传统化石燃料的使用在给经济发展带来无限动力的同时,也给全球环境带来如温室效应等问题,随着人们环保意识的不断提高,寻找绿色、环保的可替代燃料成为全球能源领域优先发展的战略[1-3]。生物丁醇是以淀粉、糖蜜等可再生原料为底物通过微生物发酵法生产的物质[4-8],因此在燃烧过程中不会产生新的二氧化碳,被认为是一种碳中性燃料,而且丁醇具有密度高、挥发性低、腐蚀性小等优点,近年来成为全球生物质能源领域研究的热点[9-13]。
虽然加强生物丁醇的研究有助于实现“碳达峰、碳中和”双碳目标,然而丁醇对生产菌的毒害作用会导致丙酮丁醇(acetone,butanol,and ethanol,ABE)发酵过程中出现低产物浓度及低生产效率现象[14]。有研究表明,在进行ABE发酵时当发酵液中的丁醇质量浓度达13.0～14.0 g/L时,菌体的生长会受到抑制,而当丁醇质量浓度达到或超过20.0 g/L时,细胞代谢会被迫停止[15-16]。因此,如何通过发酵过程调控等手段提高ABE的生产强度或通过诱变等方法来提高生产菌株的丁醇耐受性以减轻丁醇带来的伤害是ABE发酵过程研究的焦点。萃取发酵[17-18]、气提发酵[19]、固定化发酵[20]等均已成功用于ABE发酵,然而研究发现此时的丁醇浓度往往处于抑制浓度之下,或其生产规模仍处于实验室规模,难以进行大规模培养。若能提高生产菌株的丁醇耐受性,有可能使生产菌在较高丁醇环境中仍能持续分泌目标产物[21-22]。各国科学工作者就如何提高ABE发酵菌株的丁醇耐受性进行了大量研究,各物理化学诱变、分子生物学育种、合成生物学等均已用于高丁醇耐受性丁醇生产菌株的选育,成功地提高了微生物细胞的丁醇耐受性[23-24]。本文系统介绍了近年来高丁醇耐受性丁醇生产菌株选育的研究进展,以期为自身及其他高抗逆性微生物菌株的选育提供可参考的实践经验。
1 传统诱变育种及适应性生物进化获得丁醇耐受性菌株
1.1 化学诱变
化学诱变是工农业生产与实验室常用的育种技术之一,指采用化学物质(如烷化剂、移码突变剂、碱基类似物等)对微生物进行处理,从而达到改变其性状为目的的方法[25]。化学诱变剂的特点之一是专一性强,即其在处理过程中往往只作用于基因的某个部位,但是对其他部位没有作用。而且由于大多数化学诱变剂都具有生物学毒性、易致癌和挥发,在使用时应避免直接与皮肤接触,并严格遵守实验操作规则。亚硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)[26]、甲基磺酸乙酯[27]、氯化锂[28]等试剂已成功用于高丁醇耐受性菌株选育。虽然化学诱变技术是一种传统且经典改变生产菌性能的方法,但由于其只作用于基因的某个特定部位,若连续使用会导致诱变效率大大降低,而且诱变剂往往具有致癌和挥发性,因此在实际的应用中受到一定的限制。
1.2 物理诱变
物理诱变指利用各种物理因素与细胞内物质特别是大分子核酸和蛋白质反应,引起分子结构改变。传统的物理诱变以辐射诱变(如X-射线、γ-射线、紫外等)最为常见,然而传统的物理诱变在应用过程中虽然具有设备简单、操作方便、成本低等优点,但还是会存在如操作过程周期长、工作量大以及难以有效控制变异方向等问题,因此新型物理诱变技术包括低能离子束注入、重离子束辐射、常压室温等离子诱变等[29-30]的出现逐渐成为物理诱变技术的主流。
离子束是指元素的离子经高能加速器加速电离成离子后,获得一束具有能量的带电粒子放射线。20世纪80年代中期,余增亮等[31]首次提出了通过低能离子束进行遗传改良的方法,开辟了离子束在生物技术上应用的新途径。该技术与传统的物理诱变相比具有突变率更高、成本低廉等特点。本课题组通过低能离子束注入处理Clostridium beijerinckii L175,最终获得突变菌株IB26,其与初始菌株相比,丁醇产率和丁醇耐受性显著提高[1]。重离子通常是指原子序数大于2的原子(碳、氮、氖、硼等)被剥掉或部分剥掉外围电子后的带正电的原子核,将重离子通过加速器装置加速而形成的具有能量的射线就是重离子束,其同样具有改变细胞遗传质的作用。
