霉鱼起源于江西,在永丰、吉安县等地区流行,形成了吉水霉鱼、乐安霉鱼、峡江霉鱼等品种[1]。其历史悠久,口味独特,香、辣、咸、鲜,是极具代表的地方特色下酒菜。传统自然发酵的霉鱼色泽红亮,香辣咸鲜,口感紧实,回味悠长,具独特风味[2]。然而,传统自然发酵霉鱼的生产过程多依赖人工经验,导致产品质量参差不齐,口感与风味不稳定,食用安全性存在潜在风险,因而亟需对该工艺过程进行标准化关键技术调控,改善其产品品质与风味[3]。
微生物接种发酵是提高发酵鱼制品品质的一种有效手段[4-5]。传统自然发酵制品是微生物发酵菌种如乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等的主要来源[6-7]。目前已有对于酸鱼、臭鳜鱼等发酵鱼制品的风味研究的报道,但对其他发酵鱼制品的研究还不够充分。霉鱼作为江西吉安地区传统特色的发酵鱼制品[8],对其发酵过程中微生物菌群组成和风味的研究鲜有报道,对其乳酸菌资源的研究和应用亦尚未见报道。因此,本研究以传统的自然发酵霉鱼作为分离基质,从中分离并鉴定了清酒乳杆菌,并对其生物学特性进行研究,同时,结合吉安霉鱼制作工艺,采用清酒乳杆菌接种发酵霉鱼,研究菌株对霉鱼发酵过程中质构、色泽和挥发性风味物质的影响,以期为霉鱼发酵基础研究和工业化生产提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验样品
霉鱼,江西省吉安市永丰县菜市场。
鳙鱼(Aristichthys nobilis),南昌市南昌县菜市场,规格为2.5～3.0 kg/尾。
1.1.2 培养基
MRS液体培养基(1 L)、营养琼脂培养基(1 L),Solarbio公司。
MRS-溴甲酚紫鉴别培养基(1 L):溴甲酚紫0.1 g、MRS琼脂培养基(1 L),Solarbio公司。
水琼脂培养基(1 L):琼脂粉15 g。
以上培养基均用蒸馏水配制和定容,在备用前需要30 min的115 ℃高压灭菌处理。
1.1.3 试剂
食用盐、辣椒面等调料,南昌市天虹超市;氯化钠、无水乙醇,西陇科学股份有限公司;DNA提取试剂盒,TIANGEN公司。
1.2 仪器与设备
恒温振荡培养箱,上海智城分析仪器制造有限公司;PCR仪,Bio-Rad公司;电泳仪,北京六一生物科技有限公司;高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;TA-TXplus质构分析仪,英国Stable Micro System公司;CR-10色差仪,日本柯尼卡公司;电子鼻,德国Airsense公司;DVB/CAR/PDMS萃取头,美国Supelco公司;7890A/5975气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 清酒乳杆菌的分离鉴定
参照文献[9]方法从霉鱼中分离鉴定清酒乳杆菌。
1.3.2 清酒乳杆菌的生物学特性
1.3.2.1 菌株的最适培养pH和温度
以培养至24 h的菌液OD600为评价指标,探索菌株在MRS液体培养基的最适初始pH以及最适培养温度。
1.3.2.2 菌株耐盐、抑菌能力
参照文献[9]的方法测定菌株耐盐能力。参照文献[10]的方法检测菌株对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及从传统发酵霉鱼中分离的嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)、沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)的抑制效果。
1.3.3 清酒乳杆菌对霉鱼食用品质及挥发性物质形成的影响
1.3.3.1 发酵工艺流程
自然发酵霉鱼制作流程:
a)取新鲜鳙鱼,除去鱼鳞,剖腹宰杀,去除内脏、鱼头和鱼尾,用流水清洗干净;
b)切成宽二寸长四寸块状,晾干,放入盆中,加食用盐(5%,质量分数)拌匀;
c)待2 h后再拌辣椒面(按照质量分数10%加辣椒面),并逐块放入干净的罐中,发酵48 h。
接种发酵霉鱼制作流程:
将1.3.3.1节b)中鱼块晾干后,改为按1.00 kg鱼块添加1.25 g清酒乳杆菌湿菌体的量,将清酒乳杆菌均匀涂抹在鱼块的表面,在盆中加食用盐拌匀。
1.3.3.2 色泽、质构测定
参照LUO等[11]和周迎芹等[12]的方法测定鱼肉的色泽、质构,每个样品平行测定6次。
把样品切成1 cm厚的块状,采用手持色差仪测定鱼肉的亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*),以平均值作为各参数测定值。样品白度的计算如公式(1)所示:
