膜醭毕赤酵母蛋白复合膜对桃采后果腐病的抑制效果及机制

桃作为典型的呼吸跃变型果实,采后因后熟而软化,使其在贮运中极易受致病菌侵害[1]。镰刀孢(Fusarium spp.)是桃果实采后主要致病菌之一,侵染后导致果实腐烂,最终失去其商品价值[2]。因此,亟需探寻一种绿色安全的防腐保鲜手段以延长桃果实货架期。

近年来,天然抑菌膜成为果蔬防腐保鲜中的研究热点。天然抑菌膜是将天然抑菌剂如动物、植物源提取物、微生物代谢产物等复配成膜基材制成的具有抗菌活性的薄膜,通常以直接包裹或喷涂形式来防控致病菌侵染,以延长果蔬采后贮藏期[3]。方静等[4]制备的肉桂精油-壳聚糖复合膜可显著降低芒果采后炭疽病的发生;WANG等[5]制备的纳他霉素-琼脂复合膜对黑曲霉表现抑制活性,维持了新鲜草莓的采后品质。膜醭毕赤酵母抑菌蛋白是本实验室从膜醭毕赤酵母发酵液中提取的一种具有抑菌活性的蛋白类物质,已有研究表明对灰葡萄孢[6]和交链孢[7]表现出较强的抑菌活性,可作为抑菌膜中天然抑菌剂的来源。实验室前期已制备出一种膜醭毕赤酵母蛋白复合膜[8],但并未对该复合膜在果蔬采后病害中的应用效果进行深入研究,且作用机理尚未明确。

因此在此基础上,本文首次探索膜醭毕赤酵母蛋白复合膜对镰刀孢的体外抑制机制及对桃果采后果腐病防治效果,为该膜在果蔬采后病害防治及防腐保鲜提供可靠方法和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

镰刀孢(Fusarium spp.)、膜醭毕赤酵母菌(Pichia membranaefaciens)由天津科技大学农产品物流保鲜与加工室提供;草酸、2,6-二氯靛酚钠、抗坏血酸、戊二醛,天津市盛鑫源伟业贸易有限公司;玉米淀粉、卡拉胶(食品级)、甘油,河南万邦化工科技有限公司;实验用桃果购买于天津市塘沽区水果市场。

1.2 仪器设备

ZHJH-C1109B无菌操作台,上海智城分析仪器制造有限公司;N50 TOUCH超微量紫外分光光度计,德国Implen公司;TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;SU1510扫描电子显微镜,日本HITACHI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 膜醭毕赤酵母抑菌蛋白的提取

冷水浴下,将(NH4)2SO4缓慢加入膜醭毕赤酵母发酵液中至(NH4)2SO4最终饱和度为60%。冷藏过夜后离心,收集沉淀物,透析除盐后冷冻干燥得到粗蛋白质提取物粉末。

1.3.2 膜醭毕赤酵母蛋白复合膜的制备

据本实验前期研究,以质量分数6%玉米淀粉、4 g/L卡拉胶溶液等体积混合后添加体积分数1%的甘油制备基础膜液,再加入体积分数1%的抑菌蛋白溶液得到终质量浓度为2.5 mg/mL的蛋白复合膜液[8],并以涂膜方式应用于桃果采后防腐研究。

1.3.3 镰刀孢孢子悬液制备

将病原菌接种于PDA培养基中25 ℃培养7 d,无菌水清洗孢子后6层纱布过滤,制成1×106 spores/mL孢子悬浮液,备用。

1.3.4 蛋白复合膜体外抑菌活性测定

将30 μL蛋白膜液均匀涂至PDA平皿,待膜液完全渗入培养基后接入镰刀孢菌饼,于27 ℃恒温培养箱中培养,每隔24 h测量菌落直径,以无菌水作为空白对照。按公式(1)计算抑制率:

菌丝生长抑制率/%

参照文献[9]测定膜液对孢子萌发的抑制效果。按公式(2)计算抑制率:

孢子萌发抑制率

1.3.5 菌丝扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察

分别挑取正常和受抑制的病原菌菌丝,经磷酸盐缓冲溶液冲洗悬浮后离心,弃去上清液收集沉淀。参照代博仁等[10]的方法制备SEM样品,喷金后观察菌丝形态变化。

1.3.6 蛋白复合膜对镰刀孢细胞膜通透性影响

参照PEREIRA等[11]的方法,用超微量紫外分光光度计测定两组菌体上清液在OD260、OD280下核酸和蛋白质含量。

1.3.7 蛋白复合膜对桃果采后果腐病的防治效果

果实预处理[12]后,用无菌打孔器在其赤道处等距离打3孔(深3 mm,直径3 mm),每孔接注30 μL 蛋白膜液,以等量无菌水作空白对照。自然晾干后,每孔注入30 μL 致病菌孢子悬液,于20 ℃、相对湿度95%条件下贮藏。定期记录桃果实发病情况。

1.3.8 蛋白复合膜对桃果实品质的影响

1.3.8.1 硬度测定

采用GY-4型硬度计测定贮藏期内每颗果实赤道处正反两侧硬度,记录各组果实硬度变化。

1.3.8.2 褐变度测定

参照LIU等[13]的方法,桃果肉经体积分数为95%乙醇溶液研磨成匀浆后于10 000 r/min下离心10 min,收集上清液于420 nm下测定吸光度,以A420nm表示果实褐变程度。

1.3.8.3 可溶性固形物含量测定

采用手持型阿贝折光仪测定桃果实可溶性固形物含量变化,结果以百分比计。

1.3.8.4 维生素C含量测定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[14]测定果实中维生素C含量。

1.4 数据统计与分析

数据采用Excel 2010软件处理,实验设置3个平行,结果以平均值±标准差表示。运用SPSS 20.0进行数据统计分析,Duncan检验进行显著性分析,检验水平P<0.05,并用Origin 2018 作图。

2 结果与分析

2.1 蛋白复合膜对镰刀孢的体外抑菌活性

如图1-a所示,膜液处理组菌落直径始终小于CK组,第2天与CK组开始表现差异(P<0.05)。此后随着培养时间逐渐扩大,第6天实验组菌落直径仅(40±2) mm,且在处理3 d时有最大抑菌率56.72% (图1-b)。抑菌物质的体外抑菌活性还表现为对致病菌孢子萌发的影响,处理8 h 的孢子萌发情况见表1。CK组孢子几乎全部萌发且芽管细长,蛋白膜液处理后的孢子萌发率仅(32.67±4.04)%,且已萌发的孢子芽管短小,萌发率差异显著(P<0.05)。

2.2 蛋白复合膜处理后镰刀孢菌丝的SEM观察

正常和受抑制的菌丝表面特征见图2。正常生长的菌丝粗壮、饱满,表面平滑规整且分支较少(图2-a)。而蛋白膜液处理后的菌丝体粗细不均,分支增多,顶端和中部不规则膨大(图2-b、图2-c);此外菌丝表面多皱褶、少量内容物渗出,出现断裂现象(图2-d)。此前VIR width=11,height=17,dpi=110

GH等[15]研究发现,抗菌蛋白NFAP能够改变构巢曲霉菌丝形态,造成菌丝顶端膨大、扭曲畸变来抑制其生长,与本文研究具有相似性。说明蛋白膜液可通过破坏镰刀孢菌丝细胞膜的完整性,使胞内大分子物质流出,从而抑制其生长。

2.3 蛋白复合膜对镰刀孢菌丝细胞膜通透性的影响

核酸和蛋白质作为胞内重要的大分子物质,其含量变化是评价菌体细胞膜完整程度的重要标尺[16]。如图3所示,膜液处理后,镰刀孢核酸(图3-a)和蛋白质(图3-b)外渗量均呈增长趋势,显著高于CK组(P<0.05)。4 h内菌体核酸及蛋白质含量迅速升高,可能是菌体在突然遭受逆境时未能及时做出应激反应,膜结构遭到破坏,使得胞内稳态失衡,物质大量外渗。随着处理时间延长,增长趋势逐渐平缓,推测此阶段多数菌体已被破坏完全,胞内蛋白、核酸物质被全部释放。以上结果进一步验证了蛋白膜液破坏了镰刀孢膜结构的完整性。