常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变指在室温常压条件下,使用高浓度氦气产生大量的等离子体射流使细胞DNA单链或双链发生断裂,损伤微生物的遗传物质 DNA,引起微生物突变,与传统物理诱变相比,ARTP诱变具有易人工控制、诱变效率高等优点。本课题组采用ARTP诱变技术对Clostridium acetobutylicum进行诱变处理,获得了突变菌株ART18,其丁醇耐受性及发酵性能均有较大改善[32]。上述新型物理诱变技术与传统物理诱变相比,所获菌株的突变率高、损伤率低、成本低、易操控,解决了传统诱变转化率低、成本高、难操纵等问题,若能进一步提高诱变后筛选的效率,该方法有望成为物理诱变技术获得高抗逆菌株主要方向。
1.3 适应性实验室进化及复合诱变
适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution,ALE)是在特定环境条件下,人工模拟自然进化中的变异和选择过程,借助人工选择压力促使菌株完成适应性定向进化,最后从进化群体中获得性能提高的菌株的一种方法[33-34]。复合诱变是通过2种或多种诱变剂对菌株进行诱变的一种方式。在微生物育种过程中,单因素诱变技术虽可以获得较优良的突变菌株,但是由于存在突变谱简单、易产生“疲劳效应”等问题,可能会对突变菌株带来不利影响[35]。因此,实际育种过程中,经常采用复合诱变技术对菌株进行处理,通过诱变剂之间的协同调控来弥补单一诱变的缺陷,获得更为丰富的突变菌库。本课题组利用丁醇胁迫驯化及ARTP诱变技术对Clostridium beijerinckii L8进行复合诱变处理,获得突变菌株Y10,研究发现其能耐受25.0 g/L丁醇胁迫环境;而且当以混糖为发酵底物时,丁醇和总溶剂产量分别为10.51 g/L和12.16 g/L,相较于原始菌株分别提高了38.6%及33.5%[36]。上述诱变方式均为不定向诱变,具有不确定因素,产量和耐受性虽然相对而言有所提高,但是提高数量有限,生产菌株的丁醇耐受与产量仍然是ABE工业进程的瓶颈之一,因此,有必要通过其他手段克服这一瓶颈,推动ABE产业化的发展。
2 采用合成生物学技术获得丁醇耐受性菌株
合成生物学这一概念最早在1911年由法国科学家 Strphane Leduc首次提出。合成生物学近年来逐渐发展成为一交叉学科,通过结合分子和细胞生物学、进化系统学、生物化学、计算机科学等多学科技术,将工程原理应用于研究和改造生命系统,达到创造、编程和控制细胞行为[37]。近几十年来,合成生物学在化工、能源、农业、环境和医学领域显示出巨大的潜力。随着合成生物学的发展,越来越多的化合物可以通过改造培养的微生物获得,人们正在努力实现对微生物的高效和精确改造。
2.1 基因编辑技术
多种合成生物学技术的引入为提高生产菌的丁醇耐受性改造迎来新的发展。促进了产丁醇微生物的基因编辑技术的开发,目前已开发的用于产丁醇微生物的基因编辑技术主要有:反义RNA与RNA干扰;ClosTron;CRISPR/Cas;单碱基编辑技术,此4种基因编辑的基本原理及优缺点如表1所示。
表1 基因编辑工具的基本原理及优缺点
Table 1 Basic principles and advantages and disadvantages of gene editing tools
基因编辑技术基本原理优缺点参考文献反义RNA碱基互补结合的方式形成双链,从而抑制相关基因,使其不表达的方法操作简单、适用范围广、特异性强、安全性高,但成本高、靶基因定位困难[41-43]ClosTron技术含有催化能力的内含子RNA“自我接合”生成套索RNA,通过IEP 的协助,形成复合体,并识别靶DNA位点,插入、失活靶基因,实现“重组”转化率高,稳定性好,但容易出现脱靶现象、细胞毒性[44-47]CRISPR/Cas由RNA介导Cas蛋白,对靶基因进行特异性识别与切割操作简便、成本低、成功率高、修饰效率高,非目标突变多、存在脱靶现象[48-50]单碱基编辑技术通过在双链造成但切口后对碱基进行单碱基的替换编辑高效、损伤少、非目标突变少,但易癌变、存在编辑特异性、编辑窗口宽度等问题限制[45]
