蛋清蛋白(egg white protein, EWP),一种营养丰富的优质蛋白,具有较高的消化率及人体所必需的8种氨基酸,因其具有乳化性、起泡性、凝胶性等优良特性,常作为功能性原料应用于食品、农业中[1]。其乳化性和凝胶性不仅有利于食品的质地、形态及持水性,同时可改善食品风味和口感等[2],因此被广泛应用于肉制品、焙烤等食品中。食品工业中为提高蛋清粉凝胶性、乳化性等加工特性,通常使用的3种改性方法有物理[3]、化学[4]和酶法改性[5],其中物理改性中的热诱导因能耗低、效率高、产品品质高且安全等优点被广泛应用[6]。其机理为将蛋白质加热至变性后部分蛋白质结构展开和聚集,一定量的蛋白质之间或与蛋白质包裹的脂肪滴形成三维网络结构[7]。研究表明,脂质和蛋白质间的相互反应对凝胶体系的性质和结构具有较大影响[8]。CHANG等[4]研究发现热改性能可有效提高蛋白质油水界面的吸附力,从而提升EWP的起泡性、乳化性、热稳定性及凝胶特性。方艾虎等[9]制备了不同油相质量分数下的卵清分离蛋白-亚麻籽油乳液体系,并研究其流变特性、粒径分布、微观结构等特性,结果表明在高油相质量分数下凝胶体系稳定性增强,黏度提高,粒径减小,证明了高油相乳液体系具有良好的可行性。
黄油具有易消化吸收、较好的溶化性及加热融化后的独特乳香等优势[10],是乳制品焙烤食品的必备原料之一。此外黄油含有维他命、短链脂肪酸、矿物质(如钙、磷、钾)等营养物质[11-12],并具有提高免疫力、改善贫血和胃肠道疾病等作用[13],适量食用可改善因食用不饱和脂肪酸或人造奶油造成的贫血症状,且与蛋白结合应用到食品中可改善产品质地、乳化性及质构特性。EWP具有与乳化盐相似的乳化特性,黄油又因其营养价值及质地和口感成为制备乳制品的必备原料。目前,通过添加油脂改善凝胶品质的研究有较多报道,但关于EWP和黄油制作复合凝胶并探讨其性质的研究鲜少报道。
本研究以EWP和黄油为原料,通过热诱导的处理方法制备含有不同浓度黄油的EWP/黄油复合凝胶,并研究其质构特性、持水性、乳化性、乳化稳定性、流变特性及微观结构的变化,以利用其乳化性及凝胶特性,为后续部分替代乳化盐,减少食品中乳化盐的用量,制备低钠食品提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
EWP粉(蛋白含量78%,食品级),山东硕丰生物科技有限公司;黄油(食品级),涞水县金谷粮油食品有限公司;柠檬酸(食品级),河南万邦化工科技有限公司;十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Na2HPO4、NaH2PO4(分析纯),天津市德恩化学试剂有限公司;Nile Red、Nile Blue(分析纯),上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高速均质乳化机,常州越新仪器制造有限公司;TG16-WS台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器有限公司;Instron Universal 5544 型食品物性分析仪,美国Instron公司;TA DHR-2流变仪,美国TA仪器有限公司;TM3030plus SEM台式扫描电镜,日本日立高新技术公司;LGJ-10D型冷冻干燥机,北京四环科技仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;LSM 900激光扫描共聚焦显微镜,蔡司光学有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 EWP/黄油复合凝胶的制备
用去离子水制备140 g/L的EWP粉溶液,置烧杯中磁力搅拌1 h后,9 000 r/min均质EWP溶液3 min,55 ℃水浴加热1 h水合,以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的质量比倒入融化后的黄油(55 ℃乳化10 min),10 000 r/min均质5 min使其完全均质化,调pH值至6.0,随后90 ℃热处理变性30 min,流水冷却后即得EWP/黄油复合凝胶,取部分样品于4 ℃保存24 h后测定质构特性及持水性,部分样品真空冻干后用以乳化性、乳化稳定性及扫描电镜检测,其中未添加黄油的EWP凝胶作为空白对照。
1.3.2 质构特性测定