白度
(1)
参照文献[12]的方法测定质构各参数。
1.3.3.3 电子鼻检测
称取5.00 g霉鱼样品放入15 mL离心管中,用保鲜膜封口,水浴平衡30 min,后插入电子鼻探头进行测定。测定条件:清洗时间100 s,检测时间100 s,载气速度为300 mL/min,进样流量为300 mL/min。电子鼻的10个标准传感器信息见表1。
表1 PEN3型电子鼻的标准传感器信息
Table 1 Standard sensor information of PEN3 electronic nose
序号传感器名称功能描述1W1C对芳香成分灵敏2W5S对氮氧化物灵敏3W3C对氨水、芳香成分灵敏4W6S对氢化物灵敏5W5C对烷烃、芳香成分灵敏6W1S对甲基类灵敏7W1W对硫化物灵敏8W2S对乙醇灵敏9W2W对芳香成分、有机硫化物灵敏10W3S烷烃高浓度检测
1.3.3.4 挥发性风味物质测定与鉴定
参照文献[13]的方法对霉鱼挥发性风味物质进行测定与鉴定。
1.3.3.5 关键风味物质分析
采用刘登勇等[14]提出的相对气味活度值法(relative odor activity value,ROAV)对自然发酵和接种发酵的霉鱼中关键风味化合物进行分析。
1.4 数据处理
所有试验结果以平均值±标准差表示,采用Origin 2018绘图,Mega 6.0构建细菌系统发育树,显著性差异分析采用SPSS 16.0中Duncan检验,P<0.05表示存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 清酒乳杆菌的分离与鉴定
利用传统分离培养手段,从自然发酵霉鱼中分离到一株符合清酒乳杆菌形态学特征的菌株,并命名为1-3。菌株1-3的菌落特征(图1-a)为黄色,边缘整齐,中央凸起,表面光滑;革兰氏染色呈阳性,短杆状排列,无鞭毛,无芽孢,单个或成对,成链状排列(图1-b和图1-c)。对菌株1-3的16S rDNA基因进行测序,测序后,利用NCBI网站上进行BLAST分析,筛选出同源性较高的16S rDNA的基因序列作为参比对象,采用领接法构建进化树。由图2可确定菌株1-3为清酒乳杆菌。
a-菌落形态;b-革兰氏染色结果;c-扫描电镜图
图1 清酒乳杆菌1-3的形态特征
Fig.1 Morphological characteristics of L.sakei 1-3
图2 清酒乳杆菌1-3的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of L.sakei 1-3
2.2 清酒乳杆菌的生物学特性
2.2.1 清酒乳杆菌的最适培养pH和温度
对菌株1-3培养pH和温度进行优化,结果如图3所示。在pH为4.0～8.0时,菌液OD600值不断升高,pH值为8时OD600值最大,为1.58±0.04。当pH进一步升高后,可能由于不再适合菌株生长,菌液OD600骤降。在培养温度为4～25 ℃时,随着温度升高菌液OD600升高,在25～42 ℃则随着温度升高而下降。因此可知菌株1-3的最适培养条件为pH 8,温度25 ℃。
a-pH;b-培养温度
图3 不同pH值和培养温度培养对清酒乳杆菌1-3生长的影响
Fig.3 Effects of different pH and culture temperature on the growth of L. sakei 1-3
2.2.2 清酒乳杆菌耐盐、抑菌能力
对菌株1-3耐盐能力进行测定,结果如图4所示。在0.00～0.04 g/mL的NaCl添加量下,菌液OD600显著下降,从2.02±0.01降低至1.90±0.00。当NaCl添加量为0.08～0.10 g/mL时,菌液OD600有所下降,但不明显,且菌液OD600仍可维持在1.80以上,表明菌株1-3具有一定的耐盐能力,在较高盐浓度的环境中仍能生长和繁殖得较好。
图4 清酒乳杆菌1-3对NaCl的耐受结果
Fig.4 Tolerance of L.sakei 1-3 to NaCl
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
以金黄色葡萄球菌以及本实验室在霉鱼中分离到的沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单孢菌作为指示菌,研究清酒乳杆菌1-3的抑菌能力,结果如图5所示。由图5 可以看出,菌株1-3培养上清液对所有指示菌均有不同程度的抑制作用。对霉鱼源沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单孢菌抑菌圈直径分别为(11.55±0.36) mm,(12.27±0.33) mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到(11.62±0.42) mm。