从表1可知,反义RNA是指mRNA与靶RNA通过碱基互补结合的方式形成双链,从而抑制相关基因,使其不表达的方法,反义RNA主要分为DNA复制、转录、翻译3个方面,抑制DNA的复制、阻止转录、抑制mRNA的翻译。与传统的基因敲除技术相比,具有操作简单、安全性高、适应广泛。RNA 干扰是在反义RNA的基础上形成的一种全新技术,有高效特异性、可传播、可遗传性等特点,在基因敲除、遗传疾病治疗等方面应用广泛。ClosTron是一种常用于梭菌的基因失活工具,它依赖于二型内含子的特异性插入,非常适合梭菌的基因重组。规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)是绝大多数细菌和古细菌的可遗传的免疫系统,该系统由CRISPR序列和编码Cas基因组成,CRISPR系统主要分三类,其中第二类中的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1具有研究应用的前景[38-39]。单碱基编辑技术是在CRISPR/Cas9技术基础上衍生出的一种精准定点的基因编辑技术,主要分为2种:胞嘧啶单碱基编辑(cytosine bases editor,CBE)技术;腺嘌呤单碱基编辑(adenine bases editor,ABE)技术[40],与常规的基因编辑技术比较,单碱基编辑技术具有效率高、安全性高、副产物相对更少等优势,在生物领域具有广泛的应用前景。
2.2 遗传改造策略
在各种限制丁醇合成的因素中,丁醇对细胞的毒性是导致出现低生产量与产率的主要原因之一,丁醇对微生物细胞的抑制或毒性作用主要分为2个方面:a)改变细胞膜原有结构及相关功能,使物质转运受到影响;b)破坏了细胞原来的代谢途径,造成细胞生长或产物合成受到影响[51-55]。因此,为减少丁醇对细胞生长或产物合成带来的不利影响,目前利用基因工程手段对菌株进行改造主要从以下2个方面展开:a)对丁醇合成途径进行改造,或使碳流代谢更多的转向丁醇合成;b)过表达细胞中一些抗逆基因,提高菌株对丁醇的耐受能力,从而提高溶剂产量。
2.2.1 细胞膜相关基因改造
细胞膜具有保护作用,同时也是细胞控制物质进出的渗透屏障。微生物细胞膜中脂肪酸的调节不仅对维持细胞膜的完整性至关重要,而且对膜结合蛋白也有重要影响[56]。微生物细胞通过修饰磷脂双分子层中的脂肪酸,可以改变细胞膜的组成,保持稳定的膜结构,防止溶剂的渗透,从而使溶剂的耐受性提高[57]。热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)又称分子伴侣,当微生物处在胁迫环境时,HSPs会大量表达并积累,参与应激应答反应,进而维持细胞稳态,抵抗不良环境产生的侵害[58-59],LUAN等[60]研究发现通通过过表达Thermoanaerobacter tengcongensis的groESL基因,提高了微生物细胞的应激耐受性,从而提高丁醇产量。外排的保护机制是基于主动从细胞中排出有毒化合物,外排量的增加可以改变代谢通量,促进生物转化途径[61]。SEDLAR等[62]研究发现Pseudomonas putida对丁醇等小分子具有突出的耐受性,作者推测外排泵可能在这种稳健性中发挥重要作用,过表达Pseudomonas putida外排泵基因srpB,外排泵将更多的抑制物小分子运输到胞外,以保持微生物正常的代谢活动,从而改善细胞对丁醇的耐受性,显著增加了菌株的鲁棒性[63]。双组分系统(two-component regulatory system,TCS)通常由膜蛋白结合的显示信号调节的组氨酸激酶和对应的反应调节底物组成,主要通过感应信号转导和响应调节器来适应不同的环境变化[64-65],Clostridium acetobutylicum中的双组分系统BtrK/BtrR基因可进行多功能调控,通常会影响有关丁醇耐受的多个关键基因和相关代谢途径,通过过表达BtrK/BtrR基因,能有效提高重组菌株的丁醇耐受性[66]。通过修复受损蛋白、有机溶剂外排胞外、维持细胞稳态等方式均能有效提高菌株丁醇耐受性,上述研究结果可为今后产溶剂梭菌通过对细胞膜相关的基因改造来提高丁醇耐受性提供相关的理论基础。
2.2.2 糖酵解途径的基因改造
