱼肉肌动球蛋白变性严重,微冻贮藏对肌动球蛋白的变性有一定的抑制作用。这与高萌等[24]的研究结果一致。
2.7 巯基含量的变化
巯基(—SH)含量是衡量鱼肉蛋白质变性聚合的重要指标,贮藏期间鱼肉巯基含量越高,说明鱼肉蛋白质变性聚合程度越低[25]。如图7所示,不同处理组的鱼肉巯基含量均呈下降的趋势,该结果与荣建华等[26]的研究结果相似。A组的—SH含量从初始值5.98×10-5 mol/g到贮藏末期的1.1×10-5 mol/g,下降了81.61%,第6天时出现明显下降。C组0～9 d下降速率相较于A组更慢,自第9天起速率加快并逐渐高于B组,至贮藏末期—SH含量为1.5×10-5 mol/g,下降了74.92%。而B组—SH含量的下降速率相对较慢,下降了64.05%。这可能是因为低温抑制了鱼肉肌原纤维的降解,同时—SH被氧化成二硫键(—S—S—)受到抑制,从而延缓了—SH含量的下降。结合图6发现大口黑鲈鱼肉肌动球蛋白含量的变化趋势与—SH一致,这可能与—SH氧化产生的—S—S—使肌动球蛋白发生重链聚合,降低其盐溶性有关[27]。
图6 大口黑鲈鱼肌动球蛋白含量的变化
Fig.6 Changes in acinfoglobulin content in M. salmoides
2.8 Ca2+-ATPase活性的变化
Ca2+-ATPase活性表征肌球蛋白头部性质,是评价鱼肉中蛋白质变性程度的重要指标,其活性越低,表明鱼肉蛋白质性质越不稳定,变性程度越高[28]。如图8所示,随着贮藏时间的延长,鱼肉Ca2+-ATPase活性均呈现下降的趋势,A组下降速率最快,第18天时由初始值4.2 μmol Pi/(mg pro·h)下降至0.6 μmol Pi/(mg pro·h),下降了85.71%。C组先缓慢下降,第9天后速率加快,第18天时下降至1.2 μmol Pi/(mg pro·h),下降了71.43%。B组下降速度最慢,第18天时下降了54.77%。这可能是因为冷藏条件下鱼肉蛋白受微生物的影响大,肌原纤维蛋白的分解速度加快,使其Ca2+-ATPase活性迅速下降;微冻条件下鱼体肌肉中ATP的分解受到抑制,因而使Ca2+-ATPase活性的下降速率减慢。结合图7发现Ca2+-ATPase活性的下降趋势与—SH的下降趋势相似,这是因为在微冻产生的低温条件—SH的氧化程度下降,微生物破坏蛋白质的能力降低,因而使Ca2+-ATPase活性下降的趋势减缓[28]。
图7 大口黑鲈鱼巯基含量的变化
Fig.7 Changes in sulfhydryl content in M. salmoides
图8 大口黑鲈鱼Ca2+-ATPase活性的变化
Fig.8 Changes in Ca2+-ATPase activity in M. salmoides
2.9 质构的变化
质构指标包括硬度、弹性、咀嚼性、胶黏性等,与水产品的脂肪含量、脂肪分布等有关,是评价水产品品质不可或缺的指标。如图9所示,3组大口黑鲈鱼的弹性均呈下降趋势,A组下降速率较快,至贮藏结束下降了87.14%;C组贮藏期内下降了82.31%;B组下降了67%,且贮藏期内弹性值始终高于A组与C组,这可能与微冻组温度低,鱼体内ATP酶活性下降较慢,肌动球蛋白变性程度较低,肌肉间结合力相对较大有关。在贮藏后期鱼肉弹性下降速率加快,这可能是与肌原纤维大量降解,肌肉之间的作用力减少有关[29]。
图9 大口黑鲈鱼肉弹性的变化
Fig.9 Changes in elasticity of M. salmoides meat
如图10所示,B组与C组鱼肉硬度先增大而后降低,这是由于鱼死亡后进入了僵硬期,鱼肉硬度增大,之后进入解僵期,硬度降低。A组鱼肉的硬度持续降低,可能是因为冷藏温度下鱼肉进入僵硬期的时间提前,在到达硬度测定时间之前已完成僵硬与解僵的过程。到贮藏结束,A组鱼肉硬度下降了72.02%,C组下降了65.46%,而B组下降了59.8%,鱼肉硬度降低主要是由于鱼体内的ATP酶活性下降,导致肌动球蛋白变性,而低温能够有效抑制酶活性的下降,因此B组硬度值降低的更缓慢。