2.4 蛋白复合膜对桃果采后果腐的防治效果

蛋白复合膜对桃果腐病防治效果如图4-a所示,CK组桃果接种镰刀孢后第2天已开始发病,4 d时果实病斑直径显著扩大且布满白色菌丝,发病率高达61.67%;而实验组桃果直到第6天才可观察到明显的褐色病斑,发病率仅为43.33%,与CK组差异显著(P<0.05)。当贮藏至第8天,CK组果实已大面积腐烂,实验组桃果仅出现(19.33±1.53)mm的褐斑,病斑扩展抑制效果最高可达72.09%(图4-b)。表明蛋白复合膜能够降低桃果的腐烂程度,对桃果采后果腐病的发生具有良好的防治效果。

2.5 蛋白复合膜对桃果实品质的影响

2.5.1 对桃果硬度影响

硬度是决定果蔬采后贮藏性及抗病性的重要因素[17]。两组桃果实硬度均与贮藏时间呈负相关(图5-a),而复合膜处理组硬度下降速度缓慢,且果实硬度始终高于CK组;贮藏至第8天,CK组桃果实硬度为(4.9±0.3) kg/cm2,而复合膜处理下桃果实的平均硬度(7.93±0.31) kg/cm2是CK组的1.6倍,二者差异显著(P<0.05)。蛋白复合膜处理能显著提高果实硬度,推测该膜可抑制镰刀孢在果实伤口表面繁殖,防止果实细胞壁被破坏。

2.5.2 对桃果褐变度影响

桃果实随贮藏时间逐渐褐变,CK组桃果实褐变进程较快,贮藏 2 d后开始迅速褐变,而复合膜处理下的桃果实呈缓慢褐变趋势,褐变程度远低于CK组(图5-b)。贮藏末期,复合膜处理下的果实褐变度比CK组降低了39.15%,与CK组表现显著差异(P<0.05),推测复合膜具有良好的隔氧性能使得果体中多酚氧化酶的活性降低[18],从而抑制果实内多酚类物质的氧化,延缓桃果实褐变。

2.5.3 对桃果实可溶性固形物含量影响

可溶性固形物(total soluble solids,TSS)是果实内在品质的表现,影响果实风味。如图6-c所示,两组果实TSS含量均呈下降趋势,这可能是果实中糖类物质作为呼吸底物被消耗造成的结果[19]。贮藏末期,蛋白复合膜处理后果实TSS含量相对CK组提高了9.27%。但整个贮藏期内,实验组TSS含量始终高于CK组并维持在较高水平,这可能是膜处理后桃果实呼吸产生的CO2积累在膜内,使得桃果呼吸强度减弱而抑制TSS作为底物被消耗,以维持果实较好的生理品质。

2.5.4 对桃果实维生素C含量影响

维生素C是评判果实衰老和营养价值的重要指标。成熟桃果实体内不再合成维生素C反而随时间逐渐被氧化分解,使两组维生素C含量在贮藏期内均呈下降趋势(图5-d)。第2天,CK组维生素C含量迅速下降,而膜处理组下降延迟至第4天;第8天膜处理组果实维生素C含量[(1.73±0.35) mg/100 g]是CK组[(0.5±0.1) mg/100 g]的3.46倍,二者差异显著(P<0.05)。推测是蛋白复合膜通过减弱桃果呼吸强度降低了体内氧化酶活性[20],减弱桃果代谢活动,从而延缓维生素C被氧化,与上述维持其TSS含量的机制具有一致性。

3 结论

以膜醭毕赤酵母蛋白为抑菌剂制备的天然生物抗菌膜对镰刀孢表现出较强的抑菌活性。离体实验证实蛋白膜液可显著抑制镰刀孢孢子萌发,抑制率达67.33%,菌落抑制率为56.72%;扫描电镜下观察到镰刀孢菌丝粗细不均,顶端或中部不规则膨大、内容物外渗现象;蛋白膜液处理后致病菌胞外蛋白质及核酸含量均上升,说明该复合膜作用机理之一在于增大镰刀孢菌体膜透性,使得膜内物质流出,最终导致菌丝消解甚至死亡。

桃果实有伤接种实验证实膜醭毕赤酵母蛋白复合膜能够降低桃果实采后果腐病发病率,对病斑直径扩展的抑制效果高达72.09%;桃果实采后生理品质的测定表明蛋白复合膜能够维持桃果硬度并延缓褐变,延缓果实体内TSS及维生素C含量下降,有效维持了桃果采后生理品质。

膜醭毕赤酵母蛋白复合膜作为一种天然生物抗菌膜,为其在果蔬采后防腐保鲜提供了参考。

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