a-沙雷氏菌;b-嗜麦芽窄食单孢菌;c-金黄色葡萄球菌
图5 清酒乳杆菌1-3对病原菌的抑制效果
Fig.5 Inhibitory effects of L. sakei 1-3 to pathogens
注:各平板右下角圆孔内液体为MRS液体培养基,其余3个圆孔内液体均为菌株培养上清液。
2.3 清酒乳杆菌对霉鱼食用品质及挥发性物质形成的影响
2.3.1 清酒乳杆菌对鱼肉色泽、质构的影响
自然发酵和接种发酵霉鱼无明显色差,通过清酒乳杆菌接种发酵后,霉鱼的白度和亮度均降低(图6),鱼肉质构无明显变化,具体表现为硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均无显著性变化(图7),表明清酒乳杆菌接种发酵对霉鱼的色泽和质构无明显影响,可用来接种发酵霉鱼。
图6 清酒乳杆菌1-3对霉鱼色泽的影响
Fig.6 The influence of L.sakei 1-3 on the color of fermented bighead carp
a-硬度;b-弹性;c-内聚性;d-咀嚼性
图7 清酒乳杆菌1-3对霉鱼质构的影响
Fig.7 The influence of L.sakei 1-3 on the texture of fermented bighead carp
2.3.2 基于电子鼻技术分析清酒乳杆菌对鱼肉气味的影响
自然发酵和接种发酵霉鱼电子鼻结果如图8所示,2组样品的响应值差异主要在W1S(对甲基类敏感)、W1W(对硫化物敏感)。接种发酵的霉鱼比自然发酵霉鱼对硫化物响应度高,对甲基类的响应度低。但2组样品对甲基类、对硫化物的响应度均较大。
图8 电子鼻传感器的响应雷达图
Fig.8 Response radar chart of electronic nose sensor
2.3.3 清酒乳杆菌对鱼肉挥发性风味物质形成的影响
2.3.3.1 霉鱼挥发性风味成分分析
对自然发酵和接种发酵霉鱼挥发性风味成分进行对比分析,结果见图9和附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)。霉鱼共检测出66种挥发性风味物质,包括烃类8种,醇类14种,醛类5种,酮类10种,酯类13种,酸类2种,芳香类6种和其他类8种。自然发酵霉鱼中检出41种挥发性风味物质,接种发酵霉鱼中检出54种挥发性风味物质,比自然发酵霉鱼多13种风味物质,说明相比于自然发酵,利用清酒乳杆菌发酵可以有效丰富霉鱼的风味。不同发酵方式下霉鱼挥发性风味物质组成和占比存在着差异,自然发酵霉鱼中相对占比最高的是醇类物质为(37.87±3.57)%,而接种发酵霉鱼中醇类物质只占(25.43±0.53)%;接种发酵霉鱼中挥发性物质以芳香类为主,相对占比为(35.23±0.98)%。此外,接种发酵霉鱼中还检测出酸类物质,且比自然发酵多4种酯类物质。
a-风味成分类别;b-风味成分占比
图9 霉鱼风味成分类别及占比
Fig.9 Flavor composition category and proportion of fermented bighead carp
烃类物质感官阈值高,对霉鱼整体风味影响小,但烯烃类化合物可形成醛酮类物质[15-16]。2种发酵方式下霉鱼中烃类物质含量均较高,主要为十七烷,分别为(8.64±3.54)%和(14.53±2.37)%。此外,接种发酵霉鱼中检测出的烯烃化合物较多,如衣兰烯、雅榄蓝烯和(E)-14-十六碳烯等。醇类物质阈值一般较高,对风味贡献较小,但不饱和醇类阈值较低,对霉鱼整体风味贡献较大,如1-辛烯-3-醇,阈值为1 μg/kg,具蘑菇香、油脂味和土腥味[17];芳樟醇感官阈值为6 μg/kg,具柑橘味、花香、木香等特征风味,可能来自于霉鱼制作过程中添加的辣椒面,其在自然发酵和接种发酵霉鱼中均被检出。
醛类物质主要来源于不饱和脂肪酸的氧化降解,阈值低,对霉鱼的整体风味影响大,通常具甜味、清香、果香、脂香等良好风味[18]。自然发酵霉鱼中醛类物质仅为(0.02±0.00)%,而接种发酵霉鱼醛类含量相对较高为(3.24±0.03)%,且种类较多,说明接种发酵可较好改善霉鱼风味。自然发酵和接种发酵霉鱼中酮类物质种数较多,均为9种,酮类物质主要是脂质氧化和氨基酸降解的产物,感官阈值较醛类高,但具有独特的清香和果香[19],如β-紫罗兰酮和2-壬酮[20],在自然发酵和接种发酵霉鱼中均有检出,可能对霉鱼的风味有一定增强作用。