ABE的发酵过程主要分为2个阶段:产酸期和产溶剂期,目前对代谢途径的改造重点集中在下游的代谢酶,对上游的研究相对较少,而糖酵解途径则在产酸阶段具有重要作用,当糖酵解速率提高时,会加速分泌乙酸,从而使ABE的代谢过程快速转入到溶剂合成阶段。在产酸期6-磷酸果糖激酶pfkA、丙酮酸激酶pykA是糖酵解途径的关键酶,通过过表达这2个基因,能显著增加细胞内NADH、ATP的浓度,从而间接提高丁醇耐受性[67]。有研究表明对Clostridium acetobutylicum进行基因改造,将6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶编码基因进行过表达,可有效提高突变菌株胞内ATP和NADH浓度,此时菌株对丁醇的耐受性与ABE的发酵性能也相应有所提升[68]。上述研究在产溶剂梭菌中实现了糖酵解途径相关基因的过表达,从而改变细胞中ATP和NADH的含量,提高了菌株对丁醇的耐受性,这对于产溶剂梭菌丁醇耐受性的遗传改造十分重要。
2.2.3 转录因子定向改造
转录因子是指通过序列特异性方式结合DNA并且能激活或抑制其他基因转录的蛋白质。它的表达激活了几个功能性抗性基因的同时表达,从而提高了转录因子的水平,改善了生物体的抗性特性,与传统的插入或增强单个功能性基因以改善特定抗性的方法相比,这是一种通过修改或增强关键转录因子来改善抵抗不良环境能力的更有效方法,能获得同步的、全局的最优效果。LI等[69]利用非靶向转录组学方法探索ABE发酵培养条件下生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)的表达,通过对已鉴定的高表达Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 (Csa) nrps3基因进行敲除得到突变菌株Δnrps3,其与野生菌株相比,在指数期表现出生长缺陷,转录组分析表明,该非核糖体肽合成酶基因与丁醇耐受性有关。虽然转录因子介导的修饰策略具有应用灵活和易于调控目标基因表达的优势,但精确识别基因组上特定的转录因子结合位点以及转录因子在结合后最终如何参与转录调控仍是一个挑战。
2.3 组合策略获得丁醇耐受性菌株
组合策略(combinatorial strategy)是指同时应用2种及以上策略,以达到控制单一因素组合和叠加的效果,此策略比单因素具有更好的控制效果,节约了时间。通过旁系同源基因家族组合策略进行多质粒共转化,能获得丁醇耐受性增强的突变体,而且该共转化组合策略可为快速探索同源家族基因在细胞生存、细胞生长和目标产物代谢中的多样性功能提供了可能[70]。工程菌株对丁醇耐受性的表型是由一个复杂的基因网络控制,组合策略相对于单因素策略,更具有综合性,可能会更好地调动微生物生产的积极性和潜能,有助于富集工程菌耐丁醇的有益性状,具有良好的发展前景。
3 问题与展望
随着世界能源价格与供给的波动以及人们环境保护意识的不断提高,以可再生原料生产能源物质成为全球优先发展的策略。虽然生物丁醇近年来成为生物质能源领域研究的热点,然而丁醇对生产菌的毒性作用导致丁醇合成效率的降低限制其大规模生产,而提高生产菌的丁醇耐受性是解决这一困境有效途径之一。本文系统回顾了近年提高菌株丁醇耐受性的各种策略,其中:a)通过物理、化学诱变及适应性生物进化获得丁醇耐受菌株的方法虽然操作简单、效果明显,但是存在盲目性大等缺点;b)合成生物学的诞生使选育丁醇耐受菌株迈向了理性化的时代。通过相关基因的编辑和改造进行定向突变,更具有目的性,并且更准确有效,因此成为最重要的解决措施之一。另外提高丁醇耐受性并非操纵单个基因即可完成,需多个基因共同改造,但是,目前构建耐受菌株的遗传背景较为复杂,其机制不够清晰,此方面有待进一步深入研究;c)过表达正调控基因或敲除负调控基因也是目前激活沉默基因簇的有效手段,但因为很多工业菌种遗传操作难、生长速度慢等因素也不利于对菌种进行遗传改造。对丁醇耐受细菌应用局限性的分析揭示了未来的研究应侧重于:a)将微生物耐受表型与特定利用相结合,以实现丁醇耐受性和生产之间的最佳平衡;b)未来的进一步优化可以通过使用动态或基因组规模的代谢网络模型驱动分析,因此跨物种代谢途径,尤其是代谢物递送,可以合理设计和调节更高的效率和鲁棒性;c)随着酶的定向进化、反向代谢工程、基因组模型化等技术的进步,人们可以采用更为广泛的技术手段对丁醇生产菌进行升级改造。因此有理由相信在不久的将来会有更多丁醇耐受性以及发酵性能均提高菌株的出现,从而有力推动丁醇发酵工业化的进程。
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