从总体上看,随着贮藏时间的延长,各组鱼肉咀嚼性均有不同程度的下降(图11),并且与图10所示的硬度变化情况一致。至贮藏结束A组、B组及C组的鱼肉咀嚼性分别下降了74%、59.66%、54.37%,咀嚼性的降低与肌原纤维蛋白发生降解,肌肉组织结构被破坏有关,微冻温度可有效抑制蛋白质的降解与肌肉组织的变化,因此可延缓鱼肉咀嚼性的降低[30]。
图10 大口黑鲈鱼肉硬度的变化
Fig.10 Changes in hardness of M. salmoides meat
图11 大口黑鲈鱼肉咀嚼性的变化
Fig.11 Changes in chewiness of M. salmoides meat
胶黏性是用来描述半固态食品在一定力作用下流动性的参数,在此处模拟表示将鱼肉破裂成吞咽时的稳定状态所需的能量[31]。由图12可知,3组鱼肉在贮藏期内胶黏性逐渐下降,这是因为贮藏过程中鱼肉肌原纤维蛋白发生降解时,细胞流出的水分起到了润滑作用,从而导致鱼肉胶黏性下降[32]。其中,A组胶黏性下降较快,至贮藏结束由1 559.37下降至320.45,下降了79.45%;C组从第9天开始快速下降,至贮藏结束下降了70.79%;B组下降速度相对较慢,至贮藏结束降低了55.09%,3组鱼肉胶黏性下降速度不同可能与微冻温度下,鱼肉肌原纤维蛋白降解速度减慢,细胞流出的水分减少所起到的润滑作用降低有关。
图12 大口黑鲈鱼肉胶黏性的变化
Fig.12 Changes in stickiness of M. salmoides meat
黏附性是指探头脱离样品所需能量大小,反映食品表面与物体黏在一起的力。通过图13可看出3组鱼肉黏附性均呈现上升的趋势,可能是由于鱼肉蛋白质发生了变性,使得持水性下降,细胞间的结合力减小,导致鱼肉黏附性增大[32]。贮藏结束时A组鱼肉黏附性由初始值-15.13 g/s上升至-5.4 g/s,上升了64.31%,C组黏附性上升了58.36%,而B组上升了47.12%,B组鱼肉黏附性上升速度较慢可能是因为在微冻创造的低温条件下,鱼肉蛋白质的变性速度受到抑制,延缓了鱼肉持水性的下降及细胞间结合力的减小,从而使黏附性的上升速度减慢。
图13 大口黑鲈鱼肉黏附性的变化
Fig.13 Changes in adhesion of M. salmoides meat
3 结论
本文研究了在冷藏A组(4 ℃)、微冻B组(-2 ℃)和微冻9 d+冷藏C组(-2 ℃+4 ℃)贮藏过程中大口黑鲈鱼肌肉品质的变化。在贮藏过程中,A组pH在第3天降到最低值、第11天时达到7.0,C组和B组在第6天降到最低值,分别在第14天、第17天达到7.0;菌落总数总体呈上升趋势,分别在第11天、第16天、第14天超过6.0 lg CFU/g,无法食用。A组、B组和C组的TVB-N值均呈上升趋势,温度越低,上升速度越慢,3组鱼肉分别在第13、19、16天超出国家限值,失去食用价值;大口黑鲈鱼肌肉的感官评分、巯基含量和Ca2+-ATPase活性均呈下降趋势,且温度越低,下降速度越慢,感官评分达到60分所用天数为A组>C组>B组。肌动球蛋白的含量呈现先增加后下降的趋势,贮藏期结束肌动球蛋白含量为B组>C组>A组。大口黑鲈鱼肉硬度、弹性、胶黏性以及咀嚼性总体呈现下降,温度越高,下降越快,黏附性总体呈上升趋势,温度越高,上升速度越快,因此贮藏期内B组的质构指标优于A组和C组。与冷藏和微冻+冷藏相比,微冻贮藏保持大口黑鲈鱼肌肉品质效果更佳。本研究仍存在不足,对大口黑鲈鱼品质变化的研究还不够深入,后面将从组织微观结构、水分分布、营养成分等方面进一步探究大口黑鲈鱼肌肉品质的变化机理。
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