酯类物质由醇和羧酸的酯化反应形成,呈淡淡的果香和清香[21]。接种发酵霉鱼中酯类物质11种,含量为(6.89±0.70)%,均明显高于自然发酵,表明接种发酵霉鱼风味较好。酸类物质通常具刺鼻的不愉快的气味,阈值较极高[16],对霉鱼整体风味影响小。接种发酵霉鱼中酸类物质含量仅为(0.09±0.00)%,而自然发酵未检出,这可能是在自然发酵霉鱼中含量过低而未能检测出。接种发酵和自然发酵霉鱼均检出含量较高的芳香类物质,其可能来自于类脂、烃类等化合物高温下裂解,或来源于香辛料[22]。其中愈创木酚(10 μg/kg)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3 μg/kg)的阈值低,对霉鱼熏肉香、烟熏味等气味贡献较大。此外,霉鱼中还检测出少量吡嗪、吡啶、呋喃等杂环类化合物,是一类重要的风味化合物,感官阈值相对较低,可由脂质氧化、美拉德反应形成,具很强的烤肉味、坚果香、火腿香味等[23]。
2.3.3.2 霉鱼关键风味成分
风味贡献取决于挥发性化合物占比及其阈值[24]。对霉鱼挥发性风味物质进行ROAV分析,该方法认为ROAV越大对整体风味贡献越大。由附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035983)可知,自然发酵和接种发酵霉鱼关键风味成分相似,但也存在一定差异,自然发酵和接种发酵霉鱼中分别得到3种和2种关键风味成分。
在自然发酵和接种发酵霉鱼中的均有检出茴香脑、桉树醇,苯乙酮等,赋予了霉鱼辛香、木香味,其可能主要来自于制作过程中添加的辣椒面[25]。2种霉鱼中醇类物质ROAV最大的均为1-辛烯-3-醇,在接种发酵和自然发酵霉鱼中分别为4.86和4.95,其对霉鱼蘑菇香、油脂味和土腥味等气味具有较大贡献。贡献甜香、木香的芳樟醇为臭鳜鱼重要的风味物质[12],在霉鱼中也有检测出,其对霉鱼独特风味的形成起到重要的修饰作用。β-环柠檬醛仅在接种发酵霉鱼中检出,ROAV>0.1,对霉鱼风味有修饰作用,贡献清香、花香。在自然发酵和接种发酵霉鱼中β-紫罗兰酮ROAV均为100,对霉鱼的整体风味贡献最大,贡献了花香、果香、木香。2-十一酮仅在接种发酵霉鱼中检出,对霉鱼风味有重要的修饰作用,具蜡香、奶油香、油脂味。在接种发酵霉鱼中还发现异戊醇(酸臭味)和一些常见的腥味物质[26]如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然发酵霉鱼中的ROAV值小,说明清酒乳杆菌的接入,可以降低腥味和酸臭味,增加香气,提升霉鱼的风味。酯类物质通常阈值较高,其ROAV较小,对霉鱼的整体风味贡献不大,但在接种发酵霉鱼中的酯类物质较自然发酵霉鱼要丰富,共同赋予霉鱼酯香、蜡香、甜香等。
综上可知,清酒乳杆菌的接入,可以在一定程度上降低腥味和酸臭味,改善发酵制品的风味,使得霉鱼中各种类风味物质含量较为均衡,共同造就霉鱼酯香、甜香等多层次风味特征。
3 结论
从传统自然发酵霉鱼中分离出一株清酒乳杆菌,命名为1-3,其在MRS液体培养基中最佳培养条件为pH 8,温度25 ℃。该菌对沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌和嗜麦芽窄食单孢菌具有抑制作用,可耐受10%的NaCl浓度;菌株1-3接种发酵霉鱼与自然发酵霉鱼相比,色差、质构均无显著性差异。电子鼻结果表明,接种发酵的霉鱼比自然发酵霉鱼对硫化物响应度高,对甲基类的响应度低,但2组样品对甲基类、对硫化物的响应度均较大。自然发酵和接种发酵霉鱼中分别检出41种和54种挥发性风味物质,自然发酵霉鱼中相对含量最高的是醇类物质为(37.87±3.57)%,而接种发酵霉鱼中醇类物质只占(25.43±0.53)%;接种发酵霉鱼中挥发性物质以芳香类为主,相对含量为(35.23±0.98)%。自然发酵和接种发酵霉鱼中分别得到3种和2种关键风味成分,其中接种发酵霉鱼中异戊醇(酸臭味)和一些常见的腥味物质如1-辛稀-3-醇、2-壬酮和2-庚酮等的ROAV值均比自然发酵霉鱼中的ROAV值小。综上,利用清酒乳杆菌株纯种发酵霉鱼工业化生产可行,比自然发酵霉鱼挥发性成分种类多,在一定程度上降低腥味和酸臭味,并产更多样化的酯类化合物,赋予霉鱼更浓郁的酯香、甜香。后续可进一步通过分子感官科学手段,研究接种发酵霉鱼发酵过程中主体风味物质形成途径,为霉鱼特殊风味的形成机理提供参考依据,进一步指导霉鱼的风味品质优化。
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