不同产地沃柑挥发性成分的差异分析

柑橘是世界第一大水果,我国柑橘种植面积和总产量均居世界第一[1]。柑橘果实营养丰富,富含类黄酮[2]、酚酸[2]、香豆素[2-3]、类柠檬苦素[4]、类胡萝卜素[5]、生物碱[6]、肌醇[7]和挥发性物质[8]等多种生物活性成分。近年来,由于沃柑、红美人、春见、清见、不知火、W默科特、大雅柑等杂柑营养价值高,且兼具橙、橘和柚果的特点,发展迅速,深受消费者喜爱。沃柑是坦普尔橘与丹西红橘的杂交种,由以色列培育而成,果肉浓橙色,肉质细嫩化渣,汁多味浓,高糖低酸,果实风味浓郁。该品种采收期长,可从12月底采收至来年的3月上旬,具有极高的生产价值,在广西、云南、四川、重庆等柑橘产区被大量推广种植[9]。由于地理位置、环境条件、生产方式不同,不同产地沃柑的特有生物活性成分具有差异。研究不同产地农产品特征差异,进而找出根本差异代谢物,能够实现农产品从原料到产品每一步都有迹可循、有源可查[10]。农产品产地溯源,既可以采用现代信息技术进行全程监测和跟踪,也可以寻找不同产地农产品的特异性差异物,通常包括有机成分[11-14]、矿物元素[15]、稳定性同位素[16]和DNA图谱[17]等。

作为一种重要的有机成分,挥发性成分能够客观地反映不同水果品种的风味特点,是评价果实风味品质的重要指标。国内外对柑橘中挥发性成分的报道主要集中于不同品种果皮精油和果汁等之间的差异性分析[18],但不同产地同一品种中挥发性成分的差异分析及产地溯源研究较少。如SONG等[11]利用GC-FID和GC-MS比较了韩国和日本不知火杂柑果皮精油中挥发性成分,柠檬烯、醇类和醛类等主要成分均差异显著。金润楠等[12]采用顶空固相微萃取气质联用(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS),并结合气味活度值和主成分分析(principal component analysis,PCA),对我国浙江、湖北、湖南3个产地的宫川和尾张2个温州蜜柑品种果汁中香气差异进行分析比较,结果表明,产地和品种对温州蜜柑香气成分均有显著影响,选取产地特异性成分和品种产地特异性成分进行PCA,能够很好地将样品区分开。CENTONZE等[13]将HS-SPME-GC-MS与电子鼻联用,结合化学计量学,用于区分来自意大利、南非和西班牙三地的甜橙品种。罗振玲等[14]分析了来自浙江省台州黄岩、宁波象山、衢州衢江和丽水莲都等4个不同产区的红美人果皮中主要挥发性成分的差异性,利用挥发性成分可基本区分4个产区的红美人。

本文通过HS-SPME-GC-MS技术,对4个主产地(四川、重庆、云南和广西)的沃柑果皮中挥发性成分进行定性和半定量分析,并基于半定量结果分别建立四川和重庆、云南和广西沃柑的正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型,进而采用s-plot图并结合变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)值和分析比较成分间的显著性差异,最终确定能够区分不同产区沃柑的潜在生物标志物,旨在为沃柑的产地溯源和深加工提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沃柑具体采摘信息见表1所示。所有样品均符合果形端正,较整齐,单果斑点不超过4个,无枯水,浅橙黄色且着色均匀。由于产地不同,成熟时间有一定差异,广西和云南的沃柑采于2020年1月,四川和重庆的沃柑采于2020年3月。每份样品不少于30个,将采摘的沃柑表面擦拭干净,四分法切开得到果皮,打碎混匀。