参照ZHENG等[14]方法,稍作改动。取1.3.1节所制样品置于烧杯中(样品直径5.0 cm、高度1.5 cm)待测。物性分析仪参数设定:测试前速率5 mm/s,测试速率2 mm/s,测试后速率5 mm/s,测试形变30%;探头为P/36 R,测定样品的硬度、弹性、胶黏性及内聚性,每个样品平行测定3次。
1.3.3 持水性测定
参照ZHAO等[15]方法,以10 mL离心管质量记为m0(g),将1.3.1节制备好的凝胶样品转至离心管中,样品与离心管总质量记为m1(g),室温下10 000 r/min离心10 min,滤纸将上层及表面水分吸干后称质量记为m2(g),重复3次,按公式(1)计算复合凝胶样品的持水性(water holding capacity,WHC)。
(1)
式中:m0,离心管的质量,g;m1,离心管和样品总质量,g;m2,离心后离心管和样品总质量,g。
1.3.4 乳化性及乳化稳定性测定
参照刘丽莉等[16]检测方法,将1.3.1节所制冻干样品溶解于pH 6.0,100 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中(1 mg/mL),取18 mL样品加入6 mL大豆油于室温下10 000 r/min均质1 min以形成乳化液。分别在均质后0 min和10 min时从乳化液底部吸取100 μL,使用4.9 mL的0.1%(体积分数)的SDS稀释混匀后,于500 nm测定吸光值,以0.1%的SDS溶液为空白。根据公式(2)、公式(3)计算乳化性(emulsifying activity index,EAI)及乳化稳定性(ESI)。
(2)
式中:N,稀释倍数;A0,均质0 min的吸光度值;ρ,蛋白质的质量浓度,g/mL;φ,溶液中加入油的体积比。
(3)
式中:A0,均质0 min的吸光度值;A10,均质10 min的吸光度值。
1.3.5 流变特性测定
根据PEYRANO等[17]的测定方法并略作改动。取1 mL变性前样品溶液置于流变仪的40 mm平行板夹具上,除去气泡,于样品边缘滴加硅油后进行动态温度测定。扫描条件:扫描频率1 Hz,应变幅度1%,温度以5 ℃/min从25 ℃升至90 ℃保持30 min后,再降至25 ℃,记录样品的储存模量G′和损耗角tanδ随温度变化的趋势。
1.3.6 扫描电镜测定
参照张诗佳等[18]方法,将1.3.1节所制冻干样品置于已固定导电胶的样品台上,进行离子溅射喷金处理后,移至扫描电镜样品仓进行观察,于10 kV电压下对其进行观察(200倍)。
1.3.7 激光共聚焦测定
根据LI等[19]的测定方法并略作改动。通过1%的Nile Red和1% Nile Blue[1∶1(体积比)]进行染色,1 mL样品滴加20 μL染液,混匀后取10 μL到载玻片上,并覆盖盖玻片,除去气泡后置于载物台上,使用20×目镜在488 nm与633 nm激发光波长下采集图像。
1.3.8 统计分析
试验数据采用SPSS statistics 25进行显著性分析,运用Excel 2019进行统计分析,利用Origin 8.5软件作图,每组试验平行3次。
2 结果与分析
2.1 质构特性分析
质构检测中的硬度、弹性、胶黏性及内聚性通常是凝胶网络结构的表现,在一定程度上反应了凝胶网络结构的完整性和强度[20]。不同EWP/黄油比例下复合凝胶的质构分析如表1所示,随着黄油浓度的增加,复合凝胶的硬度及胶黏性逐渐增大,弹性及内聚性均呈现先增大后减小的趋势,且在EWP/黄油质量比为1∶3时复合凝胶的弹性及内聚性均达到了最大值(P<0.05),此时混合凝胶的组织状态细腻无气孔;当EWP/黄油质量比达到1∶4及1∶5时,复合凝胶弹性及内聚性下降(P<0.05),这表明在热处理过程中蛋白受热聚集,乳化后的油脂分子填补至蛋白凝胶网络的孔隙中,使其网络结构更加紧密,从而影响复合凝胶的质构特性。此外经热变性后蛋白质分子充分暴露,导致疏水基团暴露,氢键和疏水键发生相互作用促进凝胶网络结构的增强,其弹性和内聚性也随之增强。但当黄油达到一定量时,部分黄油填充复合凝胶的孔隙提高了凝胶强度,剩余部分乳化后的黄油会破坏蛋白质的结构导致弹性及内聚性减弱,相关研究也表明,添加预乳化后的油脂更有助于凝胶结构的形成[21]。
表1 不同比例EWP/黄油对复合凝胶质构的影响