NaCl(分析纯),重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂;环己酮(纯度≥99.5%)、C5～C25正构烷烃(色谱纯),德国Dr.Ehrenstorfer GmbH;α-蒎烯(纯度98.0%)、月桂烯(纯度≥75.0%)、3-蒈烯(纯度>90.0%)、α-松油烯(纯度>90.0%)、柠檬烯(纯度95.0%)、γ-松油烯(纯度>95.0%)、异松油烯(纯度85.0%)、顺式-3-己烯醇(纯度98.0%)、正己醇(纯度≥98.0%)、正辛醇(纯度99.5%)、芳樟醇(纯度98.0%)、正壬醇(纯度98.0%)、4-松油烯醇(纯度98.0%)、α-松油醇(纯度98.0%)、香茅醇(纯度98.0%)、橙花醇(纯度97.0%)、香叶醇(纯度97.0%)、紫苏醇(纯度90.0%)、辛酸甲酯(纯度>99.0%)、丁酸己酯(纯度>98.0%)、乙酸橙花酯(纯度95.0%)、乙酸香叶酯(纯度95.0%)、己酸己酯(纯度>98.0%)、邻苯二甲酸二乙酯(纯度≥99.5%)、己醛(纯度97.0%)、反式-2-己烯醛(纯度98.0%)、2,4-己二烯醛(纯度>95.0%)、苯甲醛(纯度≥98.0%)、正辛醛(纯度≥99.0%)、正壬醛(纯度96.0%)、香茅醛(纯度96.0%)、正十一醛(纯度97.0%)、月桂醛(纯度95.0%),阿拉丁试剂(上海)有限公司;β-丁香烯(纯度≥98.0%)、反式-β-金合欢烯(纯度≥98.0%)、香芹酮(纯度≥95.0%)、醋酸辛酯(纯度≥98.0%)、反,反-2,4-癸二烯醛(纯度>90.0%),上海源叶生物科技有限公司;顺式-β-金合欢烯(纯度>98.0%)、大牛儿烯D(纯度99.3%)、β-芹子烯(纯度90.0%)、α-布藜烯(纯度90.0%),加拿大TRC公司;桧烯(纯度75.0%)、柠檬烯氧化物(纯度≥95.0%),美国Sigma-Aldrich公司;丁香酚(纯度99.0%),上海Macklin生物化学有限公司;辛酸己酯(纯度≥99.0%),北京迈瑞达科技有限公司;α-金合欢烯(纯度>99.9%),东京化成工业株式会社;巴伦西亚橘烯(纯度93.4%),美国Chromadex公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱一单四极杆质谱仪,美国Agilent公司,配Combi PAL自动进样器(瑞士CTC公司);HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm id×0.25 μm),美国Agilent公司;二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm),美国Supelco公司;Milli-Q Advantage A10超纯水器,美国Millipore公司;XS205电子天平(感量0.01 mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 实验方法

采取程序升温,35 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min,再以5 ℃/min升至250 ℃,保持2 min;进样口温度250 ℃,不分流进样;载气为高纯氦气(纯度均≥99.999%),1 mL/min。

离子化方式是EI,电子能量70 eV;传输线温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;质量扫描范围m/z 35～450。

1.3.3 混合标准溶液配制

分别准确称取50种标准品5.00 mg于10 mL棕色容量瓶中,用丙酮定容,摇匀,配制成500 mg/L标准母液,转移到带盖棕色试剂瓶中,置于-50 ℃超低温冰箱中待用。

称取3.00 g样品,置20 mL螺口样品瓶中,加入3.00 mL饱和NaCl溶液和2.00 μL环己酮(内标物),用聚四氟乙烯隔垫密封,在50 ℃孵化器中加热平衡20 min。用萃取头顶空吸附50 min后,将萃取头插入GC进样,解析5 min。每份样品各3个平行。

1.4 定性和半定量分析

利用Flavour 2.0和NIST 08质谱库,筛选出匹配度≥90%的物质,同时结合标准物质保留时间进行定性。在1.3.1节中相同的程序升温条件下,获得C5～C25正构烷烃的保留时间,结合各成分的保留时间,按照公式(1)计算样品中各成分的保留指数(retention index,RI)。

RI=100×Z+100×(tx-tz)/(t(z+1)-tz)

式中:Z和Z+1分别为目标化合物(X)流出前后的正构烷烃所含碳原子的数目;tx、tz、t(z+1)分别为目标物及碳数为Z,Z+1正构烷烃的保留时间,且有tz<tx<t(z+1)。

用内标物环己酮对挥发性成分进行半定量,半定量按公式(2)计算:

RC=Ax×m环己酮/(A环己酮×m样品)

式中:RC,目标物的相对含量;Ax和A环己酮分别为目标物和环己酮的峰面积;m环己酮和m样品分别为环己酮和样品的质量。

1.5 数据处理

将得到的以样品编号、挥发性成分名称以及50种挥发性成分半定量数据的原始数据矩阵导入SIMCA-P 14.1软件(Umetrics,瑞典)进行统计学分析。首先利用PCA对不同产地48个样品分布进行整体解释,再采用OPLS-DA对PCA结果进行分组并建模。最后根据建模筛选出的成分进行独立样本t检验,根据显著性分析,筛选潜在生物标志物。