Table 1 Effects of different proportions of EWP/butter on the texture of the composite gel
EWP∶黄油(质量比)硬度/g弹性胶黏性/g内聚性1∶0143.30±9.70f0.87±0.02e49.65±2.21f0.35±0.021d1∶1352.67±12.69e0.91±0.01d125.82±7.16e0.36±0.008d1∶2656.15±18.23d0.95±0.00bc267.486±13.68d0.41±0.008c1∶3951.92±40.41c0.98±0.01a439.66±18.79c0.46±0.010a1∶41 247.25±41.22b0.96±0.01b535.97±11.08b0.43±0.007b1∶51 758.13±30.81a0.94±0.03c760.53±33.24a0.42±0.006bc
注:以上数据采用平均值±标准差表示;同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.2 持水性分析
持水性作为凝胶的重要指标之一,在一定程度上反映了复合凝胶的水合程度。在凝胶化过程中,蛋白质的高级结构因热变性松动,分子交联形成三维网络结构,从而捕获复合凝胶中的自由水,使其具有一定的持水性[22]。不同比例下EWP/黄油复合凝胶的持水性如图1所示。随着黄油浓度的增加,复合凝胶的持水性呈现先逐渐增大后趋于平缓的趋势(P<0.05)。EWP/黄油复合凝胶相较未添加黄油的蛋清蛋白凝胶而言,因蛋白质与脂质经均质剪切作用被束缚在凝胶网络结构中,持水性得到显著增高(P<0.05),当EWP/黄油质量比为1∶3时,与对照组相比,持水性增至(67.84±1.73)%,这是因为随着黄油浓度的增加,更多油滴排列在复合凝胶网络中,两亲性的蛋白吸附在油水界面的同时暴露了疏水区域并与油滴和蛋白分子反应,这一过程使蛋白质的极性氨基酸残基被暴露,并通过氢键与蛋白质分子和水分子水合,因此持水性增大,其凝胶硬度也随之增加。当EWP/黄油质量比为1∶4及1∶5时差异不显著(P>0.05),此外当EWP/黄油质量比设置为1∶6时,因油脂过多未能形成凝胶状外观及形态,故后续试验不以其作为研究对象。
图1 不同EWP/黄油比例的复合凝胶持水性
Fig.1 WHC of blended gels with different EWP/butter ratios
2.3 乳化性及乳化稳定性分析
蛋白质分子具有乳化剂的特征结构,即“两亲”结构,是食品的重要表面活性物质,其乳化特性表征了蛋白质吸收至油水界面的能力[23]。图2为复合凝胶的EAI及ESI情况,与未处理组相比,复合凝胶的EAI和ESI均得到显著提高(P<0.05),同时随着二者比例的增加呈现先增加后下降的趋势,此结果与质构特性结果趋于一致,且当EWP/黄油质量比为1∶3时,EAI和ESI达到了最大值,分别从(40.74±1.66) m2/g增加至(89.87±2.36) m2/g,从(36.85±1.99)%增加至(65.97±1.51)%,表明适量油脂的添加显著改善复合凝胶的乳化特性。其原因为热处理后被包埋在蛋白质内部的疏水性残基暴露,蛋白质在油水界面的吸附能力增加,从而形成致密且具有黏弹性的蛋白质膜,防止油滴聚集及其乳化状态被破坏,有效截留了水分,形成了更稳定的乳化液。此外黄油和EWP均具有乳化特性,二者结合复配制得的复合凝胶也具有乳化特性,杨淼等[24]研究表明适当的油相比例可以改善大豆分离蛋白的凝胶持水性和乳化特性,这与本研究结果相似。
图2 不同EWP/黄油比例的复合凝胶EAI及ESI
Fig.2 Composite gel emulsification and emulsification stability with different EWP/EG ratios
2.4 流变特性分析
凝胶形成过程可以通过动态流变学中的参数储存模量(G′)及损耗因子(tanδ)了解,G′表示凝胶网络结构的弹性性能,也代表其凝胶强度,tanδ反映复合凝胶加热过程中的整体网络结构。EWP/黄油复合凝胶的G′温度扫描结果如图3-a所示。空白组及不同比例下的复合凝胶变化趋势一致,在升温阶段前期,蛋白质分子未完全变性,G′随着温度升高而降低;随着加热温度到达凝胶点,G′急剧升高,这是因为蛋白质受热变性形成凝胶网络结构,凝胶体系由液体转向固体,此时凝胶体系蛋白质结构充分展开,疏水基团暴露且蛋白质分子间相互作用发生交联聚集从而形成凝胶[25]。在恒温阶段,G′随温度扫描稳步上升,尤其是EWP-黄油质量比为1∶1、1∶3、1∶4时较为明显,可能是由于未变性蛋白开始变性,即随着温度升高,蛋白质和油脂作为活性填充剂的作用强化了凝胶网络结构。随着扫描温度降低,复合凝胶的G′持续增大,尤其是质量比为1∶3时的G′最大,质量比为1∶5时次之,此时蛋白分子间的氢键导致凝胶网络分子运动性下降,且形成的凝胶网络愈加稳定,蛋白质交联趋向完成状态。