2 结果与分析

2.1 定性和半定量分析

根据HS-SPME-GC-MS检测结果,检索图谱库(Flavour 2.0和NIST 08)筛选匹配度≥90%的物质,同时结合标品保留时间进行定性,在重庆、四川、广西、云南沃柑果皮中累计检测出萜烯类、醇类、酮类、酯类、醛类和其他类50种物质,其中萜烯类18种、醇类11种、醛类10种、酯类8种、酮类1种、其他类2种,具体见表2。

半定量结果见表3所示。4个产地沃柑之间挥发性物质组成和含量均有差异。柠檬烯是主要的挥发性物质,月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、桧烯、香芹酮和α-松油醇等次之。其中,峰面积占比,柠檬烯平均为89.06%,月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、桧烯、香芹酮和α-松油醇分别为4.03%、0.98%、0.92%、0.73%、0.68%、0.38%、0.34%、0.32%、0.30%、0.26%和0.23%,这与文献基本吻合[19-21]。

2.2 模型的构建和验证

将4个产地48个样品的50种挥发性成分半定量结果组成的数据矩阵导入SIMCA-P 14.1。为了查看样品大致分布情况,首先进行无监督的PCA(图1)。

非监督PCA模型中,第1主成分解释了20%,第2主成分解释了10.7%,可见总的方差解释率不高。四川和重庆,能够较为明显的区分开,只有小部分相交,但云南和广西不能明显区分,源于两地的地理、气候环境相差不大。因此,分别对四川和重庆、云南和广西采用有监督的OPLS-DA分析,可以剔除样本中的无关因素,使组间的差异最大化,以找到不同产地间的潜在标志物。四川和重庆的OPLS-DA模型见图2。如图2-a所示,四川和重庆的沃柑在OPLS-DA模型上被完全区分开,模型能够解释X方向95%的信息(R2X=0.95),Y方向98.6%(R2Y=0.986),由Q2=0.953得知,四川和重庆模型的预测能力为95.3%,大于0.5,所建模型良好。为验证模型是否过拟合,设置假设检验的次数为200,检验结果如图2-b所示,其中R2代表模型能够解释Y矩阵的信息,Q2代表通过交叉验证计算得到的模型的预测能力,最右边值为真实值,左边值为模拟得到的值。所有R2和Q2的左边点都低于最右边点,代表其检测值都低于真实值,Q2的回归线截距为-1.16,小于0.5,且R2和Q2的回归线的斜率大于1,证明此模型没有过拟合。

如图3-a所示,广西和云南的沃柑在OPLS-DA模型上能够被完全区分开,模型能够解释X方向98.5%的信息(R2X=0.985),Y方向95.7%(R2Y=0.957),由Q2=0.745得知,广西和云南模型的预测能力为74.5%,大于0.5,所建模型良好。同样,为验证模型是否过拟合,设置假设检验的次数为200,如图3-b所示:所有R2和Q2的检测值都低于真实值,Q2的回归线截距为-1.23,小于0.5,且R2和Q2的回归线的斜率大于1,也证明此模型没有过拟合。

2.3 潜在生物标志物筛选

s-plot图代表变量在模型的贡献大小。s-plot图中,位于两端的变量在模型的贡献率较大,可能为所寻找的生物标志物。此外,VIP值可以评价变量的贡献大小,通常选用VIP>1的变量。利用SIMCA-P 14.1软件,可以得到2个模型的VIP预测值。四川和重庆两地,VIP>1的有柠檬烯、芳樟醇、月桂烯、香茅醇。广西和云南两地,VIP>1的有柠檬烯、醋酸辛酯和α-松油醇,因此,可以分别筛选出4个变量和3个变量,结果如图4所示。

再根据SPSS独立样本t检验,筛选出P<0.05的标记物,结果如表4和表5所示。

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS技术对四川、重庆、云南和广西4个主产地沃柑果皮中挥发性成分进行测定,4个产地沃柑之间挥发性成分组成和含量均有差异,其中萜烯类物质最为丰富,其次为醇类、醛类、酯类和酮类等。基于挥发性成分半定量结果,结合统计学分析,建立了四川和重庆、云南和广西沃柑的2个OPLS-DA模型,筛选出的潜在生物标志物分别较好地区分了四川和重庆、云南和广西沃柑。本文的沃柑产地判别模型,只利用了谱库和现有标品鉴定的数据,会造成部分成分缺失,可能会影响潜在生物标志物的确定,因此可以进行非靶向筛查。沃柑果皮中所含挥发性成分繁多,除产地外,还有树龄、栽培方式、管理模式等影响因素,未来应加大样本量、扩大挥发性成分范围,为产地溯源构建更加精准的预测模型。此外,后续也可以结合气相色谱-嗅辨仪和感官评定来进一步研究分析不同产地沃柑挥发性成分的差异。

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