a-G′;b-tanδ
图3 不同EWP/黄油比例对复合凝胶G′和tanδ流变特性的影响
Fig.3 Effect of different EWP/butter ratios on the rheological properties of mixed gels, G′ and tanδ
EWP/黄油复合凝胶的损耗因子(tanδ)温度扫描结果如图3-b所示,空白组及不同比例下的复合凝胶变化趋势一致。在升温阶段,tanδ先随温度升高小幅度降低,随后急剧下降,表明蛋白在升温过程中构象发生转变,固体性质增强,流体性质减弱;恒温阶段的凝胶体系由溶胶转变为弹性半固体;降温过程中,EWP/黄油质量比为1∶3时的tanδ(0.165)最低,表明复合体系具有较好的凝胶结构,可能是因为油脂和蛋白的相互交联导致凝胶网络结构的增强。
2.5 扫描电镜分析
为能够更直观地表征复合凝胶的结构,使用扫描电镜对其进行观察。图4为扫描电镜在200倍下的扫描结果。图4-a为未添加黄油的EWP凝胶,其凝胶结构孔洞多且不均匀,图4-b～图4-f为添加黄油后的复合凝胶,其网络结构相对致密均匀,说明乳化后的油脂充当活性填充物的作用被包裹在蛋白质中,增强了复合凝胶的网络结构,结合持水性及凝胶强度结果分析,乳化后的油脂还促进了EWP分子间的交联和聚集及与蛋白质之间的相互促进作用。当EWP/黄油质量比为1∶3时,复合凝胶的网络结构最为均匀紧凑,基本看不到孔洞,这是因为在热变性过程中EWP分子疏水基团暴露,蛋白质和油脂间相互作用力增强,形成致密的蛋白质膜,显著改变且形成较致密的凝胶网络结构,凝胶强度和持水性也因此得到改善。当EWP/黄油质量比为1∶4和1∶5时导致复合凝胶结构开始出现孔隙,主要是过量的油脂不能完全被蛋白质包裹,增大了空间位阻,导致凝胶网络孔隙变大,致密程度减小。此结果与凝胶强度、乳化特性及持水性一致,在一定程度上与XU等[26]的研究相符。因此添加适当黄油能显著改变蛋清蛋白的网络结构,且影响其凝胶特性。
a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5
图4 不同EWP/黄油比例的扫描电镜图
Fig.4 SEM plots of different EWP/butter ratios
2.6 激光共聚焦分析
采用激光共聚扫描显微镜对其结构进行表征。EWP凝胶及不同EWP/黄油比例下经热诱导制得的复合凝胶激光共聚焦结构如图5所示。
a-1∶0;b-1∶1;c-1∶2;d-1∶3;e-1∶4;f-1∶5
图5 不同EWP/黄油比例的激光共聚焦图
Fig.5 Laser confocal plots of different EWP/butter ratios
红色代表被Nile Red染色的蛋白,绿色代表被Nile Blue染色的油脂。随着黄油比例的增加,复合凝胶的颗粒及孔径逐渐增大且更均匀,当EWP/黄油质量比为1∶3时,形成了较致密均匀的网络结构,且无析水无孔隙,此结果与扫描电镜结果趋于一致,质量比为1∶4及1∶5时,过多的黄油出现了挤压变形的不规则现象,结合凝胶强度结果进一步说明添加黄油一定程度上有利于提高复配EWP形成致密均匀的凝胶网络结构。这与BEMER等[27]关于蛋白结合油脂凝胶化有利于形成致密网络结构的研究结果一致。
3 结论
本研究通过热诱导利用不同比例的EWP和黄油制备EWP/黄油复合凝胶,并探究其特性。研究结果表明EWP/黄油质量比为1∶3时,EWP/黄油复合凝胶的持水性、质构特性、乳化特性、流变特性得到显著提高,通过扫描电镜和激光共聚焦结果显示添加黄油的复合凝胶网络结构更致密均匀。综上所述,黄油在一定程度上改善了EWP的凝胶特性及乳化特性,也赋予其良好的质构特性,本文研究结果将为EWP/黄油复合凝胶在乳制品和烘焙等食品领域中的实际应用提供理论依